Qui, dimostriamo un modello di organoide in tre fasi (espansione bidimensionale [2D], stimolazione 2D, maturazione tridimensionale [3D]) che offre uno strumento promettente per la ricerca fondamentale sui tendini e un potenziale metodo senza scaffold per l'ingegneria tissutale tendinea.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Dimostrazione della coltura di fogli cellulari autoassemblati e generazione manuale di un organoide 3D simile a tendine/legamento mediante l'utilizzo di fibroblasti dermici umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tendini e legamenti (T/L) sono strutture forti organizzate gerarchicamente che uniscono il sistema muscolo-scheletrico. Questi tessuti hanno una matrice extracellulare ricca di collagene (ECM) di tipo I e cellule del lignaggio T/L posizionate principalmente in file parallele. Dopo l'infortunio, T/L richiede molto tempo per la riabilitazione con un alto rischio di fallimento e risultati di riparazione spesso insoddisfacenti. Nonostante i recenti progressi nella ricerca biologica sul T/L, una delle sfide rimanenti è che il campo T/L manca ancora di un protocollo di differenziazione standardizzato in grado di ricapitolare il processo di formazione del T/L in vitro. Ad esempio, la differenziazione ossea e grassa delle cellule precursori mesenchimali richiede solo una coltura cellulare bidimensionale (2D) standard e l'aggiunta di specifici mezzi di stimolazione. Per la differenziazione in cartilagine, è necessaria la coltura tridimensionale (3D) in pellet e l'integrazione di TGFß. Tuttavia, la differenziazione cellulare al tendine necessita di un modello di coltura 3D molto ordinato, che idealmente dovrebbe essere anche soggetto a stimolazione meccanica dinamica. Abbiamo stabilito un modello di organoide in 3 fasi (espansione, stimolazione e maturazione) per formare una struttura 3D simile a un bastoncino da un foglio cellulare autoassemblato, che fornisce un microambiente naturale con i propri fattori ECM, autocrini e paracrini. Questi organoidi a bastoncino hanno un'architettura cellulare multistrato all'interno di una ricca ECM e possono essere maneggiati abbastanza facilmente per l'esposizione a sollecitazioni meccaniche statiche. Qui, abbiamo dimostrato il protocollo in 3 fasi utilizzando fibroblasti dermici disponibili in commercio. Abbiamo potuto dimostrare che questo tipo di cellula forma organoidi robusti e abbondanti nella ECM. La procedura descritta può essere ulteriormente ottimizzata in termini di terreni di coltura e ottimizzata verso la stimolazione meccanica assiale dinamica. Allo stesso modo, le fonti cellulari alternative possono essere testate per il loro potenziale di formare organoidi T/L e quindi subire la differenziazione T/L. In sintesi, l'approccio consolidato degli organoidi T/L 3D può essere utilizzato come modello per la ricerca di base sui tendini e persino per l'ingegneria T/L senza scaffold.
Introduzione
Tendini e legamenti (T/L) sono componenti vitali del sistema muscolo-scheletrico che forniscono supporto e stabilità essenziali al corpo. Nonostante il loro ruolo critico, questi tessuti connettivi sono soggetti a degenerazione e lesioni, causando dolore e compromissione della mobilità1. Inoltre, il loro limitato apporto di sangue e la lenta capacità di guarigione possono portare a lesioni croniche, mentre fattori come l'invecchiamento, il movimento ripetitivo e la riabilitazione impropria aumentano ulteriormente il rischio di degenerazione e lesioni2. I trattamenti convenzionali, come il riposo, la terapia fisica e gli ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutte le fasi devono essere eseguite utilizzando tecniche asettiche.
1. Coltura e pre-espansione dei NHDF
- Scongelare rapidamente la crio-fiala contenente fibroblasti dermici umani normali adulti crioconservati (NHDF, 1 x 106 cellule) a 37 °C fino a quando non si scongelano quasi.
- Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di crescita dei fibroblasti preriscaldato 2 (kit pronto all'uso che include terreno basale, siero fetale di vitello al 2% (FCS), fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) e insulina) integrato con penicillina/streptomicina all'1% (penna/streptococco) (terreno NHDF), ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il modello di organoide 3D T/L è stato precedentemente stabilito e dimostrato qui implementando NHDF acquistato commercialmente (n=3, 3 organoidi per donatore, NHDF sono stati utilizzati nei passaggi 5-8). Il flusso di lavoro del modello è riepilogato nella Figura 1. La Figura 2 mostra immagini rappresentative a contrasto di fase della coltura NHDF durante la pre-espansione in fiasche T-75 (Figura 2A) e all'inizio e dopo 5 giorni di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I risultati dimostrati in questo studio forniscono preziose informazioni sulla creazione e la caratterizzazione del modello di organoide 3D NHDF per lo studio dei tessuti T/L. Il protocollo in 3 fasi ha portato alla formazione di organoidi 3D simili a bastoncelli che presentano caratteristiche tipiche della nicchia T/L. Questo modello è stato precedentemente riportato in Kroner-Weigl et al. 20237 e dimostrato in modo molto dettagliato qui.
Le immagini a contras.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
D.D. e S.M.-D. riconoscere la sovvenzione BMBF "CellWiTaL: sistemi cellulari riproducibili per la ricerca farmacologica - stampa laser senza strato di trasferimento di singole cellule altamente specifiche in strutture cellulari tridimensionali" Proposta n. 13N15874. D.D. e V.R.A. riconoscono la sovvenzione EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Formazione olistica delle ricerche sull'osteoartrite di nuova generazione" GA Nr. 101034412. Tutti gli autori ringraziano la signora Beate Geyer per l'assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido ascorbico | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | A8960 | |
| Piatto per coltura cellulare aderente da 10 cm | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | ||
| Capsula di Petri non aderente da 10 cm | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | ||
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Paesi Bassi | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Paesi Bassi | 4557 | |
| D(+)-Saccarosio | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germania | A2211 | |
| DMEM alto glucosio medio | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germania | DMEM-HA | |
| DMEM a basso contenuto di glucosio | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germania | DMEM-LPXA | |
| Siero fetale bovino | Anprotec, Bruckberg, Germania | AC-SM-0027 | |
| Terreno di coltura dei fibroblasti 2 | PromoCell, Heidelberg, Germania | C-23020 | |
| H& Kit di colorazione E | Abcam | ab245880 | |
| Microscopio invertito con fotocamera ad alta risoluzione | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer con Axiocam 506 |
| MEM amminoacidi | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germania | Perni metallici NEAA-B | |
| EntoSphinx, Pardubice, Repubblica Ceca | 04.31 | ||
| Fibroblasti dermici umani normali | PromoCell, Heidelberg, Germania | C-12302 | |
| Paraformaldeide | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | A3813 | |
| Penicillina/streptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania | 15140122 | |
| Soluzione salina tampone fosfato | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | P4417 | |
| TGFß 3 | R& D Systems, Wiesbaden, Germania | 8420-B3 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germania | PROVA-1B |
Riferimenti
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
