Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplexed levende cellebilleddannelse til lægemiddelrespons i patientafledte organoidmodeller af kræft

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66072
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1,4, 1, 1, 5, 6, 3, 1,7
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa
* These authors contributed equally

Summary

Patientafledte tumororganoider er et sofistikeret modelsystem til grundlæggende og translationel forskning. Denne metodeartikel beskriver brugen af multiplekset fluorescerende levende cellebilleddannelse til samtidig kinetisk vurdering af forskellige organoide fænotyper.

Abstract

Patientafledte organoidmodeller (BOB) af kræft er et multifunktionelt forskningssystem, der bedre rekapitulerer menneskelig sygdom sammenlignet med kræftcellelinjer. BOB-modeller kan genereres ved at dyrke patientens tumorceller i ekstracellulære kældermembranekstrakter (BME) og plettere dem som tredimensionelle kupler. Imidlertid er kommercielt tilgængelige reagenser, der er optimeret til fænotypiske assays i enkeltlagskulturer, ofte ikke kompatible med BME. Heri beskriver vi en metode til plade af BOB-modeller og vurdering af lægemiddeleffekter ved hjælp af et automatiseret live-cell imaging system. Derudover anvender vi fluorescerende farvestoffer, der er kompatible med kinetiske målinger for at kvantificere cellesundhed og apoptose samtidigt. Billedoptagelse kan tilpasses til at forekomme med regelmæssige tidsintervaller over flere dage. Brugere kan analysere lægemiddeleffekter i individuelle Z-planbilleder eller en Z-projektion af serielle billeder fra flere brændplaner. Ved hjælp af maskering beregnes specifikke parametre af interesse, såsom BOB-nummer, areal og fluorescensintensitet. Vi leverer proof-of-concept-data, der viser effekten af cytotoksiske midler på cellesundhed, apoptose og levedygtighed. Denne automatiserede kinetiske billeddannelsesplatform kan udvides til andre fænotypiske aflæsninger for at forstå forskellige terapeutiske virkninger i BOB-modeller af kræft.

Introduction

Patientafledte tumororganoider (PDO'er) dukker hurtigt op som et robust modelsystem til at studere kræftudvikling og terapeutiske reaktioner. PDO'er er tredimensionelle (3D) cellekultursystemer, der rekapitulerer den komplekse genomiske profil og arkitektur af den primære tumor 1,2. I modsætning til traditionelle todimensionelle (2D) kulturer af udødeliggjorte kræftcellelinjer fanger og opretholder BDO'er intratumoral heterogenitet 3,4, hvilket gør dem til et værdifuldt værktøj til både mekanistisk og translationel forskning. Selv om BOB'er bliver et stadig mere populært modelsystem, er kommercielt tilgængelige reagenser og analysemetoder til cellulære virkninger, der er kompatible med BOB-kulturer, begrænsede.

Manglen på robuste metoder til at analysere subtile ændringer i behandlingsrespons hindrer klinisk oversættelse. Guldstandarden cellesundhedsreagens i 3D-kulturer, CellTiter-Glo 3D, bruger ATP-niveauer som en determinant for cellelevedygtighed 5,6. Selvom dette reagens er nyttigt til endpoint-assays, er der flere forbehold, især manglende evne til at anvende prøver til andre formål efter afslutning af assayet.

Levende cellebilleddannelse er en sofistikeret form for kinetisk mikroskopi, der, når den kombineres med fluorescerende reagenser, har kapacitet til at kvantificere en række cellesundhedsaflæsninger inden for BOB-modeller, herunder apoptose 7,8,9 og cytotoksicitet10. Faktisk har levende cellebilleddannelse været integreret i screening med høj gennemstrømning af forbindelser i 2D-platforme 11,12. Systemer som Incucyte har gjort teknologien overkommelig og dermed tilgængelig for forskergrupper i en række forskellige indstillinger. Imidlertid er anvendelsen af disse systemer til analyse af 3D-kulturer stadig i sin barndom.

Heri beskriver vi en metode til at vurdere lægemiddelrespons i BOB-modeller af kræft ved hjælp af multiplekset levende cellebilleddannelse (figur 1). Gennem analyse af lyse feltbilleder kan ændringer i BOB-størrelse og morfologi kinetisk overvåges. Desuden kan cellulære processer samtidig kvantificeres over tid ved anvendelse af fluorescerende reagenser, såsom Annexin V Red Dye til apoptose og Cytotox Green Dye til cytotoksicitet. De præsenterede metoder er optimeret til Cytation 5 live-cellebilleddannelsessystemet, men denne protokol kan tilpasses på tværs af forskellige live-cellebilleddannelsesplatforme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelser ved hjælp af humane tumorprøver blev gennemgået og godkendt af University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protokol # 201809807, og udført i overensstemmelse med de etiske standarder som fastlagt i Helsingfors-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle forsøgspersoner, der deltog i undersøgelsen. Inklusionskriterier omfatter en diagnose af kræft og tilgængeligheden af tumorprøver.

1. Plating intakte BOB'er i en 96-brønds plade

  1. Forbered reagenser.
    1. Forvarm pladerne med 96 brønde ved 37 °C natten over, og optø BME natten over ved 4 °C.
    2. Forbered fuld organoid kultur medier optimeret til dyrkning af kræft type interesse. Specifikke kulturmedier, der anvendes til forsøg, der er vist heri, er angivet i supplerende tabel 1.
      BEMÆRK: Mediekomponenter skal muligvis ændres til forskellige tumortyper. For eksempel suppleres organoidkulturmediet med 100 nM østradiol til gynækologiske tumorer13. Tilberedte medier er stabile ved 4 °C i 1 måned. Ved langtidsopbevaring alikvote mediet i 50 ml reagensglas og opbevares ved -20 °C.
  2. Der fremstilles to separate prøver af organoidkulturmedier ved 4 °C og 37 °C. For eksempel, hvis 60 brønde belægges i en 96-brøndplade, skal du bruge 6 ml varme organoidkulturmedier og 150 μL iskolde organoidkulturmedier.
  3. Forbered organoid vaskebuffer: Suppler 1x PBS med 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA og 10 μM Y-27632. Opbevares ved 4 °C
  4. Høst BOB'er dyrket i en tallerken med 24 brønde. Udfør alle trin på is eller ved 4 °C, medmindre andet er angivet.
    1. Opsug medier fra hver brønd ved hjælp af et vakuumledningssystem.
    2. Tilsæt 500 μL iskold organoid vaskebuffer og pipette forsigtigt 2-3x ved hjælp af en 1000 μL pipettor. Inkuber pladen på is i 10 min.
    3. Overfør indholdet af hvert hul til et 50 ml konisk rør. For at sikre, at alle BOB'erne er suspenderet, skylles hvert hul med yderligere 300 μL organoid vaskebuffer og overføres til det 50 ml koniske rør. Der centrifugeres i 5 minutter ved 350 x g ved 4 °C
    4. Supernatanten suges ud af BME/organoidpellet ved hjælp af et vakuumledningssystem, således at ~ 5 ml forbliver i røret. Tilsæt 20 ml organoid vaskebuffer og resuspender forsigtigt pelleten ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Inkuber på is i 10 min.
    5. Der centrifugeres i 5 minutter ved 350 x g ved 4 °C. Supernatanten suges til med et vakuumlinjesystem, idet man sørger for ikke at forstyrre BOB-pelletsen.
  5. Plating af BOB'er i en plade med 96 brønde: Udfør alle trin på isen, medmindre andet er angivet.
    1. BOB-pillen resuspenderes i en passende mængde iskolde organoidkulturmedier for at skabe en BOB-suspension. Overfør BOB-suspension til et iskoldt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: For at beregne mængden af organoidkulturmedier bestemmes antallet af brønde, der skal belægges i en 96-brøndplade, idet der tages hensyn til, at BDO'er er belagt i en 5 μL kuppel i forholdet 1: 1 mellem organoidkulturmedier og BME. For eksempel, når der pletteres en 96-brøndplade og kun bruger de indre 60 huller, vil den samlede mængde BOB-suspension, der er nødvendig, være 300 μL: 150 μL organoidkulturmedier og 150 μL BME. For modeller, der udviser optimal vækst ved forskellige procentdele af BME, kan forholdet mellem BME: medier ændres i dette trin, selvom det er vigtigt at standardisere forholdet på tværs af alle assays for hver specifik model. For at tage højde for pipetteringsfejl skal du tilføje 10% volumen til hver komponent.
    2. Tæl antallet af BDO'er.
      1. 2,5 μL af BOB-suspensionen overføres til et iskoldt 1,5 ml mikrocentrifugerør og blandes med 2,5 μL BME. Overfør 5 μL blandingen til et rent glasmikroskopglas. Dæk ikke diaset til. Blandingen størkner til en kuppel.
      2. Visualiser ved hjælp af et lyst feltmikroskop ved 4x. Antallet af BOB'er i 5 μL-blandingen tælles. Målet er at have ca. 25-50 PDO'er pr. 5 μL kuppel.
        BEMÆRK: Hvis den ønskede massefylde ikke opnås i testblandingen, justeres det endelige volumen af BOB-suspensionen enten ved tilsætning af flere organoidkulturmedier eller centrifugering af BOB-suspensionen og resuspension af BOB-pelleten i et mindre volumen iskolde organoidkulturmedier. Uanset hvordan BOB-suspensionen ændres i dette trin, er det endelige forhold mellem BME: BOB-suspension i trin 1.5.3. skal være 1:1.
    3. Brug en 200 μL pipetter med brede borespidser til forsigtigt at blande BOB-suspension med en lige så stor mængde BME for at opnå et forhold på 1:1 mellem organoidkulturmedier og BME. Undgå bobler, som vil forstyrre kuplernes integritet.
    4. Ved hjælp af en 20 μL pipetter sås 5 μL kupler i midten af hver brønd i en forvarmet 96-brøndplade, idet der kun sås de indre 60 brønde. For at sikre en ligelig fordeling af BOB'erne pipetteres indholdet af 1,5 ml røret regelmæssigt med en 200 μL pipetter med spidser med bred boring.
    5. Når alle brønde er blevet podet, skal du placere låget på pladen og forsigtigt vende. Den omvendte plade inkuberes ved 37 °C i 20 minutter i vævskulturkuvøsen for at lade kuplerne størkne.
      BEMÆRK: Invertering af pladen sikrer, at BME / organoid kulturmediekuppel bevarer 3D-strukturen for at give tilstrækkelig plads til BOB-dannelse.
    6. Vend pladen, så den sidder med låget opad, og inkuber den i 5 minutter ved 37 °C.

2. Behandlinger og tilsætning af fluorescerende farvestoffer til multiplexing

  1. Mens BME-kupler størkner i pladerne med 96 brønde, skal du forberede fortyndinger af fluorescerende levende cellebilleddannelsesreagenser. Specifikke parametre for multiplexing af Annexin V Red Dye og Cytotox Green Dye er angivet heri.
  2. Fluorescerende reagenspræparat (dag -1): Beregn det passende volumen organoidkulturmedier baseret på antallet af huller, der skal behandles, idet det antages, at hvert hul behandles med 100 μL farvestofdoserede medier. Fortynd farvestof i forvarmede organoidkulturmedier til den ønskede koncentration.
    BEMÆRK: Den samlede mængde medier, der er nødvendige, varierer afhængigt af eksperimentet. Tilføj 10% til den endelige diskenhed for at tage højde for pipetteringsfejl. For eksempel, for at behandle de indre 60 brønde i en 96-brøndplade, fremstilles 6,6 ml farvestofdoserede medier (tabel 1).
  3. Behandl hver brønd med 100 μL 2x farvestofdoserede organoidkulturmedier. Der tilsættes 200 μL steril 1x PBS til pladens ydre tomme huller. Der inkuberes ved 37 °C natten over.
    BEMÆRK: PBS i de perifere brønde reducerer fordampningen af medier fra de indre brønde.
  4. Tilsætning af lægemidler/behandlingsmidler (dag 0): Tilbered lægemidler i forvarmede organoidkulturmedier i en koncentration på 2x i et volumen på 100 μL pr. Brønd.
    BEMÆRK: DMSO kan være giftigt for celler i høje koncentrationer. En koncentration på 0,1% DMSO overskrides ikke i eksperimenterne udført i denne undersøgelse. Ud over lægemidler fordeles nogle fluorescerende reagenser som en DMSO-opløsning. Det er vigtigt at tage højde for den samlede DMSO-koncentration, når man arbejder med sådanne reagenser.
  5. Der tilsættes 100 μL 2x farvestofdoserede medier til hvert hul; Undgå at skabe bobler.

3. Opsætning af billedparametre

  1. Pladen anbringes i Cytation 5. Åben Gen5-software. Klik på Ny opgave > Imager manuel tilstand. Vælg Optag nu, og indtast følgende indstillinger: Målsætning (vælg ønsket forstørrelse); Filter (vælg mikroplade); Mikropladeformat (vælg antal brønde); og Fartøjstype (vælg pladetype). Klik på Brug låg og Brug langsommere bærehastighed. Klik på OK.
    BEMÆRK: Beholdertype: Vær så specifik som muligt, når du vælger oplysninger om pladen, da softwaren er kalibreret til den specifikke afstand fra målet til bunden af pladen for hver pladetype og tykkelse af plasten.
    Langsommere bærehastighed: Vælg dette felt for at undgå at forstyrre kuplerne ved isætning/losning af plader.
  2. Opret en Z-Stack, der vil afbilde hele BME-kuplen.
    1. Vælg et felt af interesse, der skal vises (venstre panel under histogrammet).
    2. Vælg kanalen Lyst felt (venstre panel, øverst). Klik på Vis automatisk, og juster Indstillinger efter behov.
    3. Indstil bunden og toppen af Z-Stack: Udvid fanen Billedtilstand (venstre panel, midten). Marker afkrydsningsfeltet Z-Stack . Brug banejusteringspilene (venstre panel, midten) til at klikke på nedjusteringen, indtil alle PDO'er er kommet ind og derefter ude af fokus og er uklare. Indstil dette som bunden af Z-Stack. Gentag i modsat retning ved hjælp af kursjusteringspilene for at indstille toppen af Z-stakken.
    4. For at sikre, at Z-Stack-indstillingerne passer til andre brønde af interesse, skal du vælge en anden brønd (venstre panel under histogrammet) og visualisere toppen og bunden af Z-stakken.
    5. For manuelt at indtaste fokuspositionerne skal du klikke på de tre prikker ved siden af finjusteringen (venstre panel, øverst). Et vindue åbnes; Indtast den øverste Z-Stack-værdi (findes i venstre panel, midten, under Billedbehandlingstilstand). Gentag for den nederste Z-Stack-værdi. Juster efter behov for at registrere det ønskede Z-område ved at gentage trin 3.2.3. Hvis justeringer var nødvendige, skal du vælge en anden brønd for at bekræfte indstillingerne.
  3. Indstil eksponeringsindstillingerne for den eller de fluorescerende kanaler. Indstillinger er beskrevet for to lysstofrør (GFP & TRITC). Det specifikke antal fluorescerende kanaler afhænger af eksperimentet, og hvilke fluorescerende terninger der er installeret i live-cellebilleddannelsessystemet.
    BEMÆRK: Hvis signalintensiteten forventes at være betydeligt højere ved eksperimentets afslutning, bør brugerne overveje at udføre testeksperimenter for at bestemme de optimale eksponeringsindstillinger ved eksperimentets afslutning, som derefter kan anvendes ved opsætning af startparametrene.
    1. Udvid fanen Billedtilstand (venstre panel, midten), og åbn Rediger billedbehandlingstrin. Et pop op-vindue vises.
    2. Under Kanaler skal du klikke på boblen for det ønskede antal kanaler. Angiv en kanal til lyst felt og yderligere kanaler for hver fluorescerende kanal. I dette eksempel er kanal 1 = lyst felt; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Brug rullemenuerne Farve til at vælge den relevante indstilling for hver kanal. Luk redigeringsvinduet ved at klikke på OK.
    3. Opsæt hver fluorescerende kanal.
      1. Skift kanal til GFP (venstre panel, øverst).
      2. Klik på Automatisk eksponering (venstre panel, øverst). Udvid fanen Eksponering (venstre panel, midten), og juster eksponeringsindstillingerne for at minimere baggrundssignalet.
      3. Kopiér eksponeringsindstillinger til fanen Billedtilstand ved at følge trin 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Klik på ikonet Kopier ved siden af feltet Rediger billedbehandlingstrin . Klik på Rediger billedbehandlingstrin, som åbner et andet vindue.
      5. Under GFP-kanalen skal du klikke på ikonet Udklipsholder i eksponeringslinjen for at tilføje indstillingerne Belysning, Integrationstid og Kameraforstærkning til kanalen.
      6. Gentag trin 3.3.3.4-3.3.3.5 for TRITC-kanalen. Klik på OK for at lukke vinduet.
  4. Konfigurer billedforbehandlingen og Z-projektionstrinnene for at automatisere billedforbehandling.
    1. Klik på kameraikonet (venstre panel, nederste hjørne). Et nyt vindue åbnes.
    2. Under Tilføj behandlingstrin (venstre panel, nederst) skal du klikke på Billedforbehandling. Et nyt vindue åbnes.
    3. På fanen Lyst felt skal du fravælge Anvend billedforbehandling.
    4. For hver fane Fluorescerende kanal skal du sørge for, at Anvend billedforbehandling er valgt. Fravælg Brug samme indstillinger som kanal 1 , og klik på OK. Vinduet lukkes.
    5. Under Tilføj behandlingstrin skal du klikke på Z-projektion. Et nyt vindue åbnes. Hvis det ønskes, kan du justere udsnitsområdet (f.eks. for at indsnævre Z-området). Luk vinduet ved at vælge OK.
  5. Opret protokol.
    1. Klik på Billedsæt på værktøjslinjen. I rullemenuen skal du klikke på Opret eksperiment ud fra dette billedsæt. Billedbehandlingsvinduet lukkes, og procedurevinduet åbnes.
      BEMÆRK: De parametre, der er valgt i Imager Manual Mode , indlæses automatisk i det nye vindue, hvorved der kan oprettes en eksperimentel protokol.
    2. Indstil temperatur og farveforløb: Klik på Indstil temperatur under overskriften Handlinger (venstre). Et nyt vindue åbnes. Vælg Inkubator Til, og indtast manuelt den ønskede temperatur under Temperatur. Indtast derefter 1 manuelt under Gradient. Luk vinduet ved at vælge OK.
      BEMÆRK: Oprettelse af en gradient på 1 °C forhindrer, at der dannes kondens på pladens låg.
    3. Angiv brønde til billedet.
      1. Dobbeltklik på billedtrinnet under Beskrivelse. Klik på Fuld plade (højre hjørne, øverst). Dette åbner vinduet Pladelayout .
      2. Fremhæv brønde af interesse ved hjælp af markøren. Klik på OK. Hvis det ønskes, skal du markere afkrydsningsfelterne Autofocus Binning og Capture Binning . Klik på OK for at lukke vinduet.
        BEMÆRK: Binning kræver justering af eksponeringen, som beskrevet i trin 3.3.3.2 ovenfor. Se afsnittet Diskussion for specifikke scenarier, hvor denne funktion kan bruges.
    4. Indstil intervaller for kinetisk billeddannelse.
      1. Klik på Indstillinger under overskriften Andet (venstre). Markér afkrydsningsfeltet Diskontinuerlig kinetisk procedure .
      2. Under Anslået samlet tid skal du angive kørselstiden for eksperimentet (f.eks. 5 dage). Under Anslået interval skal du indtaste intervallet for at afbilde pladen (f.eks. hver 6. time).
      3. Klik på Pause efter hver kørsel for at give tid til, at pladen kan overføres til inkubatoren. Luk vinduet ved at vælge OK.
    5. Opdater trin til reduktion af data.
      1. Klik på OK for at lukke vinduet Procedure. Der åbnes en fane for at opdatere datareduktionstrin. Vælg Ja. Dobbeltklik på billedforbehandling. Klik gennem de forskellige kanaler for at bekræfte indstillingerne, og klik på OK.
      2. Dobbeltklik på Z-projektion. Klik gennem de forskellige kanaler for at bekræfte indstillingerne. Klik på OK. Klik derefter på OK igen for at lukke datareduktionsvinduet.
    6. Formatere pladelayoutet.
      1. Åbn guiden Pladelayout, og angiv brøndtyper ved at følge trin 3.6.2-3.6.3.
      2. Klik på ikonet Pladelayout i værktøjslinjen (venstre hjørne, øverst) for at åbne guiden Pladelayout.
      3. Markér afkrydsningsfelterne ud for de brøndtyper, der bruges i eksperimentet. Angiv antallet af forskellige kontrolelementtyper under Assay Controls ved hjælp af pilene. Klik på Næste for at åbne vinduet Assay Control #1 .
      4. Indstil betingelserne for analysekontrolbrønden ved at følge trin 3.6.5-3.6.8.
      5. I vinduet Assay Control #1 skal du angive kontroletiketten i feltet Pladelayout-id . Indtast eventuelt det fulde navn i det tilstødende felt. Vælg antallet af replikater for den respektive kontrolbetingelse ved hjælp af pilene.
      6. Hvis du bruger flere koncentrationer eller en fortyndingsserie i kontrolelementet, skal du klikke på Definer fortyndinger/koncentrationer og bruge rullemenuen til at vælge Type. Indtast værdier for hver koncentration/fortynding i tabellen.
        BEMÆRK: Autofunktionen kan bruges, hvis koncentrationerne ændres med en ensartet stigning.
      7. Vælg fanen Farve på værktøjslinjen. Vælg den ønskede tekstfarve og baggrundsfarve til kontrol i rullemenuen. Klik på Næste.
      8. Gentag efter behov med yderligere kontroller.
      9. Indstil prøvebrøndens betingelser i henhold til 3.6.10-3.6.12.
      10. På siden Eksempelopsætning skal du angive eksempel-id-præfikset (f.eks. SPL). Vælg antallet af replikater ved hjælp af pilene. Hvis du bruger prøver med varierende behandlingskoncentrationer, skal du vælge Koncentrationer eller Fortyndinger i rullemenuen Type . Indtast fortyndinger/koncentrationer i tabellen, og indtast enheder i feltet Enhed .
      11. Vælg Identifikationsfelter på værktøjslinjen. Indtast de (t) ønskede kategorinavn(e) (f.eks. prøve-id, lægemiddel) i tabellen.
      12. Vælg fanen Farve på værktøjslinjen. Vælg en anden farve for hver behandlingsgruppe / prøve. Klik på Udfør. Dette åbner siden Pladelayout.
        BEMÆRK: Tallene i venstre side korrelerer med de forskellige prøvenumre.
      13. Tildel eksempel-id'er ved at følge trin 3.6.14-3.6.16.
      14. Markere SPL1 fra venstre panel. Brug markøren til at vælge brønde.
        BEMÆRK: Autoselect-værktøjer kan justeres i serietildelingsboksen. Antallet af replikater og orientering af layoutet kan forudangives.
      15. Gentag med andre prøver for at fuldføre pladelayoutet. Når du er tilfreds, skal du klikke på OK.
      16. På værktøjslinjen Filer skal du vælge Eksempel-id'er. Udfyld kolonnerne Prøve-id med de relevante oplysninger for hver prøve (f.eks. lægemiddeltype). Tryk på OK.
    7. Gem protokollen.
      1. Klik på Filer > Gem protokol som på værktøjslinjen . Vælg den placering, hvor filen skal gemmes. Indtast et filnavn. Klik på Gem for at lukke vinduet.
      2. Klik på Filer > Afslut på værktøjslinjen. En fane åbnes for at gemme ændringer i Imager manuel tilstand. Vælg Nej.
      3. Der åbnes en fane, hvor du kan gemme ændringer i eksperiment 1. Vælg Nej. Der åbnes en fane for at opdatere protokoldefinitionen. Vælg Opdater. Luk softwaren.
  6. Importer protokollen til BioSpa OnDemand, og afslut opsætningen af eksperimentet.
    1. Åbn softwaren BioSpa OnDemand (planlægningssoftware).
    2. Vælg en ledig plads i softwaren.
    3. Fjern pladen fra billeddannelsessystemet med levende celler. Klik på Åbn skuffe for at få adgang til den relevante plads i planlægningssoftwaren og indsætte pladen. Klik på Luk skuffe.
      BEMÆRK: Dette trin kan udføres når som helst, når protokollen er oprettet i trin 3.5.7 ovenfor. Pladen skal dog være i Cytation 5 for at udføre en timingkørsel i nedenstående trin 3.6.4.3.
    4. Importer protokollen.
      1. Under fanen Procedureoplysninger skal du vælge Bruger i rullemenuen. Ud for protokolpladsen skal du klikke på Vælg > Tilføj en ny post.
      2. Ud for protokolpladsen skal du klikke på Vælg. Dette åbner et nyt vindue for at navigere til den ønskede protokol i filarkitekturen. Klik på Åbn for at importere protokollen til planlægningssoftwaren.
      3. Indtast den tid, det tager at tage billeder af pladen. Klik på OK for at lukke vinduet Gen5 Protocol List .
        BEMÆRK: Dette trin er især vigtigt, når du kører flere eksperimenter ad gangen. Hvis du vil bestemme den tid, det tager at afbilde billedet, skal du klikke på Udfør en tidskørsel nu. Klik på OK.
    5. Indstil billedintervaller, og planlæg eksperimentet.
      1. Angiv det billedinterval, der er angivet i trin 3.5.4, under Interval.
      2. Under Indstillinger for starttidspunkt skal du vælge Når tilgængelig. Under Varighed skal du vælge Fast eller Kontinuerlig.
        BEMÆRK: Der kan angives et bestemt starttidspunkt i stedet for at køre protokollen på det næste tilgængelige tidspunkt. Hvis du vælger Fast varighed , indstilles et specifikt slutpunkt for eksperimentet, og brugeren skal angive en eksperimentel tidsramme. Kontinuerlig varighed gør det muligt for eksperimentet at køre uden slutpunkt og kan kun afsluttes af en bruger, der stopper eksperimentet.
      3. Klik på Planlægningsplade/fartøj. Dette åbner pladevalideringssekvensen. En fane åbnes med den foreslåede første læsetid. Klik på Ja for at acceptere denne tidsplan.

4. Billedanalyse i Gen5-software (figur 2)

  1. Åbn modulet Billedanalyse.
    1. Åbn Gen5. I Task Manager skal du vælge Eksperimenter > Åbn. Vælg eksperimentet for at åbne filen. Klik på Plade > visning på værktøjslinjen.
    2. Skift rullemenuen Data til Z-projektion. Dobbeltklik på en brønd af interesse. Vælg Analysér > Jeg vil konfigurere et nyt trin til reduktion af billedanalysedata. Klik på OK.
  2. Cellulær analyse
    1. Primær maske
      1. Under Analyseindstillinger skal du vælge Type: Cellulær analyse og detektionskanal: ZProj[Tsf[Bright Field]] (venstre panel, midten).
      2. Klik på Indstillinger. Dette åbner siden Primær maske og antal. Markér Automatisk i feltet Tærskel, og klik på Anvend. Klik på feltet Fremhæv objekter (højre panel, nederst) for at få vist objekter inden for den angivne tærskel. Juster efter behov for at medtage objekter af interesse.
        BEMÆRK: Tærskelindstillinger er baseret på pixelintensitet. For eksempel, hvis tærsklen er indstillet til 5000, vil pixels med en intensitet større end 5000 blive inkluderet i analysen.
      3. Angiv minimum- og maksimumobjektstørrelsen (μm) under Objektmarkering. Juster efter behov for at udelukke celleaffald/enkeltceller.
        BEMÆRK: BOB-størrelsen kan variere betydeligt mellem forskellige modeller og typer. Brug måleværktøjet i Gen5-softwaren til at bestemme minimums- og maksimumstærsklerne for BOB-størrelse for hver model. Brugere kan vælge en mindre minimumstærskel for BOB-størrelse i forhold til den værdi, der leveres af måleværktøjet, for at forhindre udelukkelse af BOB-fragmenter på senere tidspunkter efter lægemiddelbehandling.
      4. Hvis du vil begrænse analysen til et bestemt område i brønden, skal du fravælge Analysér hele billedet og klikke på Plug. I vinduet Billedstik skal du bruge rullemenuen til at vælge Plug-form . Juster størrelses- og positionsparametrene efter behov, så de passer til det relevante område.
        BEMÆRK: Det er vigtigt at maksimere antallet af BOB'er i stikket, samtidig med at man udelukker BOB-frie områder for at minimere baggrunden. Angiv en stikstørrelse, der konsekvent vil fange størstedelen af objekterne af interesse på tværs af replikater. Det er vigtigt at generere et stik, der også udelukker kuplens kanter, da det udelukker genstande, der kan virke forvrængede på grund af lysets brydning fra kuplens ekstreme krumning rundt om kanterne. Inkluder primære kantobjekter kan også fravælges for kun at fange hele BOB'er i stikket.
    2. Delbefolkningsanalyse. Figur 3 indeholder et eksempel på subpopulationsbetegnelse.
      1. Klik på Beregnede målinger i værktøjslinjen Cellulær analyse. Klik på Vælg, eller opret interessante metrics på objektniveau (højre hjørne, nederst). Under Tilgængelige objektmetrikker skal du vælge metrics af interesse (f.eks. cirkularitet) og klikke på knappen Indsæt. Klik på OK.
        BEMÆRK: Morfologien og densiteten af hver BOB-model bestemmer de bedste målinger af interesse for at skelne delpopulationen.
      2. Klik på Subpopulation Analysis i værktøjslinjen Cellular Analysis . Klik på Tilføj for at oprette en ny subpopulation. Et pop op-vindue åbnes.
      3. Angiv eventuelt et navn til delpopulationen. Vælg en metric af interesse under Objektmetrics, og tryk på Tilføj betingelse. I vinduet Rediger betingelse skal du angive parametre for den valgte objektmetrik. Gentag med yderligere metrics efter behov.
        BEMÆRK: Parametre kan justeres manuelt eller indstilles ved hjælp af finderværktøjet. For at udelukke snavs kan brugerne f.eks. tilføje Område som en objektmetrik og vælge objekter, der er mindre end 800. Cirkularitet som objektmetrisk bruges rutinemæssigt, og alle objekter med en cirkularitet større end 0,2-0,5 er inkluderet, afhængigt af modellen.
      4. I tabellen nederst i vinduet skal du kontrollere de ønskede resultater, der skal vises. Klik på OK > Anvend.
      5. Hvis du vil have vist objekterne i delpopulationen, skal du bruge rullemenuen Objektdetaljer (højre panel, midten) til at vælge delpopulationen. Objekter, der falder inden for parametrene, fremhæves i billedet.
        BEMÆRK: Hvis du vil ændre fremhævningsfarverne for den primære maske og underpopulation, skal du klikke på Indstillinger (højre panel, nederst).
      6. Hvis du vil justere subpopulationsparametre, skal du åbne vinduet Subpopulationsanalyse igen fra værktøjslinjen Cellulær analyse . Vælg delpopulationen, og klik på Rediger. Klik på Tilføj trin.
        BEMÆRK: Dette vil anvende den samme analyse på alle brønde i eksperimentet på alle tidspunkter. I rullemenuen på siden Matrix kan der vælges forskellige metrics til individuel visning.

5. Eksport af data fra Gen5 til Excel

  1. Hvis du vil tilpasse en datafil til eksport, skal du vælge ikonet Rapport/eksportgenerator på værktøjslinjen. I pop op-vinduet skal du klikke på Ny eksport til Excel.
  2. På siden Egenskaber i pop op-vinduet skal du vælge Omfang > Plade og indhold > Brugerdefineret. Klik på indstillingen Indhold i værktøjslinjen. Klik på Rediger skabelon, som åbner Excel-programmet.
  3. I regnearket skal du vælge Tilføjelser > tabel > brønddata. Hold markøren over de forskellige valg for at se eksportmuligheder. Vælg metrik af interesse (f.eks. Objektmiddelværdi[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    BEMÆRK: Pladelayout kan føjes til regnearksanalyseskabelonen ved at vælge Tilføjelsesprogrammer > Protokoloversigt > Layout.
  4. Et redigeringsvindue åbnes. I boksen Brønde skal du angive brøndene til eksport enten med Well-ID eller Well #. Vælg OK. En skabelon indlæses i regnearksfilen. Luk regneark. Skabelonen gemmes automatisk.
  5. Klik på OK i vinduet Ny eksport til Excel, og luk vinduet Rapport/eksportgenerator.
  6. Klik på ikonet Eksporter på Gen5-værktøjslinjen. Marker afkrydsningsfeltet ud for den ønskede eksportfil. Klik på OK. Gen5 udfylder automatisk regnearksskabelonen og åbner filen i Excel.

6. Ekstern dataanalyse

  1. Åbn eksportfilen (.xlsx) i Excel.
  2. For hver brønd divideres hver enkelt værdi med tidspointværdien 0:00 for den pågældende brønd. Dette vil indstille tidspunktet 0 lig med 1, og hver værdi ud over det vil være i forhold til den oprindelige læsning.
  3. Åbn en ny fil i dataanalysesoftwaren. Vælg XY-layoutindstillingen .
    BEMÆRK: I denne protokol blev GraphPad Prism (version 9.5.1) brugt.
  4. Inputetiketter for hver datagruppe. Kopier og indsæt tidspunkterne og tilsvarende normaliserede værdier for hver behandlingsgruppe i Prisme-tabellen. En graf for dataene genereres automatisk og kan findes under Grafer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vores mål var at demonstrere muligheden for at bruge multiplekset levende cellebilleddannelse til vurdering af BOB terapeutisk respons. Proof of concept-eksperimenter blev udført i to separate BOB-modeller af endometriecancer: ONC-10817 og ONC-10811 (se supplerende figur 1 og supplerende figur 2 for ONC-10811-data). Apoptose (annexin V-farvning) og cytotoksicitet (Cytotox Green-optagelse) blev kinetisk overvåget som reaktion på det apoptoseinducerende middel, staurosporin. Specifikt blev BOB'er belagt i plader med 96 brønde, behandlet med Annexin V Red og Cytotox Green farvestoffer og anbragt i en 37 ° C inkubator natten over som vist i figur 1. Vi bekræftede i to uafhængige BOB-modeller, at behandling med Annexin V og Cytotox Green-farvestoffer ikke er giftig (supplerende figur 2). Den følgende dag blev BOB'er behandlet med stigende koncentrationer af staurosporin (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Derefter blev protokoller etableret i Gen5-softwaren, og eksperimenter blev indstillet til at køre over en periode på 5 dage, billeddannelse hver 6. time. Data blev analyseret ved hjælp af funktionen Cellular Analysis i Gen5-softwaren som beskrevet i afsnit 4 i protokollen. Den primære maske blev indstillet ved hjælp af funktionen Automatisk tærskel med "Opdel rørende objekter" umarkeret og med størrelsesparametre på minimum: 30 μm og maksimum: 1000 μm. Subpopulationen af BOB blev defineret ved cirkularitet > 0,25. Objektets middelintensiteter i TRITC (annexin V, apoptose) og GFP-kanaler (cytotoksisk grøn, cytotoksicitet) inden for den udpegede BOB-subpopulation blev eksporteret som en .xlsx fil til yderligere analyse. Objektets gennemsnitlige intensitet for hver brønd på hvert tidspunkt i både GFP- og TRITC-kanalerne blev normaliseret til tid 0. Normaliserede fluorescensdata blev derefter overført til en Prisme-fil og visualiseret som et linjeplot.

Behandling med staurosporin resulterede i en signifikant, dosisafhængig stigning i apoptose og et fald i cellesundhed over tid sammenlignet med køretøjskontrol, hvilket fremgår af stigningen i objektets gennemsnitlige intensitet i både TRITC (annexin V) og GFP (cytotoks) kanaler (figur 4, figur 5, supplerende video 1, supplerende video 2, supplerende video 3, Supplerende video 4, supplerende video 5, supplerende video 6 og supplerende video 7). De 500 nM, 100 nM og 10 nM doser staurosporin resulterede hver især i en statistisk signifikant stigning i både apoptose og cytotoksicitet over tid (figur 5A-C) såvel som ved afslutningen af eksperimentet (figur 5E, F). Endvidere hæmmede staurosporin effektivt BOB-vækst og -dannelse ved disse koncentrationer, hvilket fremgår af et samlet fald i det samlede BOB-areal, mens kontrolhullerne udviste en stigning i det samlede BOB-areal (figur 4 og figur 5D).

Da en stor fordel ved levende cellebilleddannelse er evnen til at korrigere for variabilitet i plettering, udførte vi et eksperiment, hvor cellelevedygtighed blev vurderet som et endepunktsmål. Proof-of-concept endpoint assaydata blev indsamlet ved hjælp af en BOB-model, der blev genereret fra et patientafledt xenograft af prostatacancer. Lyse feltbilleder blev indsamlet i begyndelsen af behandlingsperioden (dag 0) efterfulgt af tilsætning af et dobbelt farvestofreagens, der måler både levedygtighed (acridinorange, AO) og celledød (propidiumiodid, PI). AO-komponenten udsender et grønt fluorescerende signal ved binding til dobbeltstrenget DNA, en indikator for cellelevedygtighed. PI-komponenten pletter døde kerneceller og kan bruges til at kvantificere celledød som reaktion på behandling. For at tage højde for variationer i BOB-belægningen udtænkte vi en metode til at bestemme antallet af BOB'er pr. brønd på tidspunktet 0 ved at konvertere lyse feltbilleder til billeder i digital fase (supplerende figur 3 og supplerende fil 1).

Prostatakræft BDO'er blev behandlet med daunorubicin, et kemoterapimiddel, der forårsager celledød, i 7 dage. Efter afslutningen af eksperimentet blev prøverne farvet med AOPI som beskrevet i supplerende fil 1, efterfulgt af analyse af fluorescerende billeder i Gen5. Figur 6A viser et panel af billeder fra AOPI endpoint assay på dag 7. Ved sammenligning af køretøjsbehandlede BOB'er (række et) med BOB'er behandlet med 10 μM daunorubicin (række to) var der et klart fald i grøn fluorescens (mål for levedygtighed, kolonne to) og en stigning i rød fluorescens (mål for celledød, kolonne tre). Disse resultater blev derefter kvantificeret i figur 6B, hvor vi viser rækken af aflæsninger, der kan opnås ved hjælp af AOPI endpoint farvningsteknikken. Diagrammet øverst til venstre viser levedygtighedsmålingen genereret fra AO-pletten, normaliseret til BOB-tællingen bestemt ved Digital Phase Contrast-billedanalyse af hver brønd på dag 0. Disse data korrelerer med det visuelle resultat fra figur 6A, hvorved levedygtigheden faldt drastisk, efterhånden som koncentrationen af daunorubicin steg. Dette er yderligere rekapituleret i grafen øverst til højre, som viser en stigning i celledød betegnet med en stigning i rød fluorescens erhvervet med PI-pletten.

PI-dataene blev derefter kombineret med levedygtighedsaflæsningen (AO) for at beregne et levedygtigt til dødt forhold (figur 6B, nederste venstre graf). Dette forhold er en nyttig tilgang til at bestemme, om et lægemiddel er cytostatisk eller cytotoksisk. Specifikt vil et cytotoksisk lægemiddel nå meget tættere på 0 end et cytostatisk lægemiddel på grund af det faktum, at et lægemiddel, der er cytostatisk, vil hæmme væksten, men muligvis ikke fremkalde celledød. Endelig kan BOB'ernes areal beregnes nøjagtigt ved hjælp af AO-plettens grønne fluorescens, selv når BOB'er kan gennemgå celledød og blebbing. Grafen nederst til højre viser det gennemsnitlige BOB-areal, der er beregnet som summen af det areal, der er angivet i delpopulationsanalysen divideret med BOB-nummeret. En analyse af området kan give yderligere en indikation af, om en behandling blot hæmmer BOB-væksten eller rent faktisk forårsager BOB-regression. Bemærk, at analysen af det gennemsnitlige BOB-areal blev udført ved hjælp af GFP-kanalen og cellulær analysefunktion i modsætning til figur 5D, som brugte de lyse feltbilleder til at beregne det samlede BOB-areal. Disse data fremhæver fleksibiliteten i analysepipelinen afhængigt af datatilgængelighed og brugerinteresse.

Endelig sammenlignede vi guldstandarden for levedygtighedsaflæsninger, CellTiter-Glo 3D, med levedygtighedsfluorescensaflæsningen ved hjælp af AOPI (figur 6C). Bemærk, at dataene i dette panel ikke blev normaliseret til tiden 0 PDO-nummer, da denne normalisering typisk ikke udføres af laboratorier, der bruger CellTiter-Glo 3D-sættet. Vi observerede den samme tendens for lægemiddeleffekt i begge assays, hvor BOB-levedygtigheden faldt, da daunorubicinkoncentrationen steg. Den eneste visuelle forskel mellem disse aflæsninger var, at CellTiter-Glo 3D-analysen nåede en IC50 før AOPI-analysen og næsten helt nåede 0. Dette resultat kan forklares ved virkningsmekanismen for daunorubicin. Daunorubicin er en topoisomerase-II-hæmmer, der introducerer dobbeltstrengede DNA-brud, hvilket fører til cellecyklusstop og til sidst apoptose14. Under cellecyklusstop kan ATP-udtømning forekomme15. I betragtning af at CellTiter-Glo 3D-analysen er baseret på en ATP-luciferasereaktion for at generere et luminescenssignal, antager vi, at den stærkere reduktion i cellelevedygtighed ved højere koncentrationer af daunorubicin skyldtes ATP-udtømning snarere end fuldstændig celledød. Til støtte for denne idé viser billederne i figur 6A en befolkning, der lever BOB'er i kulturen, som betegnet med grøn fluorescens.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over plettering, billeddannelse og analyseprotokol. BDO'er er belagt i en 96-brøndplade og behandlet med fluorescerende farvestoffer og lægemidler. Billeddannelsesparametre for eksperimentet (f.eks. Eksponering, Z-stak) oprettes i Gen5-softwaren. Billeder erhverves af Cytation 5 og behandles i Gen5, og data eksporteres til yderligere analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over funktionen Cellulær analyse. 1: Udpeg stik: Et stik er udpeget til at omfatte interesseområder. 2: Indstil primær maske: Den primære maske definerer objekter af interesse baseret på størrelse og pixelintensitet i en valgt kanal. I dette repræsentative billede er objekter, der er inkluderet i den primære maske, skitseret i lilla. 3: Definer delpopulation: En yderligere delpopulation kan defineres for yderligere at forfine den ønskede population til analyse. Delpopulationen i eksempelbilledet (skitseret med gult) er defineret ud fra cirkularitet (>0,25) og areal (>800). Billeder blev erhvervet med et 4x mål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på maskering af subpopulationer ved hjælp af funktionen Cellulær analyse. Delpopulationer defineres i den lyse feltkanal. Delpopulationen i eksempelbillederne (skitseret med gult) er defineret ud fra cirkularitet (>0,25) og areal (>800). Billeder blev erhvervet med et 4X mål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Staurosporinbehandling resulterer i en dosisafhængig stigning i apoptose og cytotoksicitet. Lyse feltbilleder (4x mål) med GFP og TRITC fluorescens overlay vises for 500 nM, 10 nM og 0,1 nM doser staurosporin på 3 tidspunkter: 0 h, 54 h, 114 timer. Det røde fluorescerende signal indikerer apoptose (annexin V), og det grønne fluorescerende signal indikerer cytotoksicitet (cytotoks). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Multiplexed fluorescerende levende cellebilleddannelse til vurdering af BOB-respons. BOB-model ONC-10817 blev belagt i plader med 96 brønde og inkuberet med Annexin V Red (1:400) og Cytotox Green (200 nM) farvestoffer natten over ved 37 °C. Den følgende dag blev BDO'er behandlet med stigende koncentrationer af staurosporin og blev afbildet hver 6. time i ~ 5 dage. (A,B) Tids- og dosisafhængig stigning i (A) cytotoksicitet eller (B) apoptose som reaktion på staurosporin. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitet i GFP- eller TRITC-kanalen. (C) Sammenligning af tidsforløbet for apoptose og cytotoksicitet som reaktion på 100 nM eller 500 nM staurosporin. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitetsværdier i GFP- og TRITC-kanalerne. D) Staurosporin hæmmer BOB'ernes vækst. Data blev plottet som det gennemsnitlige samlede BOB-areal. Data i A-D blev normaliseret til BOB-nummer på tidspunktet 0 timer i hver brønd og plottet som middel- og standardfejlen for middelværdien (SEM). N=5 tekniske replikater pr. behandling. p < 0,0001 vs. køretøjsstyring ved 2-vejs ANOVA. (E) Repræsentative lysfelt-, GFP- og TRITC-billeder af 500 nM staurosporinbehandlede BOB'er vs. vehikel ved forsøgets afslutning (114 timer). Billeder blev erhvervet med et 4x mål. (F) Kvantificering af cytotoksicitet, apoptose og levedygtighed ved 114 timers tid. GFP Object Mean Intensity (venstre) og TRITC Object Mean Intensity (midten) blev beregnet ved 114 timers tid ved hjælp af resultater fra panelerne A-C. Levedygtighed (højre) blev vurderet ved hjælp af CellTiter-Glo 3D-reagenset i henhold til producentens protokol. Rå luminescensværdier (RLU) blev normaliseret til det samlede BOB-areal på tidspunktet 0 timer og plottet som foldlevedygtigheden i forhold til køretøjsstyring, som blev sat til 1,0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 vs. køretøjskontrol via envejs ANOVA med Dunnetts post-hoc-test. N = 5 tekniske replikater pr. behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Anvendelse af levende cellebilleddannelse til normalisering af effektparameteranalysedata. BOB'er blev behandlet med stigende koncentrationer af topoisomerase-II-hæmmeren, daunorubicin, i 7 dage. BDO'er blev udsat for AOPI Staining Solution og afbildet som beskrevet i supplerende fil 1. AO = acridinorange, et mål for levedygtighed (GFP-kanal); PI = propidiumiodid, et mål for celledød (Texas Red channel). (A) Repræsentative billeder taget ved hjælp af AOPI-farvning efter 7 dages behandling med 10 μM daunorubicin eller køretøjskontrol (0,1% DMSO). (B) Forskellige aflæsninger ved hjælp af AOPI fluorescens som en endepunkts levedygtighed / celledødsmetode. Se supplerende fil 1 for en detaljeret beskrivelse af analysemetoderne. Øverst til venstre, analyse af BOB's levedygtighed efter 7 dage bestemt ved AO-farvning. Øverst til højre, analyse af celledød ved PI-farvning. Data for AO- og PI-farvning blev normaliseret til BOB-nummer på tidspunktet 0 timer og derefter til køretøjskontrol, som blev sat til 1,0 og plottet som middel- og standardafvigelse. Nederst til venstre, beregning af levedygtigt til dødt forhold ved hjælp af de gennemsnitlige objektintegraler for AO- og PI-pletterne. Nederst til højre, areal af BOB'er som bestemt af AO-farvning. Cellulær analyse blev udført i GFP-kanalen. C) Sammenligning af to metoder til afprøvning af BOB's levedygtighed. Efter billeddannelse blev levedygtigheden evalueret ved hjælp af CellTiter-Glo 3D-reagenset i henhold til producentens protokol. Foldoverlevelsen i forhold til køretøjskontrol blev plottet ved stigende koncentrationer af daunorubicin. Data repræsenterer middel- og standardafvigelsen for N = 6 tekniske replikater pr. behandling; data blev ikke normaliseret til tid 0 timer i panel C. Klik her for at se en større version af denne figur.

Behandling # af brønde Medievolumen Bilag 100 μM cytotoksisk
Fortynding Lydstyrke Fortynding Lydstyrke
Multiplex 60 6,6 ml 1:400 16,5 μL 200 nM 13,2 μL

Tabel 1: Eksempel på multiplexeringseksperiment. Annexin V Red binder eksponeret phosphatidylserin på den ydre folder af apoptotiske cellemembraner. Cytotox Green integreres i celler med kompromitteret membranintegritet og binder DNA.

Supplerende figur 1: Multiplexed live-cell imaging af ONC-10811. BOB'er blev belagt i plader med 96 brønde og inkuberet i Annexin V Red (1:400) og Cytotox Green (200 nM) farvestoffer natten over ved 37 °C. Den følgende dag blev BOB'er behandlet med stigende koncentrationer af staurosporin og blev afbildet hver 6. time i 5 dage. (A) Tids- og dosisafhængig stigning i cytotoksicitet som reaktion på staurosporin. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitet i GFP-kanalen. B) Staurosporins dosis-respons ved 114 timer. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitetsværdier i GFP-kanalen ved 114 timers tidspunktet. (C) Tids- og dosisafhængig stigning i apoptose som reaktion på staurosporin. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitet i TRITC-kanalen. (D) Staurosporins dosis-respons ved 114 timer. Data blev plottet som objektets gennemsnitlige intensitetsværdier i TRITC-kanalen ved 114 timers tidspunktet. Data i A og C blev normaliseret til BOB-nummer på tidspunktet 0 timer på brøndniveauet. N = 5 tekniske replikater pr. behandling i hver model. p < 0,0001 vs. køretøjsstyring ved 2-vejs ANOVA. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Behandling med Annexin V og cytotoksisk hæmmer ikke BOB's levedygtighed. BOB'er blev belagt i plader med 96 brønde og inkuberet med Annexin V Red (1:400) og Cytotox Green (200 nM) farvestoffer natten over ved 37 °C. Efter 24 timers inkubation blev levedygtigheden vurderet ved hjælp af CellTiter-Glo 3D-analysen i henhold til producentens protokol. A) levedygtighed i farvestofbehandlede og ubehandlede BOB'er ved 24 timer. Både RLU-værdier (relative light unit) og værdier normaliseret til BOB-sumareal præsenteres. Specifikt blev CellTiter-Glo3D RLU for hver brønd normaliseret til summen af BOB-området for den brønd på pletteringstidspunktet (dvs. umiddelbart efter tilsætning af farvestof). Det samlede BOB-areal blev bestemt ved hjælp af beregningen "Objektsumareal" i cellulær analyse. N = 10. B) levedygtighed i farvestofbehandlede og ubehandlede BOB'er ved 114 timer. Både rå luminescensværdier og værdier normaliseret til det samlede BOB-areal præsenteres. CellTiter-Glo3D RLU for hver brønd blev normaliseret til summeringen af BOB-området ved 24 timer efter plettering, hvilket svarer til tiden 0 timer i kinetisk billeddannelseseksperimenter. N = 5. Signifikans i A og B blev vurderet ved hjælp af en uparret t-test; P-værdier er angivet på graferne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Etiketfri analyse af BOB'er ved hjælp af digital fasekontrast. Denne figur indeholder repræsentative billeder (2,5x objektiv), der viser etiketfri analyse som beskrevet i Supplementary File 1: Opsætning af billeddannelsesparametre for et enkelt fokalplan for synsanalyse (Bright Field / Digital Phase Contrast Images) og Digital Phase Contrast Image analyse i Gen5-software. (A) Eksempel på lyst feltbillede af en prostatacancer PDXO-model på et enkelt brændplan. (B) Det lyse feltbillede i A blev konverteret til et digitalt fasekontrastbillede. Mørke objekter i det lyse feltbillede ser lyse ud i billedet Digital fasekontrast og omvendt. (C) Eksempel på BOB-maskering ved hjælp af kontrastbilledet Digital Phase. Bemærk, at kanterne på objekter af interesse bliver meget mere definerede sammenlignet med de lyse feltbilleder. I dette repræsentative billede er objekter i den primære maske skitseret med gult. Delpopulationen i (C) (skitseret med pink) er defineret ud fra cirkularitet (>0,3), areal (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 og Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. De parametre, der blev brugt i denne repræsentative figur, blev anvendt på data i figur 6 for at normalisere til celletælling på dag 0. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: BOB-modeller kan variere i morfologi og pletteringskonsistens. Øverste panel: Eksempler på differentiel spredning af BDO'er i BME-kuplerne. Nederste panel: Repræsentative billeder af diskohæsive vs. cirkulære BDO'er. Alle billeder blev erhvervet med et EVOS-mikroskop. Forstørrelser noteres. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Eksempler på billeder, der bruger cellulær analyse vs. billedstatistik til kvantificering af fluorescens. Ved hjælp af cellulær analyse kan brugerne definere specifikke populationer i et billede og måle fluorescens i disse regioner. Billedstatistik kan også bruges til at måle fluorescens i et billede ved at definere en tærskel for at udelukke baggrundssignaler. Se diskussionen for begrænsningerne ved brug af billedstatistik. Billeder er ved 4x forstørrelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Organoidkulturmediekomponenter. Bemærk, at reagenser er optimeret til dyrkning af gynækologiske kræft-BDO'er. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 1: Time-lapse video af 500 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 2: Time-lapse video af 100 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 3: Time-lapse video af 10 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 4: Time-lapse video af 1 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 5: Time-lapse video af 0,1 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 6: Time-lapse video af 0,01 nM staurosporin behandling med billeder erhvervet hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 7: Time-lapse-video af køretøjet (0,06% DMSO) med billeder taget hver 6. time. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Supplerende protokoller. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BOB-kulturer bliver et stadig mere populært in vitro-modelsystem på grund af deres evne til at afspejle cellulære reaktioner og adfærd2. Der er gjort betydelige fremskridt inden for BOB-generering, kultur og ekspansionsteknikker, men metoder til analyse af terapeutiske reaktioner har haltet. Kommercielt tilgængelige 3D-levedygtighedssæt er lytiske endepunktsassays, der går glip af potentielt værdifulde kinetiske responsdata og begrænser efterfølgende analyser ved andre metoder8. Nye undersøgelser anvender levende cellebilleddannelse til at vurdere lægemiddelresponser i BOB-modeller. Her præsenterer vi en metode til at vurdere BOB-terapeutiske reaktioner over tid ved hjælp af multiplekset fluorescerende levende cellebilleddannelse. Multiplexing fluorescerende farvestoffer gør det muligt at kvantificere forskellige cellulære reaktioner samtidigt. Ud over apoptose og cytotoksicitet forestiller vi os, at denne tilgang kan udvides i fremtidige undersøgelser for at undersøge andre fænotypiske virkninger i BDO'er.

Protokollen, der præsenteres heri, er designet til at erhverve kinetiske lysfelts- og fluorescerende billeder af BDO'er belagt som kupler i en plade med 96 brønde. Nøgletrin inkluderer 1) plettering, 2) behandling med farvestof og lægemiddel, 3) definition af billeddannelsesparametre, 4) billedforbehandling og analyse ved afslutningen af kinetisk billedoptagelse og 5) dataeksport til analyse i anden statistisk software (figur 1). Intakte BDO'er er belagt i en 96-brønds plade som 5 μL BME-kupler sammensat af et foruddefineret forhold mellem BME og organoid kulturmedier (typisk 1: 1). Protokollen, der præsenteres heri, bruger UltiMatrix som BME på grund af minimal batch-til-batch-variabilitet og overlegne optiske egenskaber til billeddannelse. Ændringer til høst af BOB'er, der dyrkes i andre BME'er, såsom Matrigel, kan være nødvendige såvel som for modeller, der er klumpede og vanskelige at adskille (se eksempler på supplerende figur 4). Derefter tilsættes fluorescerende farvestoffer til organoidkulturmediet på pletteringstidspunktet (dag -1) i en 2x koncentration i et 100 μL volumen og inkuberes natten over for at bestemme baseline celledød. Den følgende dag (dag 0) tilsættes lægemidler eller andre behandlinger til organoidkulturmedier i en 2x koncentration i et 100 μL volumen og tilsættes derefter til hver brønd for et endeligt volumen på 200 μL. Det endelige volumen på 200 μL reducerer meniskuseffekten med billeddannelse. Kinetiske billeder erhverves ved hjælp af Cytation 5-pladelæseren, der samarbejder med BioSpa-bordpladeinkubatoren. BioSpa-inkubatoren muliggør inkubation af forsøgsplader ved en fast temperatur på 37 °C og 5% CO2 -miljø. Op til 8 plader kan opbevares i BioSpa og derved kan 8 eksperimenter udføres samtidigt. Billedparametre for hver plade indstilles i Gen5-softwaren ved hjælp af "Imager Manual Mode" og gemmes som en protokol. Protokollen indlæses derefter i planlægningssoftwaren (BioSpa OnDemand). BioSpa OnDemand-softwaren automatiserer arbejdsgangen til kinetisk billedoptagelse, herunder den fysiske overførsel af pladen fra BioSpa-inkubatoren til Cytation 5 og dikterer, hvilken protokol der skal køres i Gen5 til dataindsamling. Billeder analyseres ved hjælp af funktionen Cellular Analysis i Gen5-softwaren (figur 2). Vi beskriver specifikke metoder til at analysere Z-projektioner af fluorescerende og lyse feltbilleder. Specifikke metoder til analyse af enkelte Z-planer og/eller kun lyse feltbilleder findes i supplerende fil 1. Endelig kan brugerne definere specifikke datafunktioner, såsom BOB-område, antal og gennemsnitlig fluorescensintensitet, der skal eksporteres som et Excel-regneark til efterfølgende statistisk analyse af lægemiddeleffekter.

Da BOB-modeller er et relativt nyt modelsystem til undersøgelse af lægemiddeleffekter, er der stadig metoder til at imødekomme dyrkningsforholdene, navnlig væksten i BME16. Hovedparten af de undersøgelser, der vurderer BOB-respons på lægemiddelbehandling, er afhængige af ATP-baserede endepunktsassays som surrogat for cellesundhed (CellTiter-Glo 3D). Denne metode kræver cellelyse, hvilket udelukker efterfølgende downstream-analyser. Alternative endepunktsanalyser, såsom fluorescerende farvning, enkelttidsbilleddannelse og morfologisk sporing, har givet andre målinger til karakterisering af lægemiddelrespons, samtidig med at det giver mulighed for prøvebrug til yderligere formål. For eksempel er der anvendt endepunktsfikseringsprotokoller i pladen til high-throughput analyse af lægemiddeleffekter17,18. En fordel ved denne metode er, at den omgår den omfattende behandling, der kræves i typisk immunhistokemi og immunfluorescerende billeddannelse19, og er særlig nyttig, når prøven er begrænset, som det er tilfældet for BOB-modeller. Det er også acceptabelt for billeddannelse i høj opløsning med konfokal mikroskopi. Et andet endepunktsassay, der ikke kræver cellelyse, er levende cellebilleddannelse med reagenser såsom propidiumiodid eller acridinorange. Vores komparative analyse af CellTiter-Glo 3D og AOPI, hvoraf sidstnævnte ikke kræver cellelyse, til vurdering af cellelevedygtighed og død (figur 6C) fremhæver fordelene ved at bruge levende cellebilleddannende farvestoffer i BOB-modeller. Denne metode er blevet anvendt af flere grupper, herunder vores, til at vurdere fænotypiske effekter ved afslutningen af et eksperiment 18,19,20. Imidlertid kræver kinetisk dataindsamling ved hjælp af enten in-well-fikserings- eller endepunktsbilleddannelsesmetoderne levende celler betydelig prøve. Etiketfri morfologisk vurdering af BDO'er over tid overvinder delvis denne begrænsning og kan vurderes ved hjælp af en bred vifte af billeddannelsesmetoder 8,10,17,18, men ændringer i morfologi er muligvis ikke repræsentative for spektret af potentielle lægemiddelvirkninger såsom apoptose og ændringer i cellelevedygtighed. Vi har observeret signifikant model-til-model variabilitet i morfologiske ændringer som reaktion på lægemidler. For eksempel vil nogle BDO'er stige i areal, da de gennemgår apoptose, mens andre modeller kan krympe. Kinetiske morfologiske vurderinger er blevet multiplexet med enten faste eller levende celle fluorescerende endepunktsassays i et begrænset antal studier18,20. De metoder, der præsenteres heri, er blandt de første til at multiplexere forskellige fluorescerende farvestoffer for samtidig at vurdere flere cellulære effekter i et high-throughput system.

En af de største forbedringer, der leveres af kinetisk levende cellebilleddannelse, er, at den overvinder nøglebegrænsninger forbundet med endpoint-assays. For eksempel er plettering af et lige antal BDO'er pr. Brønd teknisk vanskelig, fordi de fleste automatiserede celletællere er gated for objekter mindre end 60 μm. Levende cellebilleddannelse muliggør normalisering til BOB-nummer eller -område på tidspunktet 0 timer i hver brønd, som derefter kan bruges til at justere for variation i plettering mellem brønde. Guldstandardslutpunktsanalysen for BDO'er er CellTiter-Glo 3D-sættet, der måler ATP som surrogat for cellelevedygtighed. Vi har i vid udstrækning brugt dette assay i vores undersøgelser af gynækologiske og prostatakræft PDO'er 13,21,22,23,24. Ud over at kræve cellelyse til ATP-foranstaltninger kan lægemidler og andre terapeutiske modaliteter ændre ATP-niveauer, hvilket potentielt giver en unøjagtig vurdering af terapeutisk respons. Brug af levende cellebilleddannelsesfarvestoffer muliggør kvantificering af et bredere omfang af specifikke cellulære reaktioner, såsom apoptose og cytotoksicitet. Det er vigtigt, at disse reagenser ikke forstyrrer cellelevedygtighed eller inducerer DNA-skade, som det er tilfældet med propidiumiodid; Dette giver mulighed for gentagen vurdering af BOB-respons over tid. Selvom vi ikke har undersøgt brugen af acridinorange (AO) til kinetiske foranstaltninger, bør virkningsmekanismen for AO ikke udelukke en sådan anvendelse i fremtiden.

Tumorer består af flere forskellige cellepopulationer med varierende genomiske profiler og morfologier. På grund af BOB-modellernes komplekse heterogenitet kan individuelle BOB-reaktioner variere, og det er en udfordring at spore disse reaktioner. Vores protokol giver en metode til at vurdere flere BOB-responsmålinger på en brønd-for-godt basis. Visse tekniske overvejelser gælder dog stadig for levende cellebilleddannelse. Antallet af brønde i en plade med 24 brønde, der er nødvendige for at så en plade med 96 brønde, afhænger af tætheden og væksthastigheden for hver BOB-model. Da sammenklumpning kan forvirre billedanalysen (supplerende figur 4), kan BOB-modeller have brug for yderligere behandlingstrin inden plettering. Om nødvendigt kan BOB'er klippes mekanisk under forarbejdningen gennem kraftig pipettering med en ikke-bred boring p200-spids. Enzymatisk fordøjelse ved hjælp af TrypLE Express kan også anvendes før plating for at fremme BOB dissociation og nedsat klumpning. I vores erfaring, Vi har bemærket, at længden af TrypLE inkubation er meget variabel afhængigt af modellen. Derfor, TrypLE inkubation bør optimeres for hver model, især hvis forskere ønsker at opnå enkeltcelle suspensioner. Restitutionstid før behandlingsstart kan være nødvendig for BOB-modeller, der er særligt følsomme over for enzymatisk fordøjelse.

Vi præsenterer metoder til specifikke levende cellebilleddannende reagenser. En begrænsning i den brede anvendelighed af de metoder, der præsenteres heri, er en mangel på reagenser, der er kompatible med BME. For andre farvestoffer/reagenser, der endnu ikke er optimeret til brug i BOB'er, kan yderligere fejlfinding være nødvendig for at bestemme den optimale koncentration og minimere opløsningsmiddelvirkningerne. Afhængigt af aflæsningen af interesse (f.eks. Apoptose eller cytotoksicitet) bør behandling med en forbindelse, der vides at inducere celledød, såsom staurosporin eller daunorubicin13 , anvendes til at optimere reagensforholdene. En yderligere overvejelse er det optimale tidspunkt for farvestofintegration i BME-kuplen. I vores eksperimenter udfører vi en inkubation natten over før behandling for at muliggøre fuldstændig optagelse af farvestoffet i kuplerne samt bestemme baseline cellesundhed. Da signalintensiteten vil stige over tid, bør forskere udføre pilotundersøgelser med farvestofferne for at bestemme den ideelle eksponeringstid i slutningen af eksperimentet for at undgå overeksponerede billeder. Endelig bør reagenser ikke forstyrre cellulære processer. For eksempel er farvestoffer, der interkalerer i DNA, ikke kompatible med kinetisk billeddannelse. Imidlertid kan levende cellebilleddannelse bruges til datanormalisering i endepunktsassays. Faktisk præsenterer vi en supplerende metode til kvantificering af cellelevedygtighed og levedygtigt: dødt celleforhold ved hjælp af AOPI. I dette eksperiment normaliseres fluorescerende signal til BOB-nummer for hver brønd som bestemt ved levende cellebilleddannelse på dag 0 (behandlingsdag, figur 6).

En anden begrænsning ved dette metodepapir er afhængigheden af manuel pipettering til eksperimenter, hvilket kan føre til større varians i tekniske replikater. Yderligere forbedringer i datareproducerbarhed kan opnås ved at tilføje automatisering til andre trin i den eksperimentelle proces, såsom brugen af en automatiseret væskehåndterer til plettering og lægemiddeludlevering, som det er blevet påvist af andre 8,10. Denne tilføjelse kræver imidlertid en yderligere investering i forskningsinfrastruktur, som muligvis ikke er tilgængelig for alle efterforskere. I betragtning af heterogeniteten i BOB-arealet for hver model er normalisering af resultaterne til det oprindelige BOB-nummer eller -areal på tidspunktet 0 timer stadig en nyttig tilgang med automatiseret såning.

En vigtig fordel ved Cytation 5 i forhold til andre live-celle-billedbehandlingsplatforme er muligheden for at tilpasse billed- og analysefunktioner. Cytation 5 / Gen5-softwaren har dog en stejl indlæringskurve og antager, at brugerne har en grundlæggende viden om billeddannelse. Et af målene med dette metodepapir er at give trinvise instruktioner for at mindske barrieren for andre forskere til at indarbejde sofistikerede levende cellebilleddannelsesteknikker i deres BOB-forskningsprogrammer. Mens de specifikke analysetrin, der præsenteres heri, er for et system, kan brugerne anvende multiplexingprincipperne på andre platforme med den forståelse, at downstream-analyse kan nødvendiggøre brug af tredjepartssoftware, såsom NIH ImageJ.

Analysemålinger bør vælges baseret på både eksperimentelle mål og pletteringsbetingelser. For eksempel, hvis eksperimentet udføres ved hjælp af et fluorescerende farvestof til kvantificering af celledød, er fluorescensintensitet en effektiv aflæsning. Den mest effektive fluorescensmetrik (total fluorescens vs. objektmiddelintensitet) afhænger af pletteringsbetingelserne (supplerende figur 4). Hvis BOB'erne er jævnt fordelt og har en mere cirkulær, sammenhængende morfologi, kan fluorescens bestemmes i en defineret BOB-subpopulation. Den specifikke funktion i Gen5-softwaren er cellulær analyse, og outputtet er objektmiddelintensitet. Men hvis BOB-modellen er klumpet eller har en diskohæsiv morfologi, anbefaler vi at kvantificere fluorescenssignalet på billedniveau; denne funktion kan findes under Billedstatistik, og outputtet er Total fluorescensintensitet. Selvom denne metode er nyttig til at observere ændringer på det enkelte brøndniveau, er denne måling ikke specifik for objekter af interesse og kan ændre sig fejlagtigt, hvis BOB'erne bevæger sig uden for det udpegede stik i løbet af eksperimentets varighed. I scenarier, hvor der er betydeligt snavs eller døde enkeltceller, foreslås brug af cellulær analyse til at udskille ethvert fluorescerende signal, der ikke specifikt er forbundet med en BOB. Et eksempel på differentielle resultater ved hjælp af cellulær analyse vs. billedstatistik er præsenteret i supplerende figur 5.

For at bestemme den optimale tærskel for funktionen Billedstatistik kan linjeværktøjet bruges. Ved hjælp af linjeværktøjet kan brugerne bestemme rækkevidden af fluorescensintensitet i et billede. Vi indstiller den nedre tærskel som 25% værdien af topintensiteten i billedet. For at se de fluorescerende områder, der er inkluderet i den angivne tærskel, skal du markere afkrydsningsfeltet "Tærskelafvigelser". Det kan blive nødvendigt med yderligere finjustering af den nedre tærskelværdi.

En væsentlig udfordring i levende cellebilleddannelse er lagring af den enorme mængde data, der genereres med hvert eksperiment. Dette er især relevant i tilfælde af BOB-kulturer, hvor Z-Stacks bruges til at afbilde på tværs af flere brændplaner og generere en Z-projektion. Der er flere metoder til at løse dette problem. Først skal du sikre tilstrækkelig lagerkapacitet. Vi har installeret tre solid state-harddiske med i alt 17 TB. Andre muligheder omfatter overførsel af eksperimentelle filer til eksterne harddiske eller netværkslagring. Det anbefales ikke at skrive filer direkte til skybaseret lagring. For at analysere data, der er gemt på et eksternt drev, skal du blot overføre eksperimentet og billedfilerne til en computer udstyret med Gen5-software (BEMÆRK: store filer kan tage længere tid at overføre). Før analysen skal billederne linkes til eksperimentet igen. Åbn eksperimentfilen, klik på Protokol på værktøjslinjen, og vælg Protokolindstillinger. Klik på Indstillinger for lagring af billeder, og klik på Vælg ny billedmappe. Find billedfilen, og klik på Vælg mappe for at sammenkæde igen.

Afhængigt af eksperimentets mål kan det også være hensigtsmæssigt at bruge binning-funktionen i Gen5. Binning reducerer filstørrelsen ved at sænke antallet af pixel, hvilket fører til lavere billedopløsning (se trin 3.5.3.2). Derfor anbefales binning ikke, hvis der kræves billeder i høj opløsning. Når du bruger binning-funktionen, skal eksponeringsindstillingerne justeres. Når den eksperimentelle fil er oprettet, skal du dobbeltklikke på afsnittet Billede og klikke på mikroskopikonet for at genåbne Imager Manual Mode. Brug funktionen Autoeksponering, eller juster eksponeringen manuelt efter behov.

Sammenfattende præsenterer vi metoder til vurdering af apoptose og cellesundhed af BDO'er som reaktion på cytotoksiske midler. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at optimere metoder og udvikle yderligere analysestrategier til kinetisk billeddannelse af BDO'er, såsom andre fænotyper og virkninger af lægemidler, der er cytostatiske snarere end cytotoksiske. En stor hindring er den kommercielle tilgængelighed af farvestoffer og reagenser, der er kompatible med BME. Der er stadig mere arbejde, der er nødvendigt for bedre at forstå, hvordan kinetisk levende cellebilleddannelse fuldt ud kan udnyttes til at udtrække flest data fra disse modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KWT er medejer af Immortagen Inc. CJD er ansat hos Agilent. JSdB har siddet i advisory boards og modtaget honorarer fra Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo og Vertex Pharmaceuticals; er ansat ved Institute of Cancer Research (ICR), som har modtaget finansiering eller anden støtte til hans forskningsarbejde fra AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer og Vertex, og som har en kommerciel interesse i abirateron, PARP-hæmning i DNA-reparation af defekte kræftformer, og PI3K/AKT pathway hæmmere (ingen personlig indkomst); blev nævnt som opfinder uden økonomisk interesse for patent 8 822 438, indsendt af Janssen, der dækker brugen af abirateronacetat sammen med kortikosteroider; har været CI/PI i mange industrisponsorerede kliniske forsøg; og er seniorforsker ved National Institute for Health Research (NIHR). Ingen andre forfattere har nogen potentielle interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Tissue Procurement Core og Dr. Kristen Coleman ved University of Iowa for at levere patienttumorprøver og til Dr. Sofia Gabrilovich i Institut for Obstetrik og Gynækologi for at hjælpe med generering af BOB-modeller. Vi takker også Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) for kritisk analyse af manuskriptet. Vi anerkender følgende finansieringskilder: NIH / NCI CA263783 og DOD CDMRP CA220729P1 til KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation og Medical Research Council til JSdB. Bidragyderne havde ingen rolle i design eller analyse af eksperimenter eller beslutning om at offentliggøre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrfuge tube Dot Scientific Inc 1008113
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62.554.100
554 NM LED Cube Agilent 1225012
96-well plate Corning Costar 3596 Prewarmed to 37 °C
96-well plate Agilent 204626-100 Prewarmed to 37 °C
A83-01 Tocris 2939 Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634-010 component of organoid culture media
B27 Supplement Gibco 17504044 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator Agilent BIOSPAG-SN Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Agilent CYT5PW-SN Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Systems BME001-10
Daunorubicin HCl Sigma-Aldrich S3035 Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
EDTA (0.5 M) Thermo Fisher AM9260G
Forskolin Tocris 1099 Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax Gibco 35050-061 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES Gibco 15630-080 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein Gibco AF-100-15-1MG Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein Gibco 100-26-1MG Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein Gibco 120-38-5UG Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technologies 7926 Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP Agilent 1225101
Imaging Filter Cube- TRITC Agilent 1225125
Imaging LED GFP/CFP Agilent 1225001
Incucyte Annexin V Red Dye Sartorius 4641 Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye Sartorius 4633 DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution Fisher-Scientific 13366169 Add 1:50 volume
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin R&D Systems 6057-NG Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 14190-144
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1 Pepro Tech 100-03 Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich S6942
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7 Sigma-Aldrich 688000 Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2758 Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762 (2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488 (2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434 (2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901 (2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377 (2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682 (2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59 (2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 203
Multiplexed levende cellebilleddannelse til lægemiddelrespons i patientafledte organoidmodeller af kræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colling, K. E., Symons, E. L.,… More

Colling, K. E., Symons, E. L., Buroni, L., Sumanasiri, H. K., Andrew-Udoh, J., Witt, E., Losh, H. A., Morrison, A. M., Leslie, K. K., Dunnill, C. J., de Bono, J. S., Thiel, K. W. Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer. J. Vis. Exp. (203), e66072, doi:10.3791/66072 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter