Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Summary

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Abstract

Patiënt-afgeleide organoïde (PDO) modellen van kanker zijn een multifunctioneel onderzoekssysteem dat menselijke ziekten beter recapituleert in vergelijking met kankercellijnen. PDO-modellen kunnen worden gegenereerd door tumorcellen van patiënten te kweken in extracellulaire basale membraanextracten (BME) en deze te plateren als driedimensionale koepels. In de handel verkrijgbare reagentia die zijn geoptimaliseerd voor fenotypische tests in monolaagculturen zijn echter vaak niet compatibel met BME. Hierin beschrijven we een methode om PDO-modellen in kaart te brengen en de effecten van geneesmiddelen te beoordelen met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem met levende cellen. Daarnaast passen we fluorescerende kleurstoffen toe die compatibel zijn met kinetische metingen om de celgezondheid en apoptose tegelijkertijd te kwantificeren. Het vastleggen van afbeeldingen kan worden aangepast om met regelmatige tussenpozen gedurende meerdere dagen plaats te vinden. Gebruikers kunnen de effecten van geneesmiddelen analyseren in individuele Z-vlakbeelden of een Z-projectie van seriële beelden van meerdere brandpuntsvlakken. Met behulp van maskering worden specifieke parameters berekend die van belang zijn, zoals PDO-nummer, oppervlakte en fluorescentie-intensiteit. We leveren proof-of-concept-gegevens die het effect van cytotoxische middelen op celgezondheid, apoptose en levensvatbaarheid aantonen. Dit geautomatiseerde kinetische beeldvormingsplatform kan worden uitgebreid naar andere fenotypische uitlezingen om inzicht te krijgen in diverse therapeutische effecten in PDO-modellen van kanker.

Introduction

Patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's) zijn snel in opkomst als een robuust modelsysteem om de ontwikkeling van kanker en therapeutische reacties te bestuderen. BOB's zijn driedimensionale (3D) celkweeksystemen die het complexe genomische profiel en de architectuur van de primaire tumor samenvatten ^1,2. In tegenstelling tot traditionele tweedimensionale (2D) culturen van onsterfelijke kankercellijnen, vangen BOB's intratumorale heterogeniteit^{op en} behouden deze ^3,4, waardoor ze een waardevol hulpmiddel zijn voor zowel mechanistisch als translationeel onderzoek. Hoewel BOB's een steeds populairder modelsysteem worden, zijn in de handel verkrijgbare reagentia en analysemethoden voor cellulaire effecten die compatibel zijn met BOB-culturen beperkt.

Het gebrek aan robuuste methoden om subtiele veranderingen in de respons op de behandeling te analyseren, belemmert de klinische vertaling. Het gouden standaard celgezondheidsreagens in 3D-culturen, CellTiter-Glo 3D, maakt gebruik van ATP-niveaus als een bepalende factor voor de levensvatbaarheid van cellen ^5,6. Hoewel dit reagens nuttig is voor eindpunttests, zijn er verschillende kanttekeningen, met name het onvermogen om monsters voor andere doeleinden te gebruiken na voltooiing van de test.

Beeldvorming van levende cellen is een geavanceerde vorm van kinetische microscopie die, in combinatie met fluorescerende reagentia, de capaciteit heeft om een verscheidenheid aan uitlezingen van de celgezondheid binnen PDO-modellen te kwantificeren, waaronder apoptose ^7,8,9 en cytotoxiciteit¹⁰. Beeldvorming van levende cellen is inderdaad een integraal onderdeel geweest van de screening van verbindingen met hoge doorvoer in 2D-platforms^11,12. Systemen zoals de Incucyte hebben de technologie betaalbaar gemaakt en dus toegankelijk gemaakt voor onderzoeksgroepen in verschillende omgevingen. De toepassing van deze systemen om 3D-culturen te analyseren staat echter nog in de kinderschoenen.

Hierin beschrijven we een methode om de respons op geneesmiddelen in PDO-modellen van kanker te beoordelen met behulp van multiplexed live-cell imaging (Figuur 1). Door analyse van helderveldbeelden kunnen veranderingen in de grootte en morfologie van de PDO's kinetisch worden gevolgd. Bovendien kunnen cellulaire processen in de loop van de tijd gelijktijdig worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende reagentia, zoals Annexine V Rode kleurstof voor apoptose en Cytotox Groene kleurstof voor cytotoxiciteit. De gepresenteerde methoden zijn geoptimaliseerd voor het Cytation 5 live-cell beeldvormingssysteem, maar dit protocol kan worden aangepast aan verschillende live-cell beeldvormingsplatforms.

Protocol

Studies met menselijke tumormonsters werden beoordeeld en goedgekeurd door de University of Iowa Institutional Review Board (IRB), protocol #201809807, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die aan het onderzoek deelnamen. Inclusiecriteria zijn onder meer een diagnose van kanker en de beschikbaarheid van tumormonsters.

1. Intacte BOB's plateren in een plaat met 96 putjes

1. Bereid reagentia voor.
   1. Verwarm de platen met 96 putjes een nacht voor bij 37 °C en ontdooi BME een nacht bij 4 °C.
   2. Bereid volledige organoïde kweekmedia voor die zijn geoptimaliseerd voor het kweken van het kankertype dat van belang is. Specifieke voedingsbodems die worden gebruikt voor de hierin getoonde experimenten zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
      OPMERKING: Mediacomponenten moeten mogelijk worden aangepast voor verschillende tumortypes. Het organoïde kweekmedium wordt bijvoorbeeld aangevuld met 100 nM estradiol voor gynaecologische tumoren¹³. Voorbereide media zijn gedurende 1 maand stabiel bij 4 °C. Voor langdurige opslag aliquot de media in tubes van 50 ml en bewaren bij -20 °C.
2. Bereid twee afzonderlijke aliquots van organoïde kweekmedia bij 4 °C en 37 °C. Als er bijvoorbeeld 60 putjes worden geplateerd in een plaat met 96 putjes, gebruik dan 6 ml warme organoïde-kweekmedia en 150 μl ijskoude organoïde-kweekmedia.
3. Bereid organoïde wasbuffer voor: Vul 1x PBS aan met 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA en 10 μM Y-27632. Bewaren bij 4 °C
4. Oogst BOB's gekweekt in een bord met 24 putjes. Voer alle stappen uit op ijs of bij 4 °C, tenzij anders vermeld.
   1. Zuig media uit elke put op met behulp van een vacuümleidingsysteem.
   2. Voeg 500 μL ijskoude organoïde wasbuffer toe en pipetteer voorzichtig 2-3x met een pipettor van 1000 μL. Incubeer de plaat 10 minuten op ijs.
   3. Breng de inhoud van elk putje over in een conische buis van 50 ml. Om er zeker van te zijn dat alle BOB's in suspensie zijn, spoelt u elk putje met een extra 300 μL organoïde wasbuffer en brengt u het over in de conische buis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C
   4. Zuig het supernatans uit de BME/organoïdekorrel op met behulp van een vacuümleidingsysteem, waarbij ~ 5 ml in de buis achterblijft. Voeg 20 ml organoïde wasbuffer toe en resuspendeer de pellet voorzichtig met een serologische pipet van 10 ml. Incubeer 10 minuten op ijs.
   5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C. Zuig het supernatans op met een vacuümleidingsysteem en zorg ervoor dat de BOB-pellet niet wordt verstoord.
5. Plateren van BOB's in een plaat met 96 putjes: Voer alle stappen uit op ijs, tenzij anders vermeld.
   1. Resuspendeer de BOB-pellet in een geschikte hoeveelheid ijskoude organoïde kweekmedia om een BOB-suspensie te creëren. Breng de BOB-suspensie over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Om de hoeveelheid organoïde-kweekmedia te berekenen, bepaalt u het aantal putjes dat moet worden geplateerd in een plaat met 96 putjes, rekening houdend met het feit dat BOB's worden geplateerd in een koepel van 5 μL in een verhouding van 1:1 van organoïde-kweekmedia en BME. Bij het plateren van een plaat met 96 putjes en het gebruik van alleen de binnenste 60 putjes, is de totale benodigde hoeveelheid PDO-suspensie 300 μL: 150 μL organoïde kweekmedia en 150 μL BME. Voor modellen die een optimale groei vertonen bij verschillende percentages BME, kan de verhouding BME: media in deze stap worden gewijzigd, hoewel het belangrijk is om de verhouding voor alle assays voor elk specifiek model te standaardiseren. Om rekening te houden met pipetteerfouten, voegt u 10% volume toe aan elk onderdeel.
   2. Tel het aantal BOB's.
      1. Breng 2,5 μl van de BOB-suspensie over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met 2,5 μl BME. Breng het mengsel van 5 μL over op een schoon glazen microscoopglaasje. Laat de dia niet onder het deksel schuiven. Het mengsel stolt tot een koepel.
      2. Visualiseer met een helderveldmicroscoop op 4x. Tel het aantal BOB's in het mengsel van 5 μL; het doel is om ongeveer 25-50 BOB's per koepel van 5 μL te hebben.
         OPMERKING: Als de gewenste dichtheid in het testmengsel niet wordt bereikt, moet het uiteindelijke volume van de BOB-suspensie worden aangepast door meer organoïde-kweekmedia toe te voegen of door de BOB-suspensie te centrifugeren en de BOB-pellet opnieuw te suspenderen in een lager volume ijskoude organoïde-kweekmedia. Ongeacht hoe de BOB-suspensie in deze stap wordt gewijzigd, is de eindverhouding van BME: BOB-ophanging in stap 1.5.3. moet 1:1 zijn.
   3. Gebruik een pipetto van 200 μl met brede boringen en meng de PDO-suspensie zorgvuldig met een gelijke hoeveelheid BME om een verhouding van 1:1 van organoïde kweekmedia tot BME te bereiken. Vermijd luchtbellen, die de integriteit van de koepels verstoren.
   4. Gebruik een pipettor van 20 μL om koepels van 5 μL in het midden van elk putje van een voorverwarmde plaat met 96 putjes te zaaien, waarbij alleen de binnenste 60 putjes worden gezaaid. Om een gelijkmatige verdeling van de BOB's te garanderen, pipeert u de inhoud van de buis van 1,5 ml periodiek met een pipetor van 200 μl met brede uitloop.
   5. Nadat alle kuiltjes zijn gezaaid, plaatst u het deksel op het bord en keert u voorzichtig om. Incubeer de omgekeerde plaat bij 37 °C gedurende 20 minuten in de weefselkweekincubator om de koepels te laten stollen.
      OPMERKING: Het omkeren van de plaat zorgt ervoor dat de BME/organoïde kweekmediakoepel de 3D-structuur behoudt om voldoende ruimte te bieden voor PDO-vorming.
   6. Draai de plaat om zodat deze met het deksel omhoog staat en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.

2. Behandelingen en toevoeging van fluorescerende kleurstoffen voor multiplexing

1. Terwijl BME-koepels stollen in de platen met 96 putjes, bereidt u verdunningen voor van fluorescerende reagentia voor beeldvorming van levende cellen. Hierin worden specifieke parameters gegeven voor het multiplexen van Annexine V Red Dye en Cytotox Green Dye.
2. Bereiding van fluorescerend reagens (dag -1): Bereken het juiste volume organoïdekweekmedia op basis van het aantal te behandelen putjes, ervan uitgaande dat elk putje zal worden behandeld met 100 μL kleurstofgedoseerde media. Verdun de kleurstof in voorverwarmde organoïde-kweekmedia tot de gewenste concentratie.
   OPMERKING: De totale hoeveelheid media die nodig is, is afhankelijk van het experiment. Voeg 10% toe aan het uiteindelijke volume om rekening te houden met pipetteerfouten. Om bijvoorbeeld de binnenste 60 putjes van een plaat met 96 putjes te behandelen, bereidt u 6,6 ml kleurstofgedoseerde media (tabel 1).
3. Behandel elk putje met 100 μL 2x kleurstofgedoseerde organoïde kweekmedia. Voeg 200 μL steriele 1x PBS toe aan de buitenste lege putjes van de plaat. Incubeer bij 37 °C gedurende een nacht.
   OPMERKING: PBS in de perifere putten vermindert de verdamping van media uit de binnenste putten.
4. Toevoeging van geneesmiddelen/behandelingsmiddelen (dag 0): Bereid geneesmiddelen in voorverwarmde organoïdekweekmedia in een concentratie van 2x in een volume van 100 μL per putje.
   OPMERKING: DMSO kan bij hoge concentraties giftig zijn voor cellen. Een concentratie van 0,1% DMSO wordt niet overschreden in de experimenten die in dit onderzoek zijn uitgevoerd. Naast medicijnen worden sommige fluorescerende reagentia gedistribueerd als een DMSO-oplossing. Het is belangrijk om rekening te houden met de totale DMSO-concentratie bij het werken met dergelijke reagentia.
5. Voeg 100 μL 2x kleurstofgedoseerde media toe aan elk putje; Vermijd het creëren van bubbels.

3. Beeldvormingsparameters instellen

1. Plaats de plaat in Cytation 5. Openen Gen5-software. Klik op Nieuwe taak > handmatige modus Imager. Selecteer Nu vastleggen en voer de volgende instellingen in: Objectief (selecteer de gewenste vergroting); Filter (selecteer microtiterplaat); Microplaatformaat (selecteer het aantal putjes); en Scheepstype (selecteer plaattype). Klik op Deksel gebruiken en Lagere dragersnelheid gebruiken. Klik op OK.
   OPMERKING: Tanktype: Wees zo specifiek mogelijk bij het selecteren van informatie over de plaat, omdat de software is gekalibreerd op de specifieke afstand van het objectief tot de onderkant van de plaat voor elk plaattype en elke dikte van het plastic.
   Lagere dragersnelheid: Selecteer dit vakje om te voorkomen dat koepels worden verstoord bij het laden/lossen van platen.
2. Maak een Z-Stack die de hele BME-koepel in beeld brengt.
   1. Selecteer een bron die u wilt bekijken (linkerdeelvenster, onder histogram).
   2. Selecteer het Bright Field-kanaal (linkerpaneel, boven). Klik op Automatisch blootstellen en pas de instellingen naar wens aan.
   3. De onder- en bovenkant van de Z-stapel instellen: Vouw het tabblad Beeldmodus uit (linkerdeelvenster, midden). Vink het vakje Z-Stack aan. Gebruik de pijlen voor het aanpassen van de koers (linkerdeelvenster, midden) en klik op de neerwaartse aanpassing totdat alle BOB's in en uit focus zijn gekomen en wazig zijn. Stel dit in als de onderkant van de Z-Stack. Herhaal dit in de tegenovergestelde richting met behulp van de pijlen voor het aanpassen van de koers om de bovenkant van de Z-stapel in te stellen.
   4. Om er zeker van te zijn dat de instellingen van de Z-Stack geschikt zijn voor andere interessante bronnen, selecteert u een andere put (linkerpaneel, onder histogram) en visualiseert u de boven- en onderkant van de Z-Stack.
   5. Om de brandpuntsafstanden handmatig in te voeren, klikt u op de drie puntjes naast de fijnafstelling (linkerpaneel, boven). Er wordt een venster geopend; typ de bovenste Z-Stack-waarde (te vinden in het linkerdeelvenster, in het midden, onder Imaging Mode). Herhaal dit voor de onderste Z-Stack-waarde. Pas indien nodig aan om het gewenste Z-bereik vast te leggen door stap 3.2.3 te herhalen. Als er aanpassingen nodig waren, selecteer dan een ander putje om de instellingen te controleren.
3. Stel de belichtingsinstellingen voor de fluorescentiezender(s) in. De instellingen worden beschreven voor twee fluorescentiekanalen (GFP en TRITC). Het specifieke aantal fluorescerende kanalen hangt af van het experiment en welke fluorescerende kubussen in het live-cell beeldvormingssysteem zijn geïnstalleerd.
   OPMERKING: Als wordt verwacht dat de signaalintensiteit aan het einde van het experiment aanzienlijk hoger zal zijn, moeten gebruikers overwegen testexperimenten uit te voeren om de optimale belichtingsinstellingen aan het einde van het experiment te bepalen die vervolgens kunnen worden toegepast bij het instellen van de initiële parameters.
   1. Vouw het tabblad Beeldmodus uit (linkerdeelvenster, midden) en open Bewerkingsstap. Er verschijnt een pop-upvenster.
   2. Klik onder Kanalen op de bubbel voor het gewenste aantal kanalen. Wijs één kanaal aan voor een helder veld en extra kanalen voor elk fluorescerend kanaal. In dit voorbeeld is Kanaal 1 = Helder veld; Kanaal 2 = GFP; Kanaal 3 = TRITC. Selecteer met behulp van de vervolgkeuzemenu's Kleur de juiste instelling voor elk kanaal. Sluit het bewerkingsvenster door op OK te klikken.
   3. Stel elk fluorescerend kanaal in.
      1. Schakel het kanaal naar GFP (linkerpaneel, boven).
      2. Klik op Automatisch blootstellen (linkerdeelvenster, boven). Vouw het tabblad Belichting uit (linkerdeelvenster, midden) en pas de belichtingsinstellingen aan om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
      3. Kopieer de belichtingsinstellingen naar het tabblad Beeldmodus volgens de stappen 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Klik op het pictogram Kopiëren naast het vak Afbeeldingsstap bewerken . Klik op Afbeeldingsstap bewerken, waardoor een ander venster wordt geopend.
      5. Klik onder het GFP-kanaal op het pictogram Klembord op de regel Belichting om de instellingen voor Verlichting, Integratietijd en Cameraversterking aan het kanaal toe te voegen.
      6. Herhaal stap 3.3.3.4-3.3.3.5 voor het TRITC-kanaal. Klik op OK om het venster te sluiten.
4. Stel de stappen voor beeldvoorbewerking en Z-projectie in om de voorbewerking van afbeeldingen te automatiseren.
   1. Klik op het camerapictogram (linkerpaneel, benedenhoek). Er wordt een nieuw venster geopend.
   2. Klik onder Verwerkingsstap toevoegen (linkerdeelvenster, onderaan) op Beeldvoorbewerking. Er wordt een nieuw venster geopend.
   3. Schakel op het tabblad Helder veld de optie Beeldvoorbewerking toepassen uit.
   4. Zorg ervoor dat voor elk tabblad Fluorescerend kanaal de optie Beeldvoorbewerking toepassen is geselecteerd. Schakel Dezelfde opties gebruiken als kanaal 1 uit en klik op OK. Het venster wordt gesloten.
   5. Klik onder Verwerkingsstap toevoegen op Z-projectie. Er wordt een nieuw venster geopend. Pas desgewenst het slicebereik aan (bijv. om het Z-bereik te verkleinen). Sluit het venster door OK te selecteren.
5. Maak een protocol.
   1. Klik op Afbeeldingenset in de knoppenbalk. Klik in het dropdown-menu op Experiment maken op basis van deze afbeeldingenset. Het beeldvormingsvenster wordt gesloten en het procedurevenster wordt geopend.
      OPMERKING: De parameters die in de handmatige modus van Imager zijn geselecteerd, worden automatisch in het nieuwe venster geladen, waardoor een experimenteel protocol kan worden gemaakt.
   2. De temperatuur en helling instellen: Klik op 'Stel temperatuur in ' onder het kopje 'Acties ' (links). Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer Incubator aan en voer handmatig de gewenste temperatuur in onder Temperatuur. Voer vervolgens onder Verloop handmatig 1 in. Sluit het venster door OK te selecteren.
      NOTITIE: Door een gradiënt van 1 °C te creëren, wordt condensvorming op het deksel van de plaat voorkomen.
   3. Wijs putten aan de afbeelding aan.
      1. Dubbelklik op de afbeeldingsstap onder Beschrijving. Klik op Volledige plaat (rechterhoek, boven). Hierdoor wordt het venster Plaatlay-out geopend.
      2. Markeer interessante bronnen met behulp van de cursor. Klik op OK. Vink desgewenst de vakjes Autofocus Binning en Capture Binning aan. Klik op OK om het venster te sluiten.
         OPMERKING: Bij het samenvoegen van de binning moet de belichting worden aangepast, zoals beschreven in stap 3.3.3.2 hierboven. Raadpleeg de sectie Discussie voor specifieke scenario's waarin deze functie kan worden gebruikt.
   4. Stel intervallen in voor kinetische beeldvorming.
      1. Klik op Opties onder het kopje Overig (links). Vink het vakje Discontinuous Kinetic Procedure aan.
      2. Voer onder Geschatte totale tijd de uitvoeringstijd voor het experiment in (bijvoorbeeld 5 dagen). Voer onder Geschat interval het interval in om de plaat af te beelden (bijv. elke 6 uur).
      3. Klik op Pauzeren na elke run om de plaat de tijd te geven om naar de couveuse te worden overgebracht. Sluit het venster door OK te selecteren.
   5. Werk de stappen voor gegevensreductie bij.
      1. Klik op OK om het procedurevenster te sluiten. Er wordt een tabblad geopend om de stappen voor gegevensreductie bij te werken. Selecteer Ja. Dubbelklik op Beeldvoorbewerking. Klik door de verschillende kanalen om de instellingen te controleren en klik op OK.
      2. Dubbelklik op Z-projectie. Klik door de verschillende kanalen om de instellingen te controleren. Klik op OK. Klik vervolgens nogmaals op OK om het venster Gegevensreductie te sluiten.
   6. Formatteer de plaatlay-out.
      1. Open de wizard Plaatlay-out en wijs puttypen aan volgens de stappen 3.6.2-3.6.3.
      2. Klik op het pictogram Plaatlay-out in de werkbalk (linkerhoek, boven) om de wizard Plaatlay-out te openen.
      3. Vink de vakjes aan naast de puttypen die in het experiment zijn gebruikt. Voer onder Besturingselementen voor analyse het aantal verschillende besturingstypen in met behulp van de pijlen. Klik op Volgende om het venster Assay Control #1 te openen.
      4. Stel de toestand van de analyseboorput in volgens de stappen 3.6.5-3.6.8.
      5. Voer in het venster Assay Control #1 het controlelabel in het vak Plate Layout ID in. Voer desgewenst de volledige naam in het vak ernaast in. Selecteer het aantal replicaten voor de betreffende controleconditie met behulp van de pijlen.
      6. Als u meerdere concentraties of een verdunningsreeks gebruikt binnen de controle, klikt u op Verdunningen/concentraties definiëren en gebruikt u het vervolgkeuzemenu om het type te selecteren. Voer de waarden voor elke concentratie/verdunning in de tabel in.
         OPMERKING: De automatische functie kan worden gebruikt als de concentraties met een constante toename veranderen.
      7. Selecteer het tabblad Kleur in de werkbalk. Kies de gewenste tekstkleur en achtergrondkleur voor controle in het vervolgkeuzemenu. Klik op Volgende.
      8. Herhaal indien nodig met extra bedieningselementen.
      9. Stel de toestand van de monsterput in volgens de punten 3.6.10-3.6.12.
      10. Voer op de pagina Voorbeeldinstellingen het voorvoegsel van de voorbeeld-id in (bijvoorbeeld SPL). Selecteer het aantal replicaten met behulp van de pijlen. Als u monsters met verschillende behandelingsconcentraties gebruikt, selecteert u Concentraties of Verdunningen in het vervolgkeuzemenu Type . Voer verdunningen/concentraties in de tabel in en voer eenheden in het vak Eenheid in.
      11. Selecteer Identificatievelden in de werkbalk. Voer de gewenste categorienaam/-namen (bijv. monster-ID, geneesmiddel) in de tabel in.
      12. Selecteer het tabblad Kleur in de werkbalk. Selecteer een andere kleur voor elke behandelingsgroep/monster. Klik op Voltooien. Hierdoor wordt de pagina Plaatlay-out geopend.
          OPMERKING: De nummers aan de linkerkant komen overeen met de verschillende voorbeeldnummers.
      13. Wijs voorbeeld-id's toe volgens de stappen 3.6.14-3.6.16.
      14. Selecteren SPL1 in het linkerpaneel. Gebruik de cursor om putten te selecteren.
          OPMERKING: Autoselect-tools kunnen worden aangepast in het vak voor seriële toewijzing. Het aantal replica's en de oriëntatie van de lay-out kunnen vooraf worden aangewezen.
      15. Herhaal dit met andere voorbeelden om de plaatlay-out te voltooien. Als u tevreden bent, klikt u op OK.
      16. Selecteer op de werkbalk Bestand de optie Voorbeeld-id's. Vul de kolommen Monster-ID in met de juiste informatie voor elk monster (bijv. medicijntype). Druk op OK.
   7. Sla het protocol op.
      1. Klik in de knoppenbalk op Bestand > Protocol opslaan als. Selecteer de locatie om het bestand op te slaan. Voer een bestandsnaam in. Klik op Opslaan om het venster te sluiten.
      2. Klik op Bestand > Afsluiten in de knoppenbalk. Er wordt een tabblad geopend om wijzigingen in de handmatige modus van Imager op te slaan. Selecteer Nee.
      3. Er wordt een tabblad geopend om wijzigingen in Experiment 1 op te slaan. Selecteer Nee. Er wordt een tabblad geopend om de protocoldefinitie bij te werken. Selecteer Bijwerken. Sluit de software.
6. Importeer het protocol in BioSpa OnDemand en voltooi het instellen van het experiment.
   1. Open de BioSpa OnDemand (planningssoftware) software.
   2. Selecteer een beschikbaar slot in de software.
   3. Verwijder de plaat van het beeldvormingssysteem met levende cellen. Klik op Lade openen om toegang te krijgen tot de juiste sleuf in de planningssoftware en plaats de plaat. Klik op Lade sluiten.
      OPMERKING: Deze stap kan op elk moment worden uitgevoerd nadat het protocol is gemaakt in stap 3.5.7 hierboven. De plaat moet zich echter in de Cytatie 5 bevinden om een timingrun uit te voeren in de onderstaande stap 3.6.4.3.
   4. Importeer het protocol.
      1. Selecteer op het tabblad Procedure-informatie de optie Gebruiker in het vervolgkeuzemenu. Klik naast de sleuf Protocol op Selecteren > Een nieuw item toevoegen.
      2. Klik naast de protocolsleuf op Selecteren. Dit opent een nieuw venster om naar het gewenste protocol in de bestandsarchitectuur te navigeren. Klik op Openen om het protocol in de planningssoftware te importeren.
      3. Voer de hoeveelheid tijd in die nodig is om de plaat af te beelden. Klik op OK om het venster Gen5 Protocol List te sluiten.
         OPMERKING: Deze stap is vooral belangrijk wanneer u meerdere experimenten tegelijk uitvoert. Als u de tijd wilt bepalen die nodig is om de afbeelding te maken, klikt u op Nu een timingrun uitvoeren. Klik op OK.
   5. Stel beeldvormingsintervallen in en plan het experiment.
      1. Voer onder Interval het beeldvormingsinterval in dat is aangegeven in stap 3.5.4.
      2. Selecteer onder Opties voor starttijd de optie Indien beschikbaar. Selecteer onder Duur de optie Vast of Doorlopend.
         OPMERKING: Er kan een specifieke starttijd worden aangewezen in plaats van het protocol op de eerstvolgende beschikbare tijd uit te voeren. Als u Vaste duur selecteert, wordt een specifiek eindpunt voor het experiment ingesteld en moet de gebruiker een experimenteel tijdsbestek aanwijzen. Met Continue duur kan het experiment worden uitgevoerd zonder eindpunt en kan het alleen worden beëindigd door een gebruiker die het experiment stopt.
      3. Klik op Schema plaat/vaartuig. Hierdoor wordt de plaatvalidatiesequentie geopend. Er wordt een tabblad geopend met de voorgestelde eerste leestijd. Klik op Ja om dit schema te accepteren.

4. Beeldanalyse in Gen5-software (Figuur 2)

1. Open de module Beeldanalyse.
   1. Open Gen5. Selecteer in Taakbeheer de optie Experimenten > Openen. Selecteer het experiment om het bestand te openen. Klik op 'Plaat> 'Weergave' in de knoppenbalk.
   2. Wijzig het vervolgkeuzemenu Gegevens in Z-projectie. Dubbelklik op een bron die u interesseert. Selecteer Analyseren > ik een nieuwe stap voor het verminderen van beeldanalysegegevens wil instellen. Klik op OK.
2. Cellulaire analyse
   1. Primair masker
      1. Selecteer onder Analyse-instellingen de optie Type: Cellulair analyse- en detectiekanaal: ZProj[Tsf[Helder veld]] (linkerdeelvenster, midden).
      2. Klik op Opties. Hiermee wordt de pagina Primair masker en aantal geopend. Schakel in het vak Drempel Automatisch het selectievakje Automatisch in en klik op Toepassen. Klik op het vak Objecten markeren (rechterdeelvenster, onderaan) om objecten binnen de aangewezen drempelwaarde weer te geven. Pas indien nodig aan om interessante objecten op te nemen.
         OPMERKING: Drempelinstellingen zijn gebaseerd op pixelintensiteit. Als de drempelwaarde bijvoorbeeld is ingesteld op 5000, worden pixels met een intensiteit van meer dan 5000 opgenomen in de analyse.
      3. Geef onder Objectselectie de minimale en maximale objectgrootte (μm) aan. Pas indien nodig aan om cellulair afval/afzonderlijke cellen uit te sluiten.
         NOTITIE: De grootte van de BOB kan aanzienlijk variëren tussen verschillende modellen en typen. Gebruik het meetinstrument in de Gen5-software om de minimale en maximale BOB-groottedrempels voor elk model te bepalen. Gebruikers kunnen een kleinere minimale drempelwaarde voor de BOB-grootte kiezen ten opzichte van de waarde die door het meetinstrument wordt geleverd om te voorkomen dat BOB-fragmenten op latere tijdstippen na de medicamenteuze behandeling worden uitgesloten.
      4. Als u de analyse wilt beperken tot een bepaald gebied van de put, schakelt u het aankruisvak 'Analyseer volledige afbeelding ' uit en klikt u op 'Stekker'. Gebruik in het venster Afbeeldingsplug het vervolgkeuzemenu om Plugvorm te selecteren. Pas de grootte- en positieparameters indien nodig aan het gewenste gebied aan.
         OPMERKING: Het is belangrijk om het aantal BOB's in de stekker te maximaliseren en tegelijkertijd PDO-vrije gebieden uit te sluiten om de achtergrond te minimaliseren. Wijs een pluggrootte aan die consequent de meerderheid van de interessante objecten in replicaten vastlegt. Het genereren van een plug die ook de randen van de koepel uitsluit, is belangrijk omdat het alle objecten uitsluit die vervormd kunnen lijken als gevolg van de breking van licht door de extreme kromming van de koepel rond de randen. Objecten aan de primaire rand kunnen ook worden uitgeschakeld om alleen volledige BOB's in de plug vast te leggen.
   2. Analyse van subpopulaties. Een voorbeeld van de aanwijzing van een subpopulatie is weergegeven in figuur 3.
      1. Klik op Berekende statistieken in de werkbalk Cellulaire analyse. Klik op Interessante statistieken op objectniveau selecteren of maken (rechterhoek, onderaan). Selecteer onder Beschikbare objectstatistieken de gewenste statistieken (bijvoorbeeld circulariteit) en klik op de knop Invoegen. Klik op OK.
         OPMERKING: De morfologie en dichtheid van elk BOB-model bepalen de beste maatstaven die van belang zijn om de subpopulatie te onderscheiden.
      2. Klik op Subpopulatieanalyse in de werkbalk Mobiele analyse . Klik op Toevoegen om een nieuwe subpopulatie te maken. Er wordt een pop-upvenster geopend.
      3. Voer desgewenst een naam in voor de subpopulatie. Selecteer onder Objectstatistieken een interessante statistiek en druk op Voorwaarde toevoegen. Voer in het venster Voorwaarde bewerken parameters in voor de gekozen objectmetrie. Herhaal dit indien nodig met aanvullende statistieken.
         NOTITIE: Parameters kunnen handmatig worden aangepast of worden ingesteld met behulp van de zoeker. Om bijvoorbeeld vuil uit te sluiten, kunnen gebruikers Gebied toevoegen als een objectstatistiek en objecten selecteren die kleiner zijn dan 800. Circulariteit als objectmetriek wordt routinematig gebruikt en alle objecten met een circulariteit groter dan 0,2-0,5 worden opgenomen, afhankelijk van het model.
      4. Controleer in de tabel onder aan het venster de gewenste resultaten die u wilt weergeven. Klik op OK > Toepassen.
      5. Als u de objecten in de subpopulatie wilt weergeven, gebruikt u het vervolgkeuzemenu Objectdetails (rechterdeelvenster, midden) om de subpopulatie te selecteren. Objecten die binnen de parameters vallen, worden in de afbeelding gemarkeerd.
         OPMERKING: Als u de markeringskleuren van het primaire masker en de subpopulatie wilt wijzigen, klikt u op Instellingen (rechterdeelvenster, onderaan).
      6. Als u de parameters van de subpopulatie wilt aanpassen, opent u het venster Subpopulatieanalyse opnieuw op de werkbalk 'Mobiele analyse '. Selecteer de subpopulatie en klik op Bewerken. Klik op Stap toevoegen.
         OPMERKING: Hiermee wordt dezelfde analyse toegepast op alle putten binnen het experiment op alle tijdstippen. In het vervolgkeuzemenu op de Matrix-pagina kunnen verschillende statistieken worden geselecteerd voor individuele weergave.

5. Gegevens exporteren van Gen5 naar Excel

1. Als u een gegevensbestand wilt aanpassen voor export, selecteert u het pictogram Rapport-/exportbouwers in de werkbalk. Klik in het pop-upvenster op Nieuwe export naar Excel.
2. Selecteer op de pagina Eigenschappen van het pop-upvenster de optie Bereik > plaat en Inhoud > Aangepast. Klik op de optie Inhoud in de werkbalk. Klik op Sjabloon bewerken, waardoor het Excel-programma wordt geopend.
3. Selecteer in de spreadsheet Invoegtoepassingen > tabel > putgegevens. Plaats de muisaanwijzer op de verschillende selecties om opties voor export te zien. Selecteer de gewenste statistiek (bijv. Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   OPMERKING: De plaatlay-out kan worden toegevoegd aan de spreadsheetanalysesjabloon door Invoegtoepassingen > Protocoloverzicht > Lay-out te selecteren.
4. Er wordt een venster Bewerken geopend. Wijs in het vak Wells de putten aan voor export door Well-ID of Well #. Selecteer OK. Er wordt een sjabloon in het spreadsheetbestand geladen. Spreadsheet sluiten. Het sjabloon wordt automatisch opgeslagen.
5. Klik op OK in het venster Nieuwe export naar Excel en sluit het venster Rapport/Constructeurs exporteren .
6. Klik op het pictogram Exporteren in de Gen5-werkbalk. Vink het vakje naast het gewenste exportbestand aan. Klik op OK. Gen5 vult automatisch de spreadsheetsjabloon in en opent het bestand in Excel.

6. Externe data-analyse

1. Open het Bestand exporteren (.xlsx) in Excel.
2. Deel voor elk putje elke afzonderlijke waarde door de 0:00-tijdpuntwaarde voor dat putje. Hiermee wordt tijdstip 0 gelijk aan 1 ingesteld, en elke waarde daarboven is relatief ten opzichte van de eerste meting.
3. Open een nieuw bestand in de data-analysesoftware. Selecteer de optie XY-lay-out .
   OPMERKING: In dit protocol werd GraphPad Prism (versie 9.5.1) gebruikt.
4. Invoerlabels voor elke gegevensgroep. Kopieer en plak de tijdstippen en bijbehorende genormaliseerde waarden voor elke behandelingsgroep in de Prisma-tabel. Een grafiek voor de gegevens wordt automatisch gegenereerd en is te vinden onder Grafieken.

Representative Results

Ons doel was om de haalbaarheid aan te tonen van het gebruik van gemultiplexte beeldvorming van levende cellen om de therapeutische respons van PDO's te beoordelen. Proof of concept-experimenten werden uitgevoerd in twee afzonderlijke BOB-modellen van endometriumkanker: ONC-10817 en ONC-10811 (zie aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor ONC-10811-gegevens). Apoptose (annexine V-kleuring) en cytotoxiciteit (opname van Cytotox Green) werden kinetisch gecontroleerd als reactie op het apoptose-inducerende middel, staurosporine. In het bijzonder werden BOB's geplateerd in platen met 96 putjes, behandeld met de kleurstoffen Annexine V Red en Cytotox Green, en 's nachts in een incubator van 37 °C geplaatst, zoals weergegeven in figuur 1. We hebben in twee onafhankelijke BOB-modellen bevestigd dat behandeling met Annexine V en Cytotox Green kleurstoffen niet toxisch is (aanvullende figuur 2). De volgende dag werden BOB's behandeld met toenemende concentraties staurosporine (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Vervolgens werden protocollen opgesteld in de Gen5-software en werden experimenten uitgevoerd over een periode van 5 dagen, waarbij elke 6 uur beeldvorming werd uitgevoerd. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Cellular Analysis-functie in de Gen5-software, zoals beschreven in sectie 4 van het protocol. Het primaire masker is ingesteld met behulp van de automatische drempelfunctie met "Splitsen van aanraakobjecten" niet aangevinkt en met grootteparameters van minimum: 30 μm en maximum: 1000 μm. De BOB-subpopulatie werd gedefinieerd door circulariteit > 0,25. De objectgemiddelde intensiteiten in de TRITC- (annexine V, apoptose) en GFP-kanalen (Cytotox Green, cytotoxiciteit) binnen de aangewezen BOB-subpopulatie werden geëxporteerd als een .xlsx bestand voor verdere analyse. De objectgemiddelde intensiteit voor elke put op elk tijdstip in zowel de GFP- als de TRITC-kanalen werd genormaliseerd naar tijd 0. Genormaliseerde fluorescentiegegevens werden vervolgens overgebracht naar een Prisma-bestand en gevisualiseerd als een lijnplot.

Behandeling met staurosporine resulteerde in een significante, dosisafhankelijke toename van apoptose en een afname van de celgezondheid in de loop van de tijd in vergelijking met voertuigcontrole, zoals blijkt uit de toename van de objectgemiddelde intensiteit in zowel de TRITC- (annexine V) als de GFP-kanalen (Cytotox) (Figuur 4, Figuur 5, Aanvullende video 1, Aanvullende video 2, Aanvullende video 3, Aanvullende video 4, aanvullende video 5, aanvullende video 6 en aanvullende video 7). De doses van 500 nM, 100 nM en 10 nM staurosporine resulteerden elk in een statistisch significante toename van zowel apoptose als cytotoxiciteit in de loop van de tijd (Figuur 5A-C) en aan het einde van het experiment (Figuur 5E,F). Bovendien remde staurosporine de groei en vorming van BOB's effectief bij deze concentraties, zoals blijkt uit een algemene afname van het totale BOB-oppervlak, terwijl de controleputten een toename van het totale BOB-oppervlak vertoonden (Figuur 4 en Figuur 5D).

Omdat een groot voordeel van beeldvorming van levende cellen de mogelijkheid is om te corrigeren voor variabiliteit in plating, hebben we een experiment uitgevoerd waarbij de levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld als een eindpuntmaatstaf. Proof-of-concept eindpunttestgegevens werden verzameld met behulp van een PDO-model dat werd gegenereerd uit een van de patiënt afgeleid xenotransplantaat van prostaatkanker. Aan het begin van de behandelingsperiode (dag 0) werden helderveldbeelden verzameld, gevolgd door toevoeging van een dubbel kleurstofreagens dat zowel de levensvatbaarheid (acridine oranje, AO) als de celdood (propidiumjodide, PI) meet. De AO-component zendt een groen fluorescerend signaal uit bij binding aan dubbelstrengs DNA, een indicator van de levensvatbaarheid van cellen. De PI-component kleurt dode cellen met een kern en kan worden gebruikt om celdood te kwantificeren als reactie op behandeling. Om rekening te houden met de variabiliteit in PDO-beplating, hebben we een methode bedacht om het aantal BOB's per put op tijdstip 0 te bepalen door helderveldbeelden om te zetten in digitale fasecontrastbeelden (aanvullende figuur 3 en aanvullend bestand 1).

Prostaatkanker BOB's werden gedurende 7 dagen behandeld met daunorubicine, een chemotherapiemiddel dat celdood veroorzaakt. Na voltooiing van het experiment werden monsters gekleurd met AOPI zoals beschreven in aanvullend dossier 1, gevolgd door analyse van fluorescerende beelden in Gen5. Figuur 6A toont een panel met beelden van de AOPI-eindpunttest op dag 7. Bij vergelijking van met vehiculum behandelde BOB's (rij één) met BOB's behandeld met 10 μM daunorubicine (rij twee), was er een duidelijke afname van groene fluorescentie (maat voor levensvatbaarheid, kolom twee) en een toename van rode fluorescentie (maat voor celdood, kolom drie). Deze resultaten werden vervolgens gekwantificeerd in figuur 6B, waar we de reeks uitlezingen laten zien die kunnen worden bereikt met behulp van de AOPI-eindpuntkleuringstechniek. De grafiek linksboven toont de levensvatbaarheidsmeting die is gegenereerd op basis van de AO-kleuring, genormaliseerd naar het aantal PDO's dat is bepaald door Digital Phase Contrast-beeldanalyse van elk putje op dag 0. Deze gegevens correleren met het visuele resultaat van figuur 6A, waarbij naarmate de concentratie daunorubicine toenam, de levensvatbaarheid drastisch afnam. Dit wordt verder samengevat in de grafiek rechtsboven, die een toename van de celdood laat zien, aangegeven door een toename van de rode fluorescentie die is verkregen met de PI-kleuring.

De PI-gegevens werden vervolgens gecombineerd met de levensvatbaarheidsmeting (AO) om een Viable to Dead Ratio te berekenen (Figuur 6B, grafiek linksonder). Deze verhouding is een nuttige benadering om te bepalen of een medicijn cytostatisch of cytotoxisch is. In het bijzonder zal een cytotoxisch medicijn veel dichter bij 0 komen dan een cytostatisch medicijn vanwege het feit dat een medicijn dat cytostatisch is, de groei remt, maar mogelijk geen celdood induceert. Ten slotte kan het oppervlak van de BOB's nauwkeurig worden berekend met behulp van de groene fluorescentie van de AO-kleuring, zelfs wanneer BOB's celdood en blebbing ondergaan. De grafiek rechtsonder toont het gemiddelde BOB-areaal, dat werd berekend als de som van het gebied dat in de subpopulatieanalyse werd aangeduid, gedeeld door het BOB-nummer. Analyse van het gebied kan verdere indicatie geven of een behandeling alleen de groei van de BOB remt of daadwerkelijk BOB-regressie veroorzaakt. Merk op dat de analyse van het gemiddelde BOB-gebied werd uitgevoerd met behulp van het GFP-kanaal en de functie Cellulaire analyse, in tegenstelling tot figuur 5D, die de helderveldbeelden gebruikte om het totale BOB-oppervlak te berekenen. Deze gegevens benadrukken de flexibiliteit van de analysepijplijn, afhankelijk van de beschikbaarheid van gegevens en de interesse van de gebruiker.

Ten slotte hebben we de gouden standaard voor levensvatbaarheidsmetingen, CellTiter-Glo 3D, vergeleken met de levensvatbaarheidsfluorescentiemeting met behulp van AOPI (Figuur 6C). Houd er rekening mee dat de gegevens in dit paneel niet zijn genormaliseerd naar het BOB-nummer 0, aangezien deze normalisatie doorgaans niet wordt uitgevoerd door laboratoria die de CellTiter-Glo 3D-kit gebruiken. We zagen dezelfde trend voor het geneesmiddeleffect in beide testen, waarbij de levensvatbaarheid van de PDO afnam naarmate de daunorubicineconcentratie toenam. Het enige visuele verschil tussen deze uitlezingen was dat de CellTiter-Glo 3D-analyse een IC50 bereikte vóór de AOPI-analyse en bijna volledig 0 bereikte. Dit resultaat kan worden verklaard door het werkingsmechanisme van daunorubicine. Daunorubicine is een topoisomerase-II-remmer die dubbelstrengs DNA-breuken introduceert, wat leidt tot stilstand van de celcyclus en uiteindelijk apoptose¹⁴. Tijdens het stoppen van de celcyclus kan ATP-uitputting optreden¹⁵. Gezien het feit dat de CellTiter-Glo 3D-test gebaseerd is op een ATP-luciferasereactie om een luminescentiesignaal te genereren, veronderstellen we dat de sterkere vermindering van de levensvatbaarheid van cellen bij hogere concentraties daunorubicine te wijten was aan ATP-depletie in plaats van volledige celdood. Ter ondersteuning van dit idee tonen de afbeeldingen in figuur 6A een populatie die in BOB's in de cultuur leeft, zoals aangegeven door groene fluorescentie.

Figuur 1: Overzicht van het plating-, beeldvormings- en analyseprotocol. BOB's worden geplateerd in een plaat met 96 putjes en behandeld met fluorescerende kleurstoffen en medicijnen. Beeldvormingsparameters voor het experiment (bijv. Belichting, Z-stack) worden gemaakt in de Gen5-software. Beelden worden verkregen door de Cytation 5 en verwerkt in Gen5, en gegevens worden geëxporteerd voor verdere analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 2: Overzicht van de functie Cellulaire analyse. 1: Stekker aanwijzen: Een stekker is bedoeld om interessegebieden op te nemen. 2: Primair masker instellen: Het primaire masker definieert objecten die van belang zijn op basis van grootte en pixelintensiteit in een kanaal naar keuze. In deze representatieve afbeelding worden objecten die in het primaire masker zijn opgenomen, paars omlijnd. 3: Subpopulatie definiëren: Er kan een extra subpopulatie worden gedefinieerd om de gewenste populatie voor analyse verder te verfijnen. De subpopulatie in de voorbeeldafbeelding (geel omlijnd) is gedefinieerd op basis van circulariteit (>0,25) en oppervlakte (>800). Afbeeldingen zijn verkregen met een 4x objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Voorbeelden van het maskeren van subpopulaties met behulp van de functie Cellulaire analyse. Subpopulaties worden gedefinieerd in het heldere veldkanaal. De subpopulatie in de voorbeeldafbeeldingen (geel omlijnd) is gedefinieerd op basis van circulariteit (>0,25) en oppervlakte (>800). Afbeeldingen zijn verkregen met een 4X-objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Behandeling met staurosporine resulteert in een dosisafhankelijke toename van apoptose en cytotoxiciteit. Heldere veldbeelden (4x objectief) met GFP- en TRITC-fluorescentie-overlay worden getoond voor de doses van 500 nM, 10 nM en 0,1 nM staurosporine op 3 tijdstippen: 0 uur, 54 uur, 114 uur. Het rode fluorescerende signaal duidt op apoptose (annexine V) en het groene fluorescerende signaal op cytotoxiciteit (Cytotox). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Meervoudige fluorescerende beeldvorming van levende cellen om de PDO-respons te beoordelen. BOB-model ONC-10817 werd geplateerd in platen met 96 putjes en 's nachts bij 37 °C geïncubeerd met kleurstoffen Annexine V Red (1:400) en Cytotox Green (200 nM). De volgende dag werden BOB's behandeld met toenemende concentraties staurosporine en werden ze gedurende ~5 dagen elke 6 uur in beeld gebracht. (A,B) Tijd- en dosisafhankelijke toename van (A) cytotoxiciteit of (B) apoptose als reactie op staurosporine. Gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteit van het object in het GFP- of TRITC-kanaal. (C) Vergelijking van het tijdsverloop van apoptose en cytotoxiciteit in reactie op 100 nM of 500 nM staurosporine. De gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteitswaarden van het object in de GFP- en TRITC-kanalen. (D) Staurosporine remt de groei van BOB's. De gegevens werden uitgezet als het gemiddelde totale BOB-areaal. Gegevens in A-D werden genormaliseerd naar het PDO-getal op tijdstip 0 uur in elke put en uitgezet als de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM). N=5 technische replicaten per behandeling. p < 0,0001 vs. voertuigbesturing door 2-weg ANOVA. (E) Representatieve helderveld-, GFP- en TRITC-beelden van 500 nM staurosporine-behandelde BOB's versus vehiculum aan het einde van het experiment (114 uur). Afbeeldingen zijn verkregen met een 4x objectief. (F) Kwantificering van cytotoxiciteit, apoptose en levensvatbaarheid op het tijdstip van 114 uur. GFP Object Mean Intensity (links) en TRITC Object Mean Intensity (midden) werden berekend op het tijdstip van 114 uur met behulp van de resultaten van panelen A-C. De levensvatbaarheid (rechts) werd beoordeeld met behulp van het CellTiter-Glo 3D-reagens volgens het protocol van de fabrikant. Ruwe luminescentiewaarden (RLU) werden genormaliseerd naar het totale BOB-oppervlak op tijdstip 0 uur en uitgezet als de levensvatbaarheid van de vouw ten opzichte van de voertuigbesturing, die was vastgesteld op 1,0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 vs. voertuigbesturing via eenrichtings-ANOVA met Dunnett's post-hoc test. N = 5 technische replicaten per behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Gebruik van beeldvorming van levende cellen om te helpen bij de normalisatie van eindpunttestgegevens. BOB's werden behandeld met toenemende concentraties van de topoisomerase-II-remmer, daunorubicine, gedurende 7 dagen. BOB's werden blootgesteld aan AOPI-kleuringsoplossing en afgebeeld zoals beschreven in aanvullend bestand 1. AO = acridine oranje, een maat voor levensvatbaarheid (GFP-kanaal); PI = propidiumjodide, een maat voor celdood (Texas Red channel). (A) Representatieve beelden verkregen met behulp van AOPI-kleuring na 7 dagen behandeling met 10 μM daunorubicine of mediumcontrole (0,1% DMSO). (B) Verschillende uitlezingen met behulp van AOPI-fluorescentie als eindpunt levensvatbaarheid/celdoodmethode. Zie aanvullend dossier 1 voor een gedetailleerde beschrijving van de analysemethoden. Linksboven, analyse van de levensvatbaarheid van de PDO na 7 dagen zoals bepaald door AO-kleuring. Rechtsboven, analyse van celdood door PI-kleuring. Gegevens voor AO- en PI-kleuring werden genormaliseerd naar het BOB-getal op tijdstip 0 uur en vervolgens naar de voertuigcontrole, die werd ingesteld op 1,0, en uitgezet als het gemiddelde en de standaarddeviatie. Linksonder, berekening van de verhouding tussen levensvatbaar en dood met behulp van de gemiddelde objectintegralen voor de AO- en PI-kleuringen. Rechtsonder, oppervlakte van BOB's zoals bepaald door AO-kleuring. Cellulaire analyse werd uitgevoerd in het GFP-kanaal. (C) Vergelijking van twee methoden om de levensvatbaarheid van de BOB te testen. Na beeldvorming werd de levensvatbaarheid geëvalueerd met behulp van het CellTiter-Glo 3D-reagens volgens het protocol van de fabrikant. De vouwoverleving ten opzichte van de controle van het voertuig werd uitgezet bij toenemende concentraties daunorubicine. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde en de standaarddeviatie voor N = 6 technische replicaten per behandeling; De gegevens zijn niet genormaliseerd naar tijd 0 uur in paneel C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Behandeling	# putten	Media Volume	Bijlage		100 μM cytotox
			Verdunning	Volume	Verdunning	Volume
Multiplex	60	6,6 ml	1:400	16,5 μL	200 nM	13,2 μL

Tabel 1: Voorbeeld multiplexing-experiment. Annexine V Red bindt blootgestelde fosfatidylserine op de buitenste blaadel van apoptotische celmembranen. Cytotox Green integreert in cellen met een aangetaste membraanintegriteit en bindt DNA.

Aanvullende figuur 1: Meervoudige beeldvorming van levende cellen van ONC-10811. BOB's werden geplateerd in platen met 96 putjes en 's nachts bij 37 °C geïncubeerd in kleurstoffen Annexine V Red (1:400) en Cytotox Green (200 nM). De volgende dag werden BOB's behandeld met toenemende concentraties staurosporine en werden ze gedurende 5 dagen elke 6 uur in beeld gebracht. (A) Tijds- en dosisafhankelijke toename van cytotoxiciteit als reactie op staurosporine. Gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteit van het object in het GFP-kanaal. (B) Dosis-respons van staurosporine na 114 uur. De gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteitswaarden van het object in het GFP-kanaal op het tijdstip van 114 uur. (C) Tijds- en dosisafhankelijke toename van apoptose als reactie op staurosporine. Gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteit van het object in het TRITC-kanaal. (D) Dosis-respons van staurosporine na 114 uur. De gegevens werden uitgezet als de gemiddelde intensiteitswaarden van het object in het TRITC-kanaal op het tijdstip van 114 uur. Gegevens in A en C werden genormaliseerd naar het BOB-nummer op tijdstip 0 uur op putniveau. N = 5 technische replicaten per behandeling in elk model. p < 0,0001 vs. voertuigbesturing door 2-weg ANOVA. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Behandeling met Annexine V en Cytotox verstoort de levensvatbaarheid van de BOB niet. BOB's werden geplateerd in platen met 96 putjes en 's nachts bij 37 °C geïncubeerd met kleurstoffen Annexine V Red (1:400) en Cytotox Green (200 nM). Na de incubatie van 24 uur werd de levensvatbaarheid beoordeeld met behulp van de CellTiter-Glo 3D-assay volgens het protocol van de fabrikant. (A) Levensvatbaarheid van met kleurstof behandelde en onbehandelde BOB's op het tijdstip van 24 uur. Zowel de waarden van de relatieve lichteenheid (RLU) als de waarden die zijn genormaliseerd naar het BOB-somgebied worden weergegeven. In het bijzonder werd de CellTiter-Glo3D RLU voor elke put genormaliseerd naar de som van het PDO-gebied voor die put op het moment van plateren (d.w.z. onmiddellijk na toevoeging van de kleurstof). Het totale BOB-gebied werd bepaald met behulp van de berekening "Object Sum Area" in Cellular Analysis. N = 10. (B) Levensvatbaarheid van met kleurstof behandelde en onbehandelde BOB's op het tijdstip van 114 uur. Zowel ruwe luminescentiewaarden als waarden die zijn genormaliseerd naar het totale BOB-gebied worden weergegeven. De CellTiter-Glo3D RLU voor elk putje werd genormaliseerd naar de sommatie van het BOB-gebied 24 uur na het plateren, wat overeenkomt met tijd 0 uur in de kinetische beeldvormingsexperimenten. N = 5. Significantie in A en B werd beoordeeld met behulp van een ongepaarde t-toets; P-waarden staan vermeld in de grafieken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Labelvrije analyse van BOB's met behulp van digitaal fasecontrast. Deze afbeelding bevat representatieve beelden (2,5x objectief) die een labelvrije analyse weergeven, zoals beschreven in het aanvullende bestand 1: Beeldvormingsparameters instellen voor een enkele analyse van het beeldvlak (Bright Field/Digital Phase Contrast Images) en Digital Phase Contrast Image-analyse in Gen5-software. (A) Voorbeeld van een helder veldbeeld van een PDXO-model voor prostaatkanker op een enkel brandpuntsvlak. (B) Het heldere veldbeeld in A werd geconverteerd naar een digitaal fasecontrastbeeld. Donkere objecten in het heldere veldbeeld worden helder weergegeven in het beeld Digitaal fasecontrast en vice versa. (C) Voorbeeld van BOB-maskering met behulp van het Digital Phase-contrastbeeld. Merk op dat de randen van interessante objecten veel meer gedefinieerd worden in vergelijking met de heldere veldafbeeldingen. In deze representatieve afbeelding zijn objecten in het primaire masker geel omlijnd. De subpopulatie in (C) (roze omlijnd) wordt gedefinieerd op basis van circulariteit (>0.3), oppervlakte (>1000), Mean [Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev [Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 en Peak [Dig.Ph.Con] > 12500. De parameters die in dit representatieve cijfer werden gebruikt, werden toegepast op gegevens in figuur 6 om te normaliseren naar het aantal cellen op dag 0. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: BOB-modellen kunnen verschillen in morfologie en consistentie van de beplating. Bovenste paneel: Voorbeelden van differentiële dispersie van BOB's in de BME-koepels. Onderste paneel: Representatieve afbeeldingen van discohesieve vs. circulaire BOB's. Alle beelden zijn gemaakt met een EVOS-microscoop. Vergrotingen worden genoteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 5: Voorbeeldafbeeldingen met behulp van cellulaire analyse versus beeldstatistieken voor het kwantificeren van fluorescentie. Met behulp van cellulaire analyse kunnen gebruikers specifieke populaties binnen een afbeelding definiëren en fluorescentie in die regio's meten. Beeldstatistieken kunnen ook worden gebruikt om fluorescentie in een afbeelding te meten door een drempel te definiëren om achtergrondsignalen uit te sluiten. Zie de discussie voor de beperkingen van het gebruik van afbeeldingsstatistieken. Afbeeldingen zijn met een vergroting van 4x. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Componenten van organoïde kweekmedia. Merk op dat reagentia zijn geoptimaliseerd voor het kweken van BOB's voor gynaecologische kanker. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Time-lapse-video van 500 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 2: Time-lapse-video van 100 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 3: Time-lapse-video van 10 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 4: Time-lapse-video van 1 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 5: Time-lapse-video van 0,1 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 6: Time-lapse-video van 0,01 nM staurosporinebehandeling met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 7: Time-lapse-video van het voertuig (0,06% DMSO) met beelden die elke 6 uur worden verkregen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Aanvullende protocollen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

PDO-culturen worden een steeds populairder in vitro modelsysteem vanwege hun vermogen om cellulaire reacties en gedragingen weer te geven^. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van het genereren, kweken en uitbreiden van BOB's, maar de methoden om therapeutische reacties te analyseren zijn achtergebleven. In de handel verkrijgbare 3D-levensvatbaarheidskits zijn lytische eindpuntassays, die potentieel waardevolle kinetische responsgegevens missen en daaropvolgende analyses met andere methoden beperken⁸. Opkomende studies passen beeldvorming van levende cellen toe om de respons van geneesmiddelen in PDO-modellen te beoordelen. Hier presenteren we een methode om PDO-therapeutische responsen in de loop van de tijd te beoordelen met behulp van multiplexed fluorescerende beeldvorming van levende cellen. Het multiplexen van fluorescerende kleurstoffen maakt het mogelijk om verschillende cellulaire reacties tegelijkertijd te kwantificeren. Naast apoptose en cytotoxiciteit stellen we ons voor dat deze aanpak in toekomstige studies kan worden uitgebreid om andere fenotypische effecten in BOB's te onderzoeken.

Het hierin gepresenteerde protocol is ontworpen om kinetische helderveld- en fluorescerende beelden te verkrijgen van BOB's die als koepels in een plaat met 96 putjes zijn geplateerd. De belangrijkste stappen zijn onder meer 1) plating, 2) behandeling met kleurstof en medicijn, 3) het definiëren van beeldvormingsparameters, 4) beeldvoorbewerking en -analyse na voltooiing van kinetische beeldacquisitie, en 5) gegevensexport voor analyse in andere statistische software (Figuur 1). Intacte BOB's worden geplateerd in een plaat met 96 putjes als BME-koepels van 5 μL die zijn samengesteld uit een vooraf gedefinieerde verhouding van BME en organoïde kweekmedia (meestal 1:1). Het hierin gepresenteerde protocol maakt gebruik van UltiMatrix als BME vanwege de minimale variabiliteit van batch tot batch en superieure optische eigenschappen voor beeldvorming. Aanpassingen voor het oogsten van BOB's die in andere BME's zijn gekweekt, zoals Matrigel, kunnen nodig zijn, evenals voor modellen die klonterig en moeilijk te dissociëren zijn (zie voorbeelden in aanvullende figuur 4). Vervolgens worden fluorescerende kleurstoffen toegevoegd aan de organoïdekweekmedia op het moment van plateren (dag -1) in een concentratie van 2x in een volume van 100 μL en 's nachts geïncubeerd om de celdood bij aanvang te bepalen. De volgende dag (dag 0) worden medicijnen of andere behandelingen toegevoegd aan Organoid Culture Media in een concentratie van 2x in een volume van 100 μL en vervolgens toegevoegd aan elk putje voor een uiteindelijk volume van 200 μL. Het uiteindelijke volume van 200 μL vermindert het meniscuseffect met beeldvorming. Kinetische beelden worden verkregen met behulp van de Cytation 5 plaatlezer in samenwerking met de BioSpa tafelincubator. De BioSpa-incubator maakt de incubatie van experimentele platen mogelijk bij een vaste temperatuur van 37 °C en een CO₂ -omgeving van 5%. Er kunnen maximaal 8 platen in de BioSpa worden opgeslagen en daardoor kunnen 8 experimenten tegelijkertijd worden uitgevoerd. Beeldvormingsparameters voor elke plaat worden ingesteld in de Gen5-software met behulp van "Imager Manual Mode" en opgeslagen als een protocol. Het protocol wordt vervolgens in de planningssoftware (BioSpa OnDemand) geladen. De BioSpa OnDemand-software automatiseert de workflow voor kinetische beeldacquisitie, inclusief de fysieke overdracht van de plaat van de BioSpa-incubator naar Cytation 5 en het dicteren van welk protocol in Gen5 moet worden uitgevoerd voor gegevensverzameling. Beelden worden geanalyseerd met behulp van de functie Cellular Analysis in de Gen5-software (Afbeelding 2). We beschrijven specifieke methoden om Z-projecties van fluorescerende en heldere veldbeelden te analyseren. Specifieke methoden voor het analyseren van enkele Z-vlakken en/of alleen helderveldbeelden zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Ten slotte kunnen gebruikers specifieke gegevenskenmerken definiëren, zoals PDO-oppervlakte, aantal en gemiddelde fluorescentie-intensiteit, om te exporteren als een Excel-spreadsheet voor latere statistische analyse van geneesmiddeleffecten.

Gezien het feit dat BOB-modellen een relatief nieuw modelsysteem zijn om de effecten van geneesmiddelen te onderzoeken, zijn er nog steeds methoden^{in opkomst om} tegemoet te komen aan de kweekomstandigheden, met name de groei van BME. Het grootste deel van de onderzoeken die de PDO-respons op medicamenteuze behandeling beoordelen, is gebaseerd op ATP-gebaseerde eindpuntassays als surrogaat voor celgezondheid (CellTiter-Glo 3D). Deze methode vereist cellyse, waardoor latere analyses stroomafwaarts niet mogelijk zijn. Alternatieve eindpunttesten, zoals fluorescerende kleuring, beeldvorming op één tijdstip en morfologische tracking, hebben andere statistieken opgeleverd om de respons op geneesmiddelen te karakteriseren, terwijl het gebruik van monsters voor aanvullende doeleinden mogelijk is. Er zijn bijvoorbeeld in-plate endpoint fixatieprotocollen toegepast voor high-throughput analyse van geneesmiddeleffecten^17,18. Een voordeel van deze methode is dat het de uitgebreide verwerking omzeilt die vereist is in typische immunohistochemie en immunofluorescerende beeldvorming¹⁹ en is vooral nuttig wanneer het monster beperkt is, zoals het geval is bij PDO-modellen. Het is ook geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie met confocale microscopie. Een andere eindpunttest waarvoor geen cellyse nodig is, is beeldvorming van levende cellen met reagentia zoals propidiumjodide of acridine-sinaasappel. Onze vergelijkende analyse van CellTiter-Glo 3D en AOPI, waarvan de laatste geen cellyse vereist, voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en dood van cellen (Figuur 6C) benadrukt de voordelen van het gebruik van kleurstoffen voor beeldvorming van levende cellen in BOB-modellen. Deze methode is door verschillende groepen, waaronder de onze, toegepast om fenotypische effecten te beoordelen aan het einde van een experiment 18,19,20. Voor het verzamelen van kinetische gegevens met behulp van de in-well fixatie of endpoint live-cell beeldvormingsmethoden is echter een aanzienlijk monster vereist. Labelvrije morfologische beoordeling van BOB's in de loop van de tijd ondervangt deze beperking gedeeltelijk en kan worden beoordeeld met behulp van een breed scala aan beeldvormingsmodaliteiten 8,10,17,18, maar veranderingen in morfologie zijn mogelijk niet representatief voor het spectrum van potentiële geneesmiddeleffecten zoals apoptose en veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen. We hebben significante model-tot-model variabiliteit waargenomen in morfologische veranderingen in reactie op geneesmiddelen. Sommige BOB's zullen bijvoorbeeld in oppervlakte toenemen omdat ze apoptose ondergaan, terwijl andere modellen kunnen krimpen. Kinetische morfologische beoordelingen zijn in een beperkt aantal onderzoeken gemultiplext met vaste of levende fluorescerende eindpuntassays^18,20. De hierin gepresenteerde methoden behoren tot de eersten die verschillende fluorescerende kleurstoffen multiplexen om tegelijkertijd meerdere cellulaire effecten in een high-throughput-systeem te beoordelen.

Een van de grootste verbeteringen die kinetische beeldvorming van levende cellen biedt, is dat het de belangrijkste beperkingen overwint die gepaard gaan met eindpunttesten. Het plateren van een gelijk aantal BOB's per put is bijvoorbeeld technisch moeilijk omdat de meeste geautomatiseerde cellentellers zijn afgesloten voor objecten kleiner dan 60 μm. Beeldvorming met levende cellen maakt normalisatie mogelijk naar het PDO-nummer of -gebied op tijdstip 0 uur in elke put, die vervolgens kan worden gebruikt om variatie in beplating tussen putten aan te passen. De gouden standaard eindpunttest voor BOB's is de CellTiter-Glo 3D-kit, die ATP meet als surrogaat voor de levensvatbaarheid van cellen. We hebben deze test uitgebreid gebruikt in onze onderzoeken naar gynaecologische en prostaatkanker BOB's 13,21,22,23,24. Naast het vereisen van cellyse voor ATP-metingen, kunnen geneesmiddelen en andere therapeutische modaliteiten de ATP-niveaus veranderen, wat mogelijk een onnauwkeurige beoordeling van de therapeutische respons oplevert. Het gebruik van kleurstoffen voor beeldvorming van levende cellen maakt het mogelijk om een breder scala aan specifieke cellulaire reacties, zoals apoptose en cytotoxiciteit, te kwantificeren. Belangrijk is dat deze reagentia de levensvatbaarheid van de cellen niet verstoren of DNA-schade veroorzaken, zoals het geval is met propidiumjodide; dit maakt een herhaalde beoordeling van de BOB-respons in de loop van de tijd mogelijk. Hoewel we het gebruik van acridine orange (AO) voor kinetische metingen niet hebben onderzocht, mag het werkingsmechanisme voor AO een dergelijke toepassing in de toekomst niet uitsluiten.

Tumoren bestaan uit verschillende verschillende celpopulaties met verschillende genomische profielen en morfologieën. Vanwege de complexe heterogeniteit van PDO-modellen kunnen individuele PDO-responsen variëren, en het volgen van deze responsen is een uitdaging. Ons protocol biedt een methode om meerdere PDO-responsstatistieken per put te beoordelen. Er zijn echter nog steeds bepaalde technische overwegingen van toepassing op beeldvorming van levende cellen. Het aantal putjes van een plaat met 24 putjes dat nodig is om een plaat met 96 putjes te zaaien, hangt af van de dichtheid en groeisnelheid van elk BOB-model. Omdat klonteren de beeldanalyse kan verwarren (aanvullende afbeelding 4), kunnen PDO-modellen extra verwerkingsstappen nodig hebben voordat ze worden plateerd. Indien nodig kunnen BOB's tijdens de verwerking mechanisch worden geknipt door krachtig pipetteren met een p200-punt zonder brede boring. Enzymatische vertering met behulp van TrypLE Express kan ook worden gebruikt voorafgaand aan het plateren om PDO-dissociatie en verminderde klontering te bevorderen. In onze ervaring hebben we opgemerkt dat de lengte van de incubatietijd van TrypLE zeer variabel is, afhankelijk van het model. Daarom moet de incubatie van TrypLE voor elk model worden geoptimaliseerd, vooral als onderzoekers eencellige suspensies willen verkrijgen. Hersteltijd voorafgaand aan het begin van de behandeling kan nodig zijn voor PDO-modellen die bijzonder gevoelig zijn voor enzymatische vertering.

We presenteren methoden voor specifieke reagentia voor beeldvorming van levende cellen. Een beperking in de brede toepasbaarheid van de hierin gepresenteerde methoden is een gebrek aan reagentia die compatibel zijn met BME. Voor andere kleurstoffen/reagentia die nog niet zijn geoptimaliseerd voor gebruik in BOB's, kan aanvullende probleemoplossing nodig zijn om de optimale concentratie te bepalen en de effecten van oplosmiddelen te minimaliseren. Afhankelijk van de uitlezing die van belang is (bijv. apoptose of cytotoxiciteit), moet behandeling met een verbinding waarvan bekend is dat deze celdood induceert, zoals staurosporine of daunorubicine¹³ , worden gebruikt om de reagensomstandigheden te optimaliseren. Een bijkomende overweging is het optimale moment voor kleurstofintegratie in de BME-koepel. In onze experimenten voeren we voorafgaand aan de behandeling een nachtelijke incubatie uit om volledige opname van de kleurstof in de koepels mogelijk te maken en de basisgezondheid van de cellen te bepalen. Aangezien de signaalintensiteit in de loop van de tijd zal toenemen, moeten onderzoekers pilotstudies uitvoeren met de kleurstoffen om de ideale belichtingstijd aan het einde van het experiment te bepalen om overbelichte beelden te voorkomen. Ten slotte mogen reagentia de cellulaire processen niet verstoren. Kleurstoffen die in DNA intercaleren, zijn bijvoorbeeld niet compatibel met kinetische beeldvorming. Beeldvorming van levende cellen kan echter worden gebruikt voor gegevensnormalisatie in eindpuntassays. We presenteren inderdaad een aanvullende methode om de levensvatbaarheid van cellen en de levensvatbare: dode celverhouding te kwantificeren met behulp van AOPI. In dit experiment wordt het fluorescerende signaal genormaliseerd naar het PDO-nummer voor elk putje, zoals bepaald door beeldvorming van levende cellen op dag 0 (dag van behandeling, figuur 6).

Een andere beperking van dit methodedocument is de afhankelijkheid van handmatig pipetteren voor experimenten, wat kan leiden tot een grotere variatie in technische replicaten. Verdere verbeteringen in de reproduceerbaarheid van gegevens kunnen worden bereikt door de toevoeging van automatisering aan andere stappen van het experimentele proces, zoals het gebruik van een geautomatiseerde vloeistofverwerker voor plating en medicijnafgifte, zoals door anderen is aangetoond ^8,10. Deze toevoeging vereist echter een extra investering in onderzoeksinfrastructuur die mogelijk niet voor alle onderzoekers beschikbaar is. Gezien de heterogeniteit in het BOB-gebied voor elk model, is het normaliseren van de resultaten naar het oorspronkelijke BOB-nummer of -gebied op tijdstip 0 uur nog steeds een nuttige benadering met geautomatiseerd zaaien.

Een belangrijk voordeel van Cytation 5 ten opzichte van andere live-cell beeldvormingsplatforms is de mogelijkheid om beeld- en analysefuncties aan te passen. De Cytation 5/Gen5-software heeft echter een steile leercurve en gaat ervan uit dat gebruikers een basiskennis van beeldvorming hebben. Een van de doelen van dit methodedocument is om stapsgewijze instructies te geven om de barrière voor andere onderzoekers te verlagen om geavanceerde beeldvormingstechnieken voor levende cellen op te nemen in hun PDO-onderzoeksprogramma's. Hoewel de specifieke analysestappen die hierin worden gepresenteerd voor één systeem zijn, kunnen gebruikers de multiplexingprincipes toepassen op andere platforms, met dien verstande dat downstream-analyse het gebruik van software van derden, zoals NIH ImageJ, kan vereisen.

Analysemaatstaven moeten worden gekozen op basis van zowel experimentele doelen als platingvoorwaarden. Als het experiment bijvoorbeeld wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescerende kleurstof om celdood te kwantificeren, is de fluorescentie-intensiteit een effectieve uitlezing. De meest effectieve fluorescentiemetriek (totale fluorescentie vs. objectgemiddelde intensiteit) hangt af van de beplatingsomstandigheden (aanvullende figuur 4). Als BOB's gelijkmatig verspreid zijn en een meer circulaire, samenhangende morfologie hebben, kan fluorescentie worden bepaald in een gedefinieerde BOB-subpopulatie. De specifieke functie in de Gen5-software is Cellular Analysis en de output is Object Mean Intensity. Als het PDO-model echter klonterig is of een dischesieve morfologie heeft, raden we aan om het fluorescentiesignaal op beeldniveau te kwantificeren; deze functie is te vinden onder Beeldstatistieken, en de output is Totale fluorescentie-intensiteit. Hoewel deze methode nuttig is voor het waarnemen van veranderingen op het niveau van de individuele put, is deze metriek niet specifiek voor objecten van belang en kan deze ten onrechte veranderen als de BOB's tijdens de duur van het experiment buiten de aangewezen stekker bewegen. In scenario's waarin er sprake is van aanzienlijk puin of dode afzonderlijke cellen, wordt het gebruik van de cellulaire analyse voorgesteld om elk fluorescerend signaal uit te sluiten dat niet specifiek is geassocieerd met een BOB. Een voorbeeld van differentiële resultaten met behulp van cellulaire analyse versus beeldstatistieken wordt weergegeven in aanvullende figuur 5.

Om de optimale drempel voor de functie Afbeeldingsstatistieken te bepalen, kan het lijngereedschap worden gebruikt. Met behulp van het lijngereedschap kunnen gebruikers het bereik van de fluorescentie-intensiteit binnen een afbeelding bepalen. We stellen de ondergrens in als de waarde van 25% van de piekintensiteit in de afbeelding. Als u de fluorescerende gebieden wilt bekijken die zijn opgenomen in de aangewezen drempelwaarde, vinkt u het vakje "Drempeluitschieters" aan. Aanvullende verfijning van de onderste drempelwaarde kan nodig zijn.

Een belangrijke uitdaging bij het in beeldvorming van levende cellen is het opslaan van de enorme hoeveelheid gegevens die bij elk experiment worden gegenereerd. Dit is met name relevant in het geval van PDO-culturen, waar Z-Stacks worden gebruikt om over verschillende brandpuntsvlakken te beelden en een Z-projectie te genereren. Er zijn meerdere methoden om dit probleem op te lossen. Zorg eerst voor voldoende opslagcapaciteit. We hebben drie solid-state harde schijven geïnstalleerd met een totaal van 17 TB. Andere opties zijn het overbrengen van experimentele bestanden naar externe harde schijven of netwerkopslag. Het wordt niet aanbevolen om bestanden rechtstreeks naar cloudgebaseerde opslag te schrijven. Om gegevens te analyseren die op een externe schijf zijn opgeslagen, brengt u eenvoudig het experiment en de afbeeldingsbestanden over naar een computer die is uitgerust met Gen5-software (OPMERKING: het kan langer duren voordat grote bestanden zijn overgezet). Vóór de analyse moeten de beelden opnieuw aan het experiment worden gekoppeld. Open het experimentbestand, klik op Protocol in de knoppenbalk en selecteer Protocolopties. Klik op Opties voor het opslaan van afbeeldingen en klik op Nieuwe afbeeldingsmap selecteren. Zoek het afbeeldingsbestand en klik op Map selecteren om opnieuw te koppelen.

Afhankelijk van de doelen van het experiment kan het ook geschikt zijn om de binning-functie binnen Gen5 te gebruiken. Binning verkleint de bestandsgrootte door het aantal pixels te verlagen, wat leidt tot een lagere beeldresolutie (zie stap 3.5.3.2). Daarom wordt binning niet aanbevolen als afbeeldingen met een hoge resolutie vereist zijn. Bij gebruik van de binning-functie moeten de belichtingsinstellingen worden aangepast. Zodra het experimentele bestand is gemaakt, dubbelklikt u op de Afbeelding sectie, en klik op de microscoop pictogram om de Imager Manual Mode opnieuw te openen. Gebruik de functie Automatisch belichten of pas de belichting indien nodig handmatig aan.

Samenvattend presenteren we methoden voor het beoordelen van apoptose en celgezondheid van BOB's als reactie op cytotoxische middelen. Toekomstige studies zijn nodig om methoden te optimaliseren en aanvullende analysestrategieën te ontwikkelen voor kinetische beeldvorming van BOB's, zoals andere fenotypes en effecten van geneesmiddelen die cytostatisch zijn in plaats van cytotoxisch. Een belangrijk obstakel is de commerciële beschikbaarheid van kleurstoffen en reagentia die compatibel zijn met BME. Er is nog meer werk nodig om beter te begrijpen hoe kinetische beeldvorming van levende cellen volledig kan worden benut om de meeste gegevens uit deze modellen te halen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)