Imágenes multiplexadas de células vivas para las respuestas a los medicamentos en modelos de organoides derivados de pacientes de cáncer

Summary

Los organoides tumorales derivados de pacientes son un sistema modelo sofisticado para la investigación básica y traslacional. Este artículo de métodos detalla el uso de imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para la evaluación cinética simultánea de diferentes fenotipos de organoides.

Abstract

Los modelos de organoides derivados del paciente (PDO, por sus siglas en inglés) del cáncer son un sistema de investigación multifuncional que recapitula mejor las enfermedades humanas en comparación con las líneas celulares cancerosas. Los modelos de PDO se pueden generar mediante el cultivo de células tumorales de pacientes en extractos extracelulares de membrana basal (BME) y su siembra en forma de cúpulas tridimensionales. Sin embargo, los reactivos disponibles comercialmente que han sido optimizados para ensayos fenotípicos en cultivos monocapa a menudo no son compatibles con BME. En este artículo, describimos un método para placar modelos de PDO y evaluar los efectos de los fármacos utilizando un sistema automatizado de imágenes de células vivas. Además, aplicamos colorantes fluorescentes que son compatibles con las mediciones cinéticas para cuantificar la salud celular y la apoptosis simultáneamente. La captura de imágenes se puede personalizar para que se produzca a intervalos de tiempo regulares durante varios días. Los usuarios pueden analizar los efectos de las drogas en imágenes individuales del plano Z o en una proyección Z de imágenes en serie de múltiples planos focales. Mediante el enmascaramiento, se calculan parámetros específicos de interés, como el número de PDO, el área y la intensidad de fluorescencia. Proporcionamos datos de prueba de concepto que demuestran el efecto de los agentes citotóxicos en la salud, la apoptosis y la viabilidad celular. Esta plataforma automatizada de imágenes cinéticas se puede ampliar a otras lecturas fenotípicas para comprender los diversos efectos terapéuticos en los modelos de cáncer de PDO.

Introduction

Los organoides tumorales derivados de pacientes (PDO, por sus siglas en inglés) están emergiendo rápidamente como un sistema modelo sólido para estudiar el desarrollo del cáncer y las respuestas terapéuticas. Las PDO son sistemas de cultivo celular tridimensionales (3D) que recapitulan el complejo perfil genómico y la arquitectura del tumor primario ^1,2. A diferencia de los cultivos bidimensionales (2D) tradicionales de líneas celulares cancerosas inmortalizadas, las PDO capturan y mantienen la heterogeneidad intratumoral ^3,4, lo que las convierte en una herramienta valiosa tanto para la investigación mecanicista como para la traslacional. Aunque las PDO se están convirtiendo en un sistema modelo cada vez más popular, los reactivos disponibles comercialmente y los métodos de análisis para los efectos celulares que son compatibles con los cultivos de PDO son limitados.

La falta de métodos sólidos para analizar los cambios sutiles en la respuesta al tratamiento dificulta la traslación clínica. El reactivo de salud celular de referencia en cultivos 3D, CellTiter-Glo 3D, utiliza los niveles de ATP como determinante de la viabilidad celular ^5,6. Si bien este reactivo es útil para los ensayos de punto final, existen varias advertencias, sobre todo la imposibilidad de utilizar muestras para otros fines después de completar el ensayo.

La obtención de imágenes de células vivas es una forma sofisticada de microscopía cinética que, cuando se combina con reactivos fluorescentes, tiene la capacidad de cuantificar una variedad de lecturas de salud celular dentro de los modelos de PDO, incluida la apoptosis ^7,8,9 y la citotoxicidad¹⁰. De hecho, la obtención de imágenes de células vivas ha sido fundamental para el cribado de compuestos de alto rendimiento en plataformas 2D^11,12. Sistemas como el Incucyte han hecho que la tecnología sea asequible y, por lo tanto, accesible para grupos de investigación en una variedad de entornos. Sin embargo, la aplicación de estos sistemas para analizar cultivos 3D aún está en pañales.

En este trabajo se describe un método para evaluar la respuesta a fármacos en modelos PDO de cáncer mediante imágenes multiplexadas de células vivas (Figura 1). A través del análisis de imágenes de campo claro, los cambios en el tamaño y la morfología de la PDO se pueden monitorear cinéticamente. Además, los procesos celulares se pueden cuantificar simultáneamente a lo largo del tiempo utilizando reactivos fluorescentes, como el colorante rojo de anexina V para la apoptosis y el colorante verde citotóxico para la citotoxicidad. Los métodos presentados están optimizados para el sistema de imágenes de células vivas Cytation 5, pero este protocolo puede adaptarse a diferentes plataformas de imágenes de células vivas.

Protocol

Los estudios que utilizaron muestras de tumores humanos fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Iowa, protocolo # 201809807, y se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos que participaron en el estudio. Los criterios de inclusión incluyen el diagnóstico de cáncer y la disponibilidad de especímenes tumorales.

1. Recubrimiento de PDO intactos en una placa de 96 pocillos

1. Preparar los reactivos.
   1. Precaliente las placas de 96 pocillos a 37 °C durante la noche y descongele el BME durante la noche a 4 °C.
   2. Prepare medios de cultivo de organoides completos optimizados para cultivar el tipo de cáncer de interés. Los medios de cultivo específicos utilizados para los experimentos que se muestran en este documento se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
      NOTA: Es posible que sea necesario modificar los componentes de los medios para diferentes tipos de tumores. Por ejemplo, el medio de cultivo de organoides se complementa con estradiol 100 nM para tumores ginecológicos¹³. Los medios preparados son estables a 4 °C durante 1 mes. Para el almacenamiento a largo plazo, alícuota de los medios en tubos de 50 ml y guárdelos a -20 °C.
2. Preparar dos alícuotas separadas de medios de cultivo de organoides a 4 °C y 37 °C. Por ejemplo, si se están sembrando 60 pocillos en una placa de 96 pocillos, utilice 6 ml de medio de cultivo de organoides tibios y 150 μl de medios de cultivo de organoides helados.
3. Prepare el tampón de lavado de organoides: Complemente 1x PBS con 10 mM de HEPES, 1x Glutamax, 5 mM de EDTA y 10 μM de Y-27632. Conservar a 4 °C
4. Coseche las DOP cultivadas en una placa de 24 pocillos. Realice todos los pasos sobre hielo o a 4 °C, a menos que se indique lo contrario.
   1. Aspire los medios de cada pocillo utilizando un sistema de línea de vacío.
   2. Añadir 500 μL de tampón de lavado de organoides helado y pipetear suavemente 2-3 veces con una pipeta de 1000 μL. Incuba la placa en hielo durante 10 min.
   3. Transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo cónico de 50 ml. Para asegurarse de que todos los PDO estén en suspensión, enjuague cada pocillo con 300 μL adicionales de tampón de lavado de organoides y transfiéralo al tubo cónico de 50 mL. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 °C
   4. Aspire el sobrenadante del gránulo de BME/organoide utilizando un sistema de línea de vacío, dejando ~ 5 mL restantes en el tubo. Añadir 20 ml de tampón de lavado organoide y resuspender suavemente el gránulo con una pipeta serológica de 10 ml. Incubar en hielo durante 10 min.
   5. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C. Aspire el sobrenadante con un sistema de línea de vacío, teniendo cuidado de no interrumpir el gránulo de PDO.
5. Colocación de PDO en una placa de 96 pocillos: Realice todos los pasos sobre hielo a menos que se indique lo contrario.
   1. Vuelva a suspender el gránulo de PDO en una cantidad adecuada de medios de cultivo de organoides helados para crear una suspensión de PDO. Transfiera la suspensión de PDO a un tubo de microcentrífuga helado de 1,5 ml.
      NOTA: Para calcular la cantidad de medios de cultivo de organoides, determine el número de pocillos que se van a sembrar en una placa de 96 pocillos, teniendo en cuenta que los PDO se siembran en un domo de 5 μL en una proporción de 1:1 de medios de cultivo de organoides y BME. Por ejemplo, cuando se siembra una placa de 96 pocillos y se utilizan solo los 60 pocillos interiores, la cantidad total de suspensión de PDO necesaria será de 300 μL: 150 μL de medio de cultivo de organoides y 150 μL de BME. En el caso de los modelos que presentan un crecimiento óptimo a diferentes porcentajes de BME, la relación entre BME: medios puede modificarse en este paso, aunque es importante estandarizar la relación en todos los ensayos para cada modelo específico. Para tener en cuenta el error de pipeteo, agregue un 10 % de volumen a cada componente.
   2. Cuenta el número de PDO.
      1. Transfiera 2,5 μL de la suspensión de PDO a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL helado y mezcle con 2,5 μL de BME. Transfiera la mezcla de 5 μL a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. No cubra el portaobjetos. La mezcla se solidificará en una cúpula.
      2. Visualice usando un microscopio de campo brillante a 4x. Cuente el número de PDO en la mezcla de 5 μL; el objetivo es tener aproximadamente 25-50 PDO por domo de 5 μL.
         NOTA: Si no se logra la densidad deseada en la mezcla de ensayo, ajuste el volumen final de la suspensión de PDO añadiendo más medios de cultivo de organoides o centrifugando la suspensión de PDO y resuspendiendo el gránulo de PDO en un volumen menor de medios de cultivo de organoides helados. Independientemente de cómo se modifique la suspensión PDO en este paso, la relación final de BME: suspensión PDO en el paso 1.5.3. debe ser 1:1.
   3. Utilizando una pipeta de 200 μL con puntas de diámetro ancho, mezcle cuidadosamente la suspensión de PDO con una cantidad igual de BME para lograr una proporción de 1:1 de medio de cultivo de organoides a BME. Evite las burbujas, que alterarán la integridad de las cúpulas.
   4. Con una pipeta de 20 μL, siembre domos de 5 μL en el centro de cada pocillo de una placa precalentada de 96 pocillos, sembrando solo los 60 pocillos interiores. Para garantizar una distribución equitativa de los PDO, pipetee periódicamente el contenido del tubo de 1,5 ml con una pipeta de 200 μl con puntas de diámetro ancho.
   5. Después de que se hayan sembrado todos los pozos, coloque la tapa en el plato e invierta suavemente. Incubar la placa invertida a 37 °C durante 20 min en la incubadora de cultivo de tejidos para permitir que las cúpulas se solidifiquen.
      NOTA: La inversión de la placa garantiza que la cúpula de medios de cultivo de BME/organoide conserve la estructura 3D para proporcionar un espacio adecuado para la formación de PDO.
   6. Dar la vuelta a la placa para que quede con la tapa levantada e incubar durante 5 minutos a 37 °C.

2. Tratamientos y adición de colorantes fluorescentes para multiplexación

1. Mientras los domos de BME se solidifican en las placas de 96 pocillos, prepare diluciones de reactivos fluorescentes de imágenes de células vivas. En este documento se dan los parámetros específicos para la multiplexación del colorante rojo de anexina V y el colorante verde citotóxico.
2. Preparación de reactivos fluorescentes (Día -1): Calcule el volumen adecuado de medios de cultivo de organoides en función del número de pocillos a tratar, suponiendo que cada pocillo se tratará con 100 μL de medios dosificados con colorante. Diluir el colorante en medios de cultivo de organoides precalentados hasta la concentración deseada.
   NOTA: La cantidad total de medios necesarios variará según el experimento. Agregue un 10% al volumen final para tener en cuenta el error de pipeteo. Por ejemplo, para tratar los 60 pocillos internos de una placa de 96 pocillos, prepare 6,6 ml de medio dosificado con colorante (Tabla 1).
3. Trate cada pocillo con 100 μL de 2 medios de cultivo de organoides dosificados con colorante. Añadir 200 μL de PBS estéril 1x a los pocillos vacíos exteriores de la placa. Incubar a 37 °C durante la noche.
   NOTA: El PBS en los pozos periféricos disminuye la evaporación de los medios de los pozos internos.
4. Adición de fármacos/agentes de tratamiento (Día 0): Preparar los fármacos en medios de cultivo de organoides precalentados a una concentración de 2x en un volumen de 100 μL por pocillo.
   NOTA: El DMSO puede ser tóxico para las células en altas concentraciones. No se supera una concentración de 0,1% de DMSO en los experimentos realizados en este estudio. Además de los fármacos, algunos reactivos fluorescentes se distribuyen como una solución de DMSO. Es importante tener en cuenta la concentración total de DMSO cuando se trabaja con este tipo de reactivos.
5. Agregue 100 μL de 2 medios dosificados con colorante a cada pocillo; Evite crear burbujas.

3. Configuración de los parámetros de imagen

1. Coloque la placa en Cytation 5. Abrir Software Gen5. Haga clic en Nueva tarea > en el modo manual del generador de imágenes. Seleccione Capturar ahora e ingrese los siguientes ajustes: Objetivo (seleccione la ampliación deseada); Filtro (seleccione la microplaca); Formato de microplaca (seleccionar número de pocillos); y Tipo de recipiente (seleccione el tipo de placa). Haga clic en Usar tapa y Usar velocidad de portadora más lenta. Haga clic en Aceptar.
   NOTA: Tipo de recipiente: Sea lo más específico posible al seleccionar información sobre la placa porque el software está calibrado a la distancia específica desde el objetivo hasta la parte inferior de la placa para cada tipo de placa y espesor del plástico.
   Velocidad de portadora más lenta: Seleccione esta casilla para evitar interrumpir las cúpulas al cargar/descargar placas.
2. Cree una pila Z que genere una imagen de todo el domo BME.
   1. Seleccione un pozo de interés para verlo (panel izquierdo, debajo del histograma).
   2. Seleccione el canal Campo claro (panel izquierdo, arriba). Haga clic en Exposición automática y ajuste la configuración según sea necesario.
   3. Establezca la parte inferior y superior de la pestaña Z-Stack: Expandir modo de imagen (panel izquierdo, centro). Marque la casilla Z-Stack . Usando las flechas de ajuste de rumbo (panel izquierdo, centro), haga clic en el ajuste hacia abajo hasta que todos los PDO hayan entrado y luego desenfocados y estén borrosos. Establécelo como la parte inferior de la pila Z. Repita en la dirección opuesta usando las flechas de ajuste de rumbo para establecer la parte superior de la pila Z.
   4. Para asegurarse de que la configuración de Z-Stack sea adecuada para otros pozos de interés, seleccione otro pozo (panel izquierdo, debajo del histograma) y visualice la parte superior e inferior de Z-Stack.
   5. Para introducir manualmente las posiciones focales, haga clic en los tres puntos situados junto al ajuste fino (panel izquierdo, parte superior). Se abrirá una ventana; escriba el valor superior de Z-Stack (que se encuentra en el panel izquierdo, en el centro, en Modo de imagen). Repita el procedimiento para el valor inferior de Z-Stack. Ajuste según sea necesario para capturar el rango Z deseado repitiendo el paso 3.2.3. Si fuera necesario realizar ajustes, seleccione otro pozo para verificar la configuración.
3. Ajuste los ajustes de exposición para los canales fluorescentes. Se describen los ajustes para dos canales fluorescentes (GFP y TRITC). El número específico de canales fluorescentes dependerá del experimento y de los cubos fluorescentes que se instalen en el sistema de imágenes de células vivas.
   NOTA: Si se prevé que la intensidad de la señal sea significativamente mayor al final del experimento, los usuarios deben considerar la posibilidad de realizar experimentos de prueba para determinar los ajustes de exposición óptimos al final del experimento que luego se pueden aplicar al configurar los parámetros iniciales.
   1. Expanda la pestaña Modo de imagen (panel izquierdo, centro) y abra Editar paso de imagen. Aparecerá una ventana emergente.
   2. En Canales, haga clic en la burbuja para el número deseado de canales. Designe un canal para el campo claro y canales adicionales para cada canal fluorescente. En este ejemplo, Canal 1 = Campo claro; Canal 2 = GFP; Canal 3 = TRITC. Con los menús desplegables Color , seleccione la configuración adecuada para cada canal. Cierre la ventana de edición haciendo clic en Aceptar.
   3. Configure cada canal fluorescente.
      1. Cambie el canal a GFP (panel izquierdo, arriba).
      2. Haga clic en Exposición automática (panel izquierdo, parte superior). Expanda la pestaña Exposición (panel izquierdo, centro) y ajuste la configuración de exposición para minimizar la señal de fondo.
      3. Copie los ajustes de exposición en la pestaña Modo de imagen siguiendo los pasos 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Haga clic en el icono Copiar junto al cuadro Editar paso de imagen . Haga clic en Editar paso de imagen, que abrirá otra ventana.
      5. En el canal GFP, haga clic en el icono Portapapeles en la línea Exposición para agregar los ajustes de Iluminación, Tiempo de integración y Ganancia de cámara al canal.
      6. Repita los pasos 3.3.3.4-3.3.3.5 para el canal TRITC. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
4. Configure los pasos de preprocesamiento de imágenes y proyección Z para automatizar el preprocesamiento de imágenes.
   1. Haga clic en el icono de la cámara (panel izquierdo, esquina inferior). Se abrirá una nueva ventana.
   2. En Agregar paso de procesamiento (panel izquierdo, abajo), haga clic en Preprocesamiento de imágenes. Se abrirá una nueva ventana.
   3. En la pestaña Campo claro , anule la selección de Aplicar preprocesamiento de imágenes.
   4. Para cada pestaña Canal fluorescente , asegúrese de que la opción Aplicar preprocesamiento de imagen esté seleccionada. Anule la selección de Usar las mismas opciones que el canal 1 y haga clic en Aceptar. La ventana se cerrará.
   5. En Agregar paso de procesamiento, haga clic en Proyección Z. Se abrirá una nueva ventana. Si lo desea, ajuste el rango de corte (por ejemplo, para reducir el rango Z). Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
5. Crear protocolo.
   1. Haga clic en Conjunto de imágenes en la barra de herramientas. En el menú desplegable, haga clic en Crear experimento a partir de este conjunto de imágenes. Se cerrará la ventana de imágenes y se abrirá la ventana de procedimientos .
      NOTA: Los parámetros seleccionados en el modo manual del generador de imágenes se cargarán automáticamente en la nueva ventana, por lo que se puede crear un protocolo experimental.
   2. Establecer la temperatura y el degradado: Haz clic en "Establecer temperatura " debajo del encabezado Acciones (izquierda). Se abrirá una nueva ventana. Seleccione Incubadora encendida e ingrese manualmente la temperatura deseada en Temperatura. A continuación, en Degradado, introduzca manualmente 1. Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
      NOTA: La creación de un gradiente de 1 °C evitará que se forme condensación en la tapa de la placa.
   3. Designe pocillos a la imagen.
      1. Haga doble clic en el paso de imagen en Descripción. Haga clic en Placa completa (esquina derecha, parte superior). Esto abrirá la ventana Diseño de placa .
      2. Resalte los pozos de interés con el cursor. Haga clic en Aceptar. Si lo desea, marque las casillas Agrupación de enfoque automático y Agrupación de capturas . Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
         NOTA: La agrupación requerirá un ajuste de la exposición, como se describe en el paso 3.3.3.2 anterior. Consulte la sección Discusión para conocer los escenarios específicos en los que se puede usar esta función.
   4. Establezca intervalos para la obtención de imágenes cinéticas.
      1. Haga clic en Opciones bajo el encabezado Otro (izquierda). Marque la casilla Procedimiento cinético discontinuo .
      2. En Tiempo total estimado, introduzca el tiempo de ejecución del experimento (por ejemplo, 5 días). En Intervalo estimado, introduzca el intervalo para obtener una imagen de la placa (por ejemplo, cada 6 h).
      3. Haga clic en Pausa después de cada ejecución para dar tiempo a que la placa se transfiera a la incubadora. Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
   5. Actualice los pasos de reducción de datos.
      1. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana de procedimiento. Se abrirá una pestaña para actualizar los pasos de reducción de datos. Seleccione Sí. Haga doble clic en Preprocesamiento de imágenes. Haga clic en los diferentes canales para verificar la configuración y haga clic en Aceptar.
      2. Haga doble clic en Proyección Z. Haga clic en los diferentes canales para verificar la configuración. Haga clic en Aceptar. A continuación, vuelva a hacer clic en Aceptar para cerrar la ventana de reducción de datos.
   6. Formatee el diseño de la placa.
      1. Abra el Asistente de diseño de placas y designe los tipos de pozos siguiendo los pasos 3.6.2-3.6.3.
      2. Haga clic en el icono Diseño de placas en la barra de herramientas (esquina izquierda, arriba) para abrir el Asistente de diseño de placas.
      3. Marque las casillas junto a los tipos de pocillos utilizados en el experimento. En Controles de ensayo, introduzca el número de tipos de control diferentes con las flechas. Haga clic en Siguiente para abrir la ventana Control de ensayo #1 .
      4. Establezca las condiciones del pozo de control del ensayo siguiendo los pasos 3.6.5-3.6.8.
      5. En la ventana Control de ensayo #1, introduzca la etiqueta de control en el cuadro ID de diseño de placa . Si lo desea, ingrese el nombre completo en el cuadro adyacente. Seleccione el número de réplicas para la condición de control respectiva utilizando las flechas.
      6. Si utiliza varias concentraciones o una serie de diluciones dentro del control, haga clic en Definir diluciones/concentraciones y utilice el menú desplegable para seleccionar el Tipo. Introduzca los valores de cada concentración/dilución en la tabla.
         NOTA: La función automática se puede utilizar si las concentraciones cambian en un incremento constante.
      7. Seleccione la pestaña Color en la barra de herramientas. Elija el color de texto y el color de fondo deseados para el control en el menú desplegable. Haga clic en Siguiente.
      8. Repita según sea necesario con controles adicionales.
      9. Establezca las condiciones del pocillo de muestra siguiendo 3.6.10-3.6.12.
      10. En la página Configuración de muestra , introduzca el prefijo de ID de muestra (por ejemplo, SPL). Seleccione el número de réplicas con las flechas. Si utiliza muestras con diferentes concentraciones de tratamiento, seleccione Concentraciones o Diluciones en el menú desplegable Tipo . Introduzca las diluciones/concentraciones en la tabla e introduzca las unidades en el cuadro Unidad .
      11. Seleccione Campos de identificación en la barra de herramientas. Introduzca los nombres de categoría deseados (por ejemplo, ID de muestra, medicamento) en la tabla.
      12. Seleccione la pestaña Color en la barra de herramientas. Seleccione un color diferente para cada grupo de tratamiento/muestra. Haga clic en Finalizar. Esto abrirá la página Diseño de placas.
          NOTA: Los números del lado izquierdo se correlacionan con los diferentes números de muestra.
      13. Asigne identificadores de muestra siguiendo los pasos 3.6.14-3.6.16.
      14. Escoger SPL1 en el panel izquierdo. Utilice el cursor para seleccionar pozos.
          NOTA: Las herramientas de selección automática se pueden ajustar en el cuadro de asignación de serie. El número de réplicas y la orientación del diseño se pueden designar previamente.
      15. Repita con otras muestras para completar el diseño de la placa. Una vez satisfecho, haga clic en Aceptar.
      16. En la barra de herramientas Archivo , seleccione Identificadores de ejemplo. Complete las columnas de ID de muestra con la información adecuada para cada muestra (por ejemplo, tipo de medicamento). Presione Aceptar.
   7. Guarde el protocolo.
      1. En la barra de herramientas, haga clic en Archivo > Guardar protocolo como. Seleccione la ubicación para guardar el archivo. Introduzca un nombre de archivo. Haga clic en Guardar para cerrar la ventana.
      2. Haga clic en Archivo > Salir en la barra de herramientas. Se abrirá una pestaña para guardar los cambios en el modo manual del generador de imágenes. Seleccione No.
      3. Se abrirá una pestaña para guardar los cambios en el Experimento 1. Seleccione No. Se abrirá una pestaña para actualizar la definición del protocolo. Seleccione Actualizar. Cierre el software.
6. Importe el protocolo en BioSpa OnDemand y termine de configurar el experimento.
   1. Abra el software BioSpa OnDemand (software de programación).
   2. Seleccione una ranura disponible en el software.
   3. Retire la placa del sistema de obtención de imágenes de células vivas. Haga clic en Abrir cajón para acceder a la ranura adecuada en el software de programación e insertar la placa. Haga clic en Cerrar cajón.
      NOTA: Este paso se puede realizar en cualquier momento una vez que se haya creado el protocolo en el paso 3.5.7 anterior. Sin embargo, la placa debe estar en la Cytation 5 para realizar una ejecución de temporización en el siguiente paso 3.6.4.3.
   4. Importe el protocolo.
      1. En la pestaña Información del procedimiento , seleccione Usuario en el menú desplegable. Junto a la ranura Protocolo , haga clic en Seleccionar > Agregar una nueva entrada.
      2. Junto a la ranura Protocolo, haga clic en Seleccionar. Esto abrirá una nueva ventana para navegar al protocolo deseado en la arquitectura de archivos. Haga clic en Abrir para importar el protocolo en el software de programación.
      3. Introduzca la cantidad de tiempo necesario para obtener una imagen de la placa. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Lista de protocolos Gen5 .
         NOTA: Este paso es especialmente importante cuando se ejecutan varios experimentos a la vez. Para determinar el tiempo necesario para crear una imagen, haga clic en Realizar una ejecución de tiempo ahora. Haga clic en Aceptar.
   5. Establezca intervalos de imágenes y programe el experimento.
      1. En Intervalo, introduzca el intervalo de imágenes designado en el paso 3.5.4.
      2. En Opciones de hora de inicio, seleccione Cuando esté disponible. En Duración, seleccione Fijo o Continuo.
         NOTA: Se puede designar una hora de inicio específica en lugar de ejecutar el protocolo a la siguiente hora disponible. Al seleccionar Duración fija , se establecerá un punto de conexión específico para el experimento y se requerirá que el usuario designe un período de tiempo experimental. La duración continua permitirá que el experimento se ejecute sin punto de conexión y solo puede finalizarse si un usuario detiene el experimento.
      3. Haga clic en Programar placa/recipiente. Esto abrirá la secuencia de validación de placas. Se abrirá una pestaña con la hora de primera lectura propuesta. Haga clic en Sí para aceptar esta programación.

4. Análisis de imágenes en el software Gen5 (Figura 2)

1. Abra el módulo Análisis de imágenes.
   1. Abra Gen5. En el Administrador de tareas, seleccione Experimentos > Abrir. Seleccione el experimento para abrir el archivo. Haga clic en Placa > vista en la barra de herramientas.
   2. Cambie el menú desplegable Datos a Proyección Z. Haga doble clic en un pozo de interés. Seleccione Analizar > quiero configurar un nuevo paso de reducción de datos de Análisis de imagen. Haga clic en Aceptar.
2. Análisis celular
   1. Mascarilla primaria
      1. En Configuración de análisis, seleccione Tipo: Análisis celular y canal de detección: ZProj[Tsf[Campo claro]] (panel izquierdo, centro).
      2. Haga clic en Opciones. Esto abrirá la página Máscara y recuento principal . En el cuadro Umbral , marque Automático y haga clic en Aplicar. Haga clic en el cuadro Resaltar objetos (panel derecho, abajo) para mostrar los objetos dentro del umbral designado. Ajústelo según sea necesario para incluir objetos de interés.
         NOTA: La configuración del umbral se basa en la intensidad de píxeles. Por ejemplo, si el umbral se establece en 5000, los píxeles con una intensidad superior a 5000 se incluirán en el análisis.
      3. En Selección de objetos, designe el tamaño mínimo y máximo del objeto (μm). Ajústelo según sea necesario para excluir los desechos celulares/celdas individuales.
         NOTA: El tamaño de la PDO puede variar significativamente entre los diferentes modelos y tipos. Utilice la herramienta de medición del software Gen5 para determinar los umbrales mínimos y máximos de tamaño de PDO para cada modelo. Los usuarios pueden elegir un umbral mínimo de tamaño de PDO más pequeño en relación con el valor proporcionado por la herramienta de medición para evitar la exclusión de fragmentos de PDO en momentos posteriores al tratamiento farmacológico.
      4. Para limitar el análisis a una determinada región del pozo, anule la selección de Analizar toda la imagen y haga clic en Enchufar. En la ventana Conector de imagen , utilice el menú desplegable para seleccionar Forma de enchufe . Ajuste los parámetros de tamaño y posición según sea necesario para que se ajusten a la región de interés.
         NOTA: Es importante maximizar el número de PDO dentro del enchufe y, al mismo tiempo, excluir las áreas libres de PDO para minimizar el fondo. Designe un tamaño de conector que capture de forma coherente la mayoría de los objetos de interés en las réplicas. Es importante generar un tapón que también excluya los bordes de la cúpula, ya que excluye cualquier objeto que pueda aparecer distorsionado debido a la refracción de la luz de la curvatura extrema de la cúpula alrededor de los bordes. También se puede anular la selección de Incluir objetos de borde primario para capturar solo PDO completos dentro del enchufe.
   2. Análisis de subpoblaciones. En la Figura 3 se proporciona un ejemplo de designación de subpoblación.
      1. Haga clic en Métricas calculadas en la barra de herramientas Análisis celular . Haga clic en Seleccionar o crear métricas de nivel de objeto de interés (esquina derecha, parte inferior). En Métricas de objetos disponibles , seleccione las métricas de interés (por ejemplo, circularidad) y haga clic en el botón Insertar . Haga clic en Aceptar.
         NOTA: La morfología y la densidad de cada modelo de DOP determinarán las mejores métricas de interés para distinguir la subpoblación.
      2. Haga clic en Análisis de subpoblación en la barra de herramientas Análisis celular . Haga clic en Agregar para crear una nueva subpoblación. Se abrirá una ventana emergente.
      3. Si lo desea, escriba un nombre para la subpoblación. En Métricas de objeto, seleccione una métrica de interés y presione Agregar condición. En la ventana Editar condición , introduzca los parámetros para la métrica de objeto elegida. Repita con métricas adicionales según sea necesario.
         NOTA: Los parámetros se pueden ajustar manualmente o configurar con la herramienta de búsqueda. Por ejemplo, para excluir residuos, los usuarios pueden agregar Área como métrica de objeto y seleccionar objetos menores de 800. La circularidad como métrica de objeto se utiliza de forma rutinaria, y se incluyen todos los objetos con una circularidad superior a 0,2-0,5, según el modelo.
      4. En la tabla de la parte inferior de la ventana, marque los resultados deseados para mostrar. Haga clic en Aceptar > Aplicar.
      5. Para ver los objetos dentro de la subpoblación, utilice el menú desplegable Detalles del objeto (panel derecho, centro) para seleccionar la subpoblación. Los objetos que se encuentren dentro de los parámetros se resaltarán en la imagen.
         NOTA: Para cambiar los colores de resaltado de la máscara principal y la subpoblación, haga clic en Configuración (panel derecho, parte inferior).
      6. Para ajustar los parámetros de subpoblación, vuelva a abrir la ventana Análisis de subpoblación desde la barra de herramientas Análisis celular . Seleccione la subpoblación y haga clic en Editar. Haga clic en Agregar paso.
         NOTA: Esto aplicará el mismo análisis a todos los pozos dentro del experimento en todos los puntos de tiempo. En el menú desplegable de la página Matriz, se pueden seleccionar diferentes métricas para su visualización individual.

5. Exportación de datos de Gen5 a Excel

1. Para personalizar un archivo de datos para la exportación, seleccione el icono Generadores de informes/exportaciones en la barra de herramientas. En la ventana emergente, haga clic en Nueva exportación a Excel.
2. En la página Propiedades de la ventana emergente, seleccione Ámbito > placa y Contenido > Personalizado. Haga clic en la opción Contenido en la barra de herramientas. Haga clic en Editar plantilla, que abrirá el programa Excel.
3. En la hoja de cálculo, seleccione Complementos > Tabla > datos de pozos. Coloque el cursor sobre las distintas selecciones para ver las opciones de exportación. Seleccione la métrica de interés (por ejemplo, Media del objeto[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   NOTA: El diseño de placa se puede agregar a la plantilla de análisis de hoja de cálculo seleccionando Complementos > Resumen de protocolo > diseño.
4. Se abrirá una ventana de edición . En el cuadro Pozos , designe los pozos para la exportación por Id. de pozo o # de pozo. Seleccione Aceptar. Se cargará una plantilla en el archivo de hoja de cálculo. Cierra la hoja de cálculo. La plantilla se guarda automáticamente.
5. Haga clic en Aceptar en la ventana Nueva exportación a Excel y cierre la ventana Generadores de informes/exportaciones .
6. Haga clic en el icono Exportar en la barra de herramientas Gen5. Marque la casilla junto al archivo de exportación deseado. Haga clic en Aceptar. Gen5 rellenará automáticamente la plantilla de hoja de cálculo y abrirá el archivo en Excel.

6. Análisis de datos externos

1. Abra el archivo de exportación (.xlsx) en Excel.
2. Para cada pozo, divida cada valor individual por el valor de punto de tiempo 0:00 para ese pozo. Esto establecerá el punto de tiempo 0 igual a 1, y cada valor más allá de eso será relativo a la lectura inicial.
3. Abra un nuevo archivo en el software de análisis de datos. Seleccione la opción de diseño XY .
   NOTA: En este protocolo, se utilizó GraphPad Prism (versión 9.5.1).
4. Etiquetas de entrada para cada grupo de datos. Copie y pegue los puntos de tiempo y los valores normalizados correspondientes para cada grupo de tratamiento en la tabla Prism. Se generará automáticamente un gráfico para los datos que se puede encontrar en Gráficos.

Representative Results

Nuestro objetivo fue demostrar la viabilidad del uso de imágenes multiplexadas de células vivas para evaluar la respuesta terapéutica de la PDO. Se realizaron experimentos de prueba de concepto en dos modelos PDO separados de cáncer de endometrio: ONC-10817 y ONC-10811 (ver Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2 para ver los datos de ONC-10811). La apoptosis (tinción de anexina V) y la citotoxicidad (captación de Cytotox Green) se monitorizaron cinéticamente en respuesta al agente inductor de la apoptosis, la estaurosporina. Específicamente, las PDO se sembraron en placas de 96 pocillos, se trataron con colorantes rojo de anexina V y verde citotóxico, y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante la noche, como se muestra en el diagrama de la Figura 1. Confirmamos en dos modelos independientes de DOP que el tratamiento con colorantes de anexina V y verde de citotox no es tóxico (Figura complementaria 2). Al día siguiente, las PDO fueron tratadas con concentraciones crecientes de estaurosporina (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). Posteriormente, se establecieron protocolos en el software Gen5 y los experimentos se ejecutaron durante un período de 5 días, tomando imágenes cada 6 h. Los datos se analizaron utilizando la función de Análisis Celular en el software Gen5 como se describe en la sección 4 del protocolo. La máscara primaria se configuró utilizando la función de umbral automático con la opción "Dividir objetos táctiles" desactivada y con parámetros de tamaño mínimo: 30 μm y máximo: 1000 μm. La subpoblación de DOP se definió por circularidad > 0,25. Las intensidades medias de los objetos en los canales TRITC (anexina V, apoptosis) y GFP (verde citotóxico, citotoxicidad) dentro de la subpoblación designada de PDO se exportaron como un archivo .xlsx para su posterior análisis. La intensidad media del objeto para cada pozo en cada punto de tiempo en los canales GFP y TRITC se normalizó en el tiempo 0. A continuación, los datos de fluorescencia normalizados se transfirieron a un archivo Prism y se visualizaron como un gráfico de líneas.

El tratamiento con estaurosporina dio lugar a un aumento significativo de la apoptosis dependiente de la dosis y a una disminución de la salud celular a lo largo del tiempo en comparación con el control del vehículo, como lo demuestra el aumento de la intensidad media del objeto tanto en los canales TRITC (anexina V) como en GFP (citotox) (Figura 4, Figura 5, Video suplementario 1, Video suplementario 2, Video suplementario 3, Video Complementario 4, Video Complementario 5, Video Complementario 6 y Video Complementario 7). Las dosis de 500 nM, 100 nM y 10 nM de estaurosporina dieron lugar a un aumento estadísticamente significativo tanto de la apoptosis como de la citotoxicidad a lo largo del tiempo (Figura 5A-C), así como al final del experimento (Figura 5E, F). Además, la estaurosporina inhibió eficazmente el crecimiento y la formación de PDO a estas concentraciones, como lo demuestra una disminución general en el área total de PDO, mientras que los pozos de control exhibieron un aumento en el área total de PDO (Figura 4 y Figura 5D).

Dado que una de las principales ventajas de las imágenes de células vivas es la capacidad de corregir la variabilidad en la siembra, realizamos un experimento en el que se evaluó la viabilidad celular como medida de valoración. Los datos del ensayo de prueba de criterio de valoración se recopilaron mediante un modelo de PDO que se generó a partir de un xenoinjerto de cáncer de próstata derivado de un paciente. Se recogieron imágenes de campo claro al comienzo del período de tratamiento (día 0), seguidas de la adición de un reactivo de colorante dual que mide tanto la viabilidad (naranja de acridina, AO) como la muerte celular (yoduro de propidio, PI). El componente AO emite una señal fluorescente verde al unirse al ADN bicatenario, un indicador de la viabilidad celular. El componente PI tiñe las células nucleadas muertas y se puede utilizar para cuantificar la muerte celular en respuesta al tratamiento. Con el fin de tener en cuenta la variabilidad en el recubrimiento de PDO, ideamos un método para determinar el número de PDO por pocillo en el tiempo 0 mediante la conversión de imágenes de campo claro en imágenes de contraste de fase digital (Figura suplementaria 3 y archivo suplementario 1).

Las PDO de cáncer de próstata se trataron con daunorrubicina, un agente quimioterapéutico que causa la muerte celular, durante 7 días. Una vez finalizado el experimento, las muestras se tiñeron con AOPI como se describe en el Archivo Suplementario 1, seguido de un análisis de imágenes fluorescentes en Gen5. La Figura 6A muestra un panel de imágenes del ensayo de punto final AOPI en el día 7. Al comparar las PDO tratadas con el vehículo (fila uno) con las PDO tratadas con 10 μM de daunorrubicina (fila dos), hubo una clara disminución de la fluorescencia verde (medida de viabilidad, columna dos) y un aumento de la fluorescencia roja (medida de muerte celular, columna tres). Estos resultados se cuantificaron en la Figura 6B, donde se muestra la serie de lecturas que se pueden lograr utilizando la técnica de tinción de punto final AOPI. El gráfico superior izquierdo muestra la medición de viabilidad generada a partir de la tinción de AO, normalizada al recuento de PDO determinado por el análisis de imagen de contraste de fase digital de cada pocillo en el día 0. Estos datos se correlacionan con el resultado visual de la Figura 6A, según el cual a medida que aumentaba la concentración de daunorrubicina, la viabilidad disminuía drásticamente. Esto se recapitula aún más en el gráfico superior derecho, que demuestra un aumento en la muerte celular denotado por un aumento en la fluorescencia roja adquirida con la tinción PI.

A continuación, los datos del PI se combinaron con la lectura de viabilidad (AO) para calcular una relación entre lo viable y lo muerto (Figura 6B, gráfico inferior izquierdo). Esta proporción es un enfoque útil para determinar si un fármaco es citostático o citotóxico. Específicamente, un fármaco citotóxico alcanzará mucho más cerca de 0 que un fármaco citostático debido al hecho de que un fármaco que es citostático inhibirá el crecimiento, pero puede no inducir la muerte celular. Por último, el área de las PDOs puede calcularse con precisión utilizando la fluorescencia verde de la tinción AO, incluso cuando las PDOs pueden estar sufriendo muerte celular y formación de burbujas. El gráfico inferior derecho muestra el área promedio de la DOP, que se calculó como la suma del área denotada en el análisis de la subpoblación dividida por el número de DOP. El análisis del área puede dar más indicaciones sobre si un tratamiento simplemente está inhibiendo el crecimiento de la PDO o si en realidad está causando una regresión de la misma. Obsérvese que el análisis del área media de PDO se realizó utilizando el canal GFP y la función de Análisis Celular, a diferencia de la Figura 5D, que utilizó las imágenes de campo claro para calcular el área total de PDO. Estos datos ponen de manifiesto la flexibilidad de la canalización de análisis en función de la disponibilidad de los datos y el interés del usuario.

Finalmente, comparamos el estándar de oro para las lecturas de viabilidad, CellTiter-Glo 3D, con la lectura de fluorescencia de viabilidad utilizando AOPI (Figura 6C). Tenga en cuenta que los datos de este panel no se normalizaron al número PDO de tiempo 0, ya que los laboratorios que utilizan el kit CellTiter-Glo 3D no suelen realizar esta normalización. Observamos la misma tendencia para el efecto del fármaco en ambos ensayos, por lo que la viabilidad de la PDO disminuyó a medida que aumentaba la concentración de daunorrubicina. La única diferencia visual entre estas lecturas fue que el análisis CellTiter-Glo 3D alcanzó un IC50 antes del análisis AOPI y casi por completo llegó a 0. Este resultado puede explicarse por el mecanismo de acción de la daunorrubicina. La daunorrubicina es un inhibidor de la topoisomerasa-II que introduce roturas de ADN bicatenario, lo que conduce a la detención del ciclo celular y, finalmente, a la apoptosis¹⁴. Durante la detención del ciclo celular, puede ocurrir la depleción de ATP¹⁵. Dado que el ensayo CellTiter-Glo 3D se basa en una reacción ATP-luciferasa para generar una señal de luminiscencia, planteamos la hipótesis de que la reducción más fuerte en la viabilidad celular a concentraciones más altas de daunorrubicina se debió a la depleción de ATP en lugar de a la muerte celular completa. Apoyando esta idea, las imágenes de la Figura 6A muestran una población de PDO vivas en el cultivo, como lo denota la fluorescencia verde.

Figura 1: Descripción general del protocolo de siembra, imágenes y análisis. Las PDO se colocan en una placa de 96 pocillos y se tratan con tintes fluorescentes y fármacos. Los parámetros de imagen para el experimento (por ejemplo, exposición, pila Z) se crean en el software Gen5. Las imágenes son adquiridas por Cytation 5 y procesadas en Gen5, y los datos se exportan para su posterior análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general de la función de análisis celular. 1: Designar enchufe: Un enchufe se designa para incluir áreas de interés. 2: Establecer máscara principal: La máscara principal define los objetos de interés en función del tamaño y la intensidad de píxeles en un canal de elección. En esta imagen representativa, los objetos incluidos en la máscara principal están delineados en púrpura. 3: Definir subpoblación: Se puede definir una subpoblación adicional para refinar aún más la población deseada para el análisis. La subpoblación de la imagen de ejemplo (resaltada en amarillo) se define en función de la circularidad (>0,25) y el área (>800). Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 4x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplos de enmascaramiento de subpoblaciones mediante la función Análisis celular. Las subpoblaciones se definen en el canal de campo claro. La subpoblación de las imágenes de ejemplo (resaltada en amarillo) se define en función de la circularidad (>0,25) y el área (>800). Las imágenes se adquirieron con un objetivo 4X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El tratamiento con estaurosporina da lugar a un aumento de la apoptosis y la citotoxicidad dependiente de la dosis. Se muestran imágenes de campo claro (objetivo 4x) con superposición de fluorescencia GFP y TRITC para las dosis de 500 nM, 10 nM y 0,1 nM de estaurosporina en 3 puntos de tiempo: 0 h, 54 h, 114 h. La señal fluorescente roja indica apoptosis (anexina V) y la señal fluorescente verde indica citotoxicidad (citotox). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para evaluar la respuesta a PDO. El modelo PDO ONC-10817 se sembró en placas de 96 pocillos y se incubó con colorantes Annexin V Red (1:400) y Cytotox Green (200 nM) durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las PDO fueron tratadas con concentraciones crecientes de estaurosporina y se obtuvieron imágenes cada 6 h durante ~5 días. (A,B) Aumento dependiente del tiempo y de la dosis en (A) citotoxicidad o (B) apoptosis en respuesta a estaurosporina. Los datos se graficaron como la intensidad media del objeto en el canal GFP o TRITC. (C) Comparación del curso temporal de la apoptosis y la citotoxicidad en respuesta a estaurosporina de 100 nM o 500 nM. Los datos se graficaron como los valores de la intensidad media del objeto en los canales GFP y TRITC. (D) La estaurosporina inhibe el crecimiento de las PDO. Los datos se graficaron como el área total promedio de la DOP. Los datos en A-D se normalizaron al número de PDO en el tiempo 0 h en cada pocillo y se graficaron como la media y el error estándar de la media (SEM). N=5 réplicas técnicas por tratamiento. p < 0,0001 frente al control del vehículo por ANOVA de 2 vías. (E) Imágenes representativas de campo claro, GFP y TRITC de PDOs tratadas con estaurosporina de 500 nM frente al vehículo al final del experimento (114 h). Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 4x. (F) Cuantificación de citotoxicidad, apoptosis y viabilidad en el punto de tiempo de 114 h. La intensidad media del objeto GFP (izquierda) y la intensidad media del objeto TRITC (centro) se calcularon en el punto de tiempo de 114 h utilizando los resultados de los paneles A-C. La viabilidad (derecha) se evaluó utilizando el reactivo CellTiter-Glo 3D según el protocolo del fabricante. Los valores de luminiscencia bruta (RLU) se normalizaron al área total de PDO en el tiempo 0 h y se trazaron como la viabilidad del plegamiento en relación con el control del vehículo, que se estableció en 1.0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 frente al control del vehículo a través de ANOVA de un factor con la prueba post-hoc de Dunnett. N = 5 repeticiones técnicas por tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Uso de imágenes de células vivas para ayudar en la normalización de los datos del ensayo de punto final. Las PDO se trataron con concentraciones crecientes del inhibidor de la topoisomerasa II, daunorrubicina, durante 7 días. Los PDO se expusieron a la solución de tinción AOPI y se obtuvieron imágenes como se describe en el Archivo Suplementario 1. AO = naranja de acridina, una medida de viabilidad (canal GFP); PI = yoduro de propidio, una medida de la muerte celular (canal rojo de Texas). (A) Imágenes representativas adquiridas mediante tinción AOPI después de 7 días de tratamiento con 10 μM de daunorrubicina o control de vehículo (0,1% de DMSO). (B) Diferentes lecturas utilizando la fluorescencia AOPI como método de viabilidad / muerte celular de punto final. Véase el Archivo Complementario 1 para una descripción detallada de los métodos de análisis. Arriba a la izquierda, análisis de la viabilidad de la PDO después de 7 días determinada por tinción AO. Arriba a la derecha, análisis de la muerte celular por tinción de PI. Los datos para la tinción de AO e PI se normalizaron al número de PDO en el tiempo 0 h y luego al control del vehículo, que se estableció en 1,0, y se graficaron como la media y la desviación estándar. Abajo a la izquierda, cálculo de la relación entre lo viable y lo muerto utilizando las integrales de objeto promedio para las tinciones AO y PI. Abajo a la derecha, área de PDOs determinada por la tinción AO. El análisis celular se realizó en el canal GFP. (C) Comparación de dos métodos para probar la viabilidad de la DOP. Después de la obtención de imágenes, se evaluó la viabilidad utilizando el reactivo CellTiter-Glo 3D según el protocolo del fabricante. La supervivencia del pliegue en relación con el control del vehículo se graficó a concentraciones crecientes de daunorrubicina. Los datos representan la media y la desviación estándar para N = 6 réplicas técnicas por tratamiento; los datos no se normalizaron al tiempo 0 h en el panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tratamiento	# de pozos	Volumen de medios	Anexina		Citotox de 100 μM
			Dilución	Volumen	Dilución	Volumen
Multiplexar	60	6,6 ml	1:400	16,5 μL	200 nM	13,2 μL

Tabla 1: Ejemplo de experimento de multiplexación. La anexina V roja se une a la fosfatidilserina expuesta en la valva externa de las membranas celulares apoptóticas. Cytotox Green se integra en las células con integridad de membrana comprometida y se une al ADN.

Figura suplementaria 1: Imágenes multiplexadas de células vivas de ONC-10811. Las PDO se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron en colorantes Annexin V Red (1:400) y Cytotox Green (200 nM) durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las PDO fueron tratadas con concentraciones crecientes de estaurosporina y se tomaron imágenes cada 6 h durante 5 días. (A) Aumento de la citotoxicidad dependiente del tiempo y de la dosis en respuesta a la estaurosporina. Los datos se graficaron como la intensidad media del objeto en el canal GFP. (B) Dosis-respuesta de estaurosporina a las 114 h. Los datos se trazaron como los valores de la intensidad media del objeto en el canal GFP en el punto de tiempo de 114 h. (C) Aumento de la apoptosis dependiente del tiempo y de la dosis en respuesta a la estaurosporina. Los datos se graficaron como la intensidad media del objeto en el canal TRITC. (D) Dosis-respuesta de estaurosporina a las 114 h. Los datos se graficaron como los valores de intensidad media del objeto en el canal TRITC en el punto de tiempo de 114 h. Los datos en A y C se normalizaron al número de PDO en el tiempo 0 h a nivel de pozo. N = 5 réplicas técnicas por tratamiento en cada modelo. p < 0,0001 frente al control del vehículo por ANOVA de 2 vías. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: El tratamiento con Anexina V y Citotox no altera la viabilidad de la PDO. Las PDO se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con colorantes Annexin V Red (1:400) y Cytotox Green (200 nM) durante la noche a 37 °C. Después de la incubación de 24 h, se evaluó la viabilidad mediante el ensayo CellTiter-Glo 3D según el protocolo del fabricante. (A) Viabilidad en DOP tratadas con colorante y sin tratar en el punto de tiempo de 24 h. Se presentan tanto los valores relativos de la unidad de luz (RLU) como los valores normalizados al área de suma de PDO. Específicamente, la RLU de CellTiter-Glo3D para cada pocillo se normalizó a la suma del área de PDO para ese pocillo en el momento de la siembra (es decir, inmediatamente después de la adición del colorante). El área total de PDO se determinó utilizando el cálculo del "Área de Suma de Objetos" en Análisis Celular. N = 10. (B) Viabilidad en DOP tratadas con colorante y sin tratar en el punto temporal de 114 h. Se presentan tanto los valores de luminiscencia bruta como los valores normalizados al área total de PDO. La RLU de CellTiter-Glo3D para cada pocillo se normalizó a la suma del área de PDO a las 24 h después de la siembra, que corresponde al tiempo 0 h en los experimentos de imágenes cinéticas. N = 5. La significación en A y B se evaluó mediante una prueba t no pareada; Los valores de p se enumeran en los gráficos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Análisis sin etiquetas de las PDO mediante contraste de fase digital. Esta figura contiene imágenes representativas (objetivo de 2,5x) que representan el análisis sin etiquetas como se describe en el Archivo complementario 1: Configuración de parámetros de imagen para un solo plano focal de análisis de vista (imágenes de campo claro/contraste de fase digital) y análisis de imagen de contraste de fase digital en el software Gen5. (A) Ejemplo de imagen de campo claro de un modelo PDXO de cáncer de próstata en un solo plano focal. (B) La imagen de campo claro en A se convirtió en una imagen de contraste de fase digital. Los objetos oscuros de la imagen de campo claro aparecen brillantes en la imagen de contraste de fase digital y viceversa. (C) Ejemplo de enmascaramiento PDO utilizando la imagen de contraste de fase digital. Tenga en cuenta que los bordes de los objetos de interés se vuelven mucho más definidos en comparación con las imágenes de campo claro. En esta imagen representativa, los objetos de la máscara principal están resaltados en amarillo. La subpoblación en (C) (delineada en rosa) se define en función de la circularidad (>0.3), el área (>1000), la media[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 y el pico[Dig.Ph.Con] > 12500. Los parámetros utilizados en esta figura representativa se aplicaron a los datos de la Figura 6 para normalizar el recuento de células en el día 0. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Los modelos de DOP pueden variar en su morfología y consistencia de recubrimiento. Panel superior: Ejemplos de dispersión diferencial de PDOs en los domos BME. Panel inferior: Imágenes representativas de las DOP discoéricas frente a las circulares. Todas las imágenes fueron adquiridas con un microscopio EVOS. Se anotan los aumentos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Imágenes de ejemplo utilizando el análisis celular frente a la estadística de imágenes para cuantificar la fluorescencia. Con el análisis celular, los usuarios pueden definir poblaciones específicas dentro de una imagen y medir la fluorescencia en esas regiones. Las estadísticas de imagen también se pueden utilizar para medir la fluorescencia en una imagen definiendo un umbral para excluir las señales de fondo. Consulte la Discusión para conocer las limitaciones del uso de estadísticas de imagen. Las imágenes tienen un aumento de 4x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Componentes de los medios de cultivo de organoides. Tenga en cuenta que los reactivos se han optimizado para el cultivo de PDO de cáncer ginecológico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 1: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 500 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 2: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 100 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 3: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 10 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo complementario 4: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 1 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 5: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 0,1 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 6: Vídeo time-lapse del tratamiento con estaurosporina de 0,01 nM con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Vídeo complementario 7: Vídeo time-lapse del vehículo (0,06% DMSO) con imágenes adquiridas cada 6 h. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Complementario 1: Protocolos Complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Los cultivos de PDO se están convirtiendo en un sistema modelo in vitro cada vez más popular debido a su capacidad para reflejar las respuestas y comportamientos celulares². Se han logrado avances significativos en las técnicas de generación, cultivo y expansión de PDO, pero los métodos para analizar las respuestas terapéuticas se han retrasado. Los kits de viabilidad 3D disponibles en el mercado son ensayos de criterios de valoración líticos, que pierden datos de respuesta cinética potencialmente valiosos y limitan los análisis posteriores por otros métodos⁸. Los estudios emergentes están aplicando imágenes de células vivas para evaluar las respuestas a los fármacos en modelos de PDO. Aquí, presentamos un método para evaluar las respuestas terapéuticas de PDO a lo largo del tiempo utilizando imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas. La multiplexación de colorantes fluorescentes permite cuantificar simultáneamente diferentes respuestas celulares. Además de la apoptosis y la citotoxicidad, prevemos que este enfoque pueda ampliarse en futuros estudios para examinar otros efectos fenotípicos en las PDO.

El protocolo presentado en este documento está diseñado para adquirir imágenes cinéticas de campo claro y fluorescentes de PDOs recubiertas como domos en una placa de 96 pocillos. Los pasos clave incluyen 1) siembra, 2) tratamiento con colorante y fármaco, 3) definición de parámetros de imagen, 4) preprocesamiento y análisis de imágenes al finalizar la adquisición cinética de imágenes, y 5) exportación de datos para su análisis en otro software estadístico (Figura 1). Los PDO intactos se recubren en una placa de 96 pocillos como domos BME de 5 μL compuestos por una proporción predefinida de BME y medios de cultivo de organoides (normalmente 1:1). El protocolo presentado en este documento utiliza UltiMatrix como BME debido a la mínima variabilidad de lote a lote y a las propiedades ópticas superiores para la obtención de imágenes. Pueden ser necesarias modificaciones para la recolección de PDOs cultivadas en otras BMEs, como Matrigel, así como para modelos que son grumosos y difíciles de disociar (ver ejemplos de la Figura suplementaria 4). A continuación, se añaden colorantes fluorescentes a los medios de cultivo de organoides en el momento de la siembra (día -1) a una concentración de 2x en un volumen de 100 μL y se incuban durante la noche para determinar la muerte celular basal. Al día siguiente (Día 0), se añaden fármacos u otros tratamientos a los medios de cultivo de organoides a una concentración de 2x en un volumen de 100 μL, y luego se añaden a cada pocillo para obtener un volumen final de 200 μL. El volumen final de 200 μL reduce el efecto de menisco con la imagen. Las imágenes cinéticas se adquieren utilizando el lector de placas Cytation 5 asociado con la incubadora de mesa BioSpa. La incubadora BioSpa permite la incubación de placas experimentales a una temperatura fija de 37 °C y un ambiente de 5% de CO₂ . Se pueden almacenar hasta 8 placas en el BioSpa y, por lo tanto, se pueden realizar 8 experimentos simultáneamente. Los parámetros de imagen para cada placa se configuran en el software Gen5 utilizando el "Modo manual del generador de imágenes" y se guardan como un protocolo. A continuación, el protocolo se carga en el software de programación (BioSpa OnDemand). El software BioSpa OnDemand automatiza el flujo de trabajo para la adquisición de imágenes cinéticas, incluida la transferencia física de la placa desde la incubadora BioSpa a Cytation 5 y dicta qué protocolo ejecutar en Gen5 para la recopilación de datos. Las imágenes se analizan utilizando la función de análisis celular en el software Gen5 (Figura 2). Describimos métodos específicos para analizar proyecciones Z de imágenes fluorescentes y de campo claro. En el Archivo Suplementario 1 se proporcionan métodos específicos para analizar planos Z individuales y/o solo imágenes de campo claro. Por último, los usuarios pueden definir características de datos específicas, como el área de PDO, el número y la intensidad media de fluorescencia, para exportarlos como una hoja de cálculo de Excel para su posterior análisis estadístico de los efectos de los fármacos.

Dado que los modelos de PDO son un sistema modelo relativamente nuevo para interrogar los efectos de las drogas, todavía están surgiendo métodos para adaptarse a las condiciones de cultivo, en particular el crecimiento en BME¹⁶. La mayor parte de los estudios que evalúan la respuesta de la PDO al tratamiento farmacológico se basan en ensayos de valoración basados en ATP como sustituto de la salud celular (CellTiter-Glo 3D). Este método requiere lisis celular, lo que impide los análisis posteriores. Los ensayos de criterios de valoración alternativos, como la tinción fluorescente, las imágenes de punto de tiempo único y el seguimiento morfológico, han proporcionado otras métricas para caracterizar la respuesta a los fármacos, al tiempo que permiten el uso de muestras para fines adicionales. Por ejemplo, se han aplicado protocolos de fijación de puntos finales en placa para el análisis de alto rendimiento de los efectos de los fármacos^17,18. Una ventaja de este método es que evita el extenso procesamiento requerido en la inmunohistoquímica típica y las imágenes inmunofluorescentes¹⁹ y es particularmente útil cuando la muestra es limitada, como es el caso de los modelos PDO. También es susceptible de obtener imágenes de alta resolución con microscopía confocal. Otro ensayo de criterio de valoración que no requiere lisis celular es la obtención de imágenes de células vivas con reactivos como yoduro de propidio o naranja de acridina. Nuestro análisis comparativo de CellTiter-Glo 3D y AOPI, el último de los cuales no requiere lisis celular, para la evaluación de la viabilidad y muerte celular (Figura 6C) destaca las ventajas de utilizar colorantes de imagen de células vivas en modelos de PDO. Este método ha sido aplicado por varios grupos, incluido el nuestro, para evaluar los efectos fenotípicos al final de un experimento 18,19,20. Sin embargo, la adquisición de datos cinéticos mediante los métodos de obtención de imágenes de células vivas en el pocillo o de punto final requiere una muestra significativa. La evaluación morfológica sin marcaje de las PDOs a lo largo del tiempo supera en parte esta limitación y puede evaluarse utilizando una amplia gama de modalidades de imagen 8,10,17,18, sin embargo, los cambios en la morfología pueden no ser representativos del espectro de posibles efectos farmacológicos, como la apoptosis y los cambios en la viabilidad celular. Hemos observado una variabilidad significativa de modelo a modelo en los cambios morfológicos en la respuesta a los fármacos. Por ejemplo, algunos PDO aumentarán de área a medida que se sometan a la apoptosis, mientras que otros modelos pueden reducirse. Las evaluaciones morfológicas cinéticas se han multiplexado con ensayos de punto final fluorescente fijo o de células vivas en un número limitado de estudios^18,20. Los métodos presentados en este documento se encuentran entre los primeros en multiplexar diferentes colorantes fluorescentes para evaluar simultáneamente múltiples efectos celulares en un sistema de alto rendimiento.

Una de las mayores mejoras proporcionadas por las imágenes cinéticas de células vivas es que supera las limitaciones clave asociadas con los ensayos de punto final. Por ejemplo, el recubrimiento de un número igual de PDO por pocillo es técnicamente difícil porque la mayoría de los contadores de celdas automatizados están cerrados para objetos menores de 60 μm. Las imágenes de células vivas permiten la normalización al número o área de PDO en el tiempo 0 h en cada pocillo, que luego se puede utilizar para ajustar la variación en la siembra entre pocillos. El criterio de valoración de referencia para las PDO es el kit CellTiter-Glo 3D, que mide el ATP como sustituto de la viabilidad celular. Hemos utilizado ampliamente este ensayo en nuestros estudios de cáncer ginecológico y de próstata^PDOs 13,21,22,23,24. Además de requerir lisis celular para medidas de ATP, los fármacos y otras modalidades terapéuticas pueden alterar los niveles de ATP, lo que puede proporcionar una evaluación inexacta de la respuesta terapéutica. El uso de colorantes de imágenes de células vivas permite cuantificar un alcance más amplio de respuestas celulares específicas, como la apoptosis y la citotoxicidad. Es importante destacar que estos reactivos no perturban la viabilidad celular ni inducen daños en el ADN, como es el caso del yoduro de propidio; esto permite una evaluación repetida de la respuesta de la PDO a lo largo del tiempo. Si bien no hemos explorado el uso de naranja de acridina (AO) para medidas cinéticas, el mecanismo de acción de la AO no debería excluir dicha aplicación en el futuro.

Los tumores consisten en varias poblaciones celulares distintas con diferentes perfiles genómicos y morfologías. Debido a la compleja heterogeneidad de los modelos de PDO, las respuestas individuales de PDO pueden variar, y el seguimiento de estas respuestas es un desafío. Nuestro protocolo proporciona un método para evaluar múltiples métricas de respuesta de PDO pozo por pozo. Sin embargo, ciertas consideraciones técnicas siguen siendo válidas para la obtención de imágenes de células vivas. El número de pocillos de una placa de 24 pocillos necesarios para sembrar una placa de 96 pocillos dependerá de la densidad y la tasa de crecimiento de cada modelo de DOP. Debido a que la aglomeración puede confundir el análisis de imágenes (Figura suplementaria 4), los modelos PDO pueden necesitar pasos de procesamiento adicionales antes del enchapado. Si es necesario, las PDO se pueden cortar mecánicamente durante el procesamiento mediante un pipeteo vigoroso con una punta p200 de diámetro no ancho. La digestión enzimática con TrypLE Express también se puede emplear antes de la siembra para promover la disociación de PDO y la disminución de la aglomeración. En nuestra experiencia, hemos observado que la duración de la incubación de TrypLE es muy variable según el modelo. Por lo tanto, la incubación de TrypLE debe optimizarse para cada modelo, especialmente si los investigadores desean obtener suspensiones unicelulares. El tiempo de recuperación antes de comenzar el tratamiento puede ser necesario para los modelos de PDO que son particularmente sensibles a la digestión enzimática.

Presentamos métodos para reactivos específicos de imagen de células vivas. Una limitación en la amplia aplicabilidad de los métodos presentados en este documento es la escasez de reactivos que sean compatibles con BME. En el caso de otros colorantes/reactivos que aún no se han optimizado para su uso en DOP, puede ser necesaria una solución de problemas adicional para determinar la concentración óptima y minimizar los efectos de los disolventes. Dependiendo de la lectura de interés (p. ej., apoptosis o citotoxicidad), se debe utilizar el tratamiento con un compuesto conocido por inducir la muerte celular, como la estaurosporina o la daunorrubicina¹³ para optimizar las condiciones de los reactivos. Una consideración adicional es el momento óptimo para la integración del tinte en la cúpula BME. En nuestros experimentos, realizamos una incubación nocturna antes del tratamiento para permitir la absorción completa del tinte en los domos, así como para determinar la salud celular de referencia. Dado que la intensidad de la señal aumentará con el tiempo, los investigadores deben realizar estudios piloto con los tintes para determinar el tiempo de exposición ideal al final del experimento para evitar imágenes sobreexpuestas. Por último, los reactivos no deben interferir con los procesos celulares. Por ejemplo, los colorantes que se intercalan en el ADN no son compatibles con las imágenes cinéticas. Sin embargo, las imágenes de células vivas se pueden utilizar para la normalización de datos en ensayos de punto final. De hecho, presentamos un método complementario para cuantificar la viabilidad celular y la relación viable: célula muerta utilizando AOPI. En este experimento, la señal fluorescente se normaliza al número de PDO para cada pocillo, determinado por imágenes de células vivas en el día 0 (día del tratamiento, Figura 6).

Otra limitación de este documento de métodos es la dependencia del pipeteo manual para los experimentos, lo que puede conducir a una mayor variación en las réplicas técnicas. Se pueden lograr mejoras adicionales en la reproducibilidad de los datos con la adición de la automatización a otros pasos del proceso experimental, como el uso de un manipulador de líquidos automatizado para la colocación en placas y la dispensación de medicamentos, como se ha demostrado en otros ^8,10. Sin embargo, esta adición requiere una inversión adicional en infraestructura de investigación que puede no estar disponible para todos los investigadores. Dada la heterogeneidad en el área de PDO para cada modelo, normalizar los resultados al número o área inicial de PDO en el tiempo 0 h sigue siendo un enfoque útil con la siembra automatizada.

Una ventaja clave de Cytation 5 sobre otras plataformas de imágenes de células vivas es la capacidad de personalizar las características de imagen y análisis. Sin embargo, el software Cytation 5/Gen5 tiene una curva de aprendizaje pronunciada y asume que los usuarios tienen un conocimiento básico de imágenes. Uno de los objetivos de este artículo sobre métodos es proporcionar instrucciones paso a paso para disminuir la barrera para que otros investigadores incorporen técnicas sofisticadas de imágenes de células vivas en sus programas de investigación de PDO. Si bien los pasos de análisis específicos que se presentan en este documento son para un sistema, los usuarios pueden aplicar los principios de multiplexación a otras plataformas, con el entendimiento de que el análisis posterior puede requerir el uso de software de terceros, como NIH ImageJ.

Las métricas de análisis deben elegirse en función de los objetivos experimentales y las condiciones de recubrimiento. Por ejemplo, si el experimento se lleva a cabo utilizando un tinte fluorescente para cuantificar la muerte celular, la intensidad de la fluorescencia es una lectura eficaz. La métrica de fluorescencia más efectiva (fluorescencia total vs. intensidad media del objeto) dependerá de las condiciones de siembra (Figura complementaria 4). Si las PDO se dispersan uniformemente y tienen una morfología más circular y cohesiva, se puede determinar la fluorescencia en una subpoblación definida de PDO. La función específica en el software Gen5 es Análisis celular y la salida es Intensidad media del objeto. Sin embargo, si el modelo de PDO es grumoso o tiene una morfología discohesiva, recomendamos cuantificar la señal de fluorescencia a nivel de imagen; esta función se puede encontrar en Estadísticas de imagen, y la salida es Intensidad de fluorescencia total. Si bien este método es útil para observar los cambios a nivel de pozo individual, esta métrica no es específica para los objetos de interés y podría cambiar erróneamente si los PDO se mueven fuera del tapón designado durante la duración del experimento. En escenarios en los que hay residuos significativos o células individuales muertas, se sugiere el uso del análisis celular para bloquear cualquier señal fluorescente que no esté específicamente asociada con una PDO. En la Figura complementaria 5 se presenta un ejemplo de resultados diferenciales utilizando el análisis celular frente a la estadística de imágenes.

Para determinar el umbral óptimo para la función Estadísticas de imagen, se puede utilizar la herramienta de línea. Con la herramienta de línea, los usuarios pueden determinar el rango de intensidad de fluorescencia dentro de una imagen. Establecemos el umbral inferior como el valor del 25% de la intensidad máxima dentro de la imagen. Para ver las áreas fluorescentes que se incluyen en el umbral designado, marque la casilla "Valores atípicos de umbral". Es posible que sea necesario realizar un ajuste fino adicional del valor umbral inferior.

Un desafío importante en la obtención de imágenes de células vivas es almacenar la enorme cantidad de datos generados con cada experimento. Esto es particularmente relevante en el caso de las culturas PDO, donde los Z-Stacks se utilizan para obtener imágenes a través de varios planos focales y generar una proyección Z. Existen múltiples métodos para superar este problema. En primer lugar, garantizar una capacidad de almacenamiento adecuada. Hemos instalado tres discos duros de estado sólido con un total de 17 TB. Otras opciones incluyen la transferencia de archivos experimentales a discos duros externos o almacenamiento en red. No se recomienda escribir archivos directamente en el almacenamiento basado en la nube. Para analizar los datos que se han almacenado en una unidad externa, simplemente transfiera el experimento y los archivos de imagen a una computadora equipada con el software Gen5 (NOTA: los archivos grandes pueden tardar largos períodos de tiempo en transferirse). Antes del análisis, las imágenes deben volver a vincularse al experimento. Abra el archivo del experimento, haga clic en Protocolo en la barra de herramientas y seleccione Opciones de protocolo. Haga clic en Opciones de guardado de imágenes y haga clic en Seleccionar nueva carpeta de imágenes. Localice el archivo de imagen y haga clic en Seleccionar carpeta para volver a vincularlo.

Dependiendo de los objetivos del experimento, también puede ser adecuado utilizar la función de discretización dentro de Gen5. La agrupación disminuye el tamaño del archivo al reducir el número de píxeles, lo que conduce a una resolución de imagen más baja (consulte el paso 3.5.3.2). Por lo tanto, no se recomienda la agrupación en bins si se requieren imágenes de alta resolución. Al utilizar la función de agrupación, será necesario ajustar la configuración de exposición. Una vez que se haya creado el archivo experimental, haga doble clic en la sección Imagen y haga clic en el icono del microscopio para volver a abrir el modo manual del generador de imágenes. Utilice la función de exposición automática o ajuste manualmente la exposición según sea necesario.

En resumen, presentamos métodos para evaluar la apoptosis y la salud celular de las PDOs en respuesta a agentes citotóxicos. Son necesarios estudios futuros para optimizar los métodos y desarrollar estrategias de análisis adicionales para la obtención de imágenes cinéticas de las PDO, como otros fenotipos y efectos de fármacos que son citostáticos en lugar de citotóxicos. Un obstáculo importante es la disponibilidad comercial de colorantes y reactivos compatibles con BME. Todavía se necesita más trabajo para comprender mejor cómo se pueden utilizar completamente las imágenes cinéticas de células vivas para extraer la mayor cantidad de datos de estos modelos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)