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对形成冠层的巨型海带进行野外采集和实验室维护，以促进恢复

Published: June 7, 2024 doi: 10.3791/66092
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1, 1, 1
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Santa Cruz, 3Facultad de Ciencias Marinas, Universidad Autónoma de Baja California, 4Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Baja California, 5Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, 6The Nature Conservancy

Summary

该协议描述了播种有树冠形成巨型海带的基质的田间收集和定期实验室维护，用于恢复试验，以解决“绿色砾石”技术在田间环境中的成功和局限性。

Abstract

形成冠层的海带是重要的基础物种，支持生物多样性并提供每年价值超过5000亿美元的生态系统服务。由于气候驱动的生态压力因素，全球巨型海带森林的减少凸显了创新恢复战略的必要性。一种被称为“绿色砾石”的新兴恢复技术旨在在没有大量水下劳动的情况下在大面积上播种年轻的海带，并且由于成本效益和可扩展性，它是一种很有前途的恢复工具。这篇视频文章说明了培养巨型海带 Macrocystis pyrifera 的方案和工具。它还为进一步研究提供了资源，以解决这种方法在现场环境中的成功和局限性。我们概述了使用“绿色砾石”技术收集生殖组织、孢子、接种、饲养、维护和监测早期生命阶段播种的基质的现场和实验室方法。该协议简化和集中了该领域当前的恢复实践，以支持研究人员、管理人员和利益相关者实现海带保护目标。

Introduction

树冠形成的海带（海带目褐藻）是全球重要的基础物种，在温带和北极海域的沿海岩礁中占主导地位1。这些海带形成了结构复杂且高产的生物生境，称为海带森林，支持分类学上多样化的海洋群落2。全世界的海带森林为人类提供了许多生态系统服务，包括商业渔业生产、碳和养分循环以及娱乐机会，估计每年的总价值为 5000 亿美元3。

尽管海带森林具有巨大的价值，但在许多地区，海带森林面临着日益增长的人为压力3。由于长期的海洋变暖以及温度异常频率的增加，气候变化对海带构成了最大的威胁之一3,4,5,6,7。海洋温度升高与营养限制有关8，而暴露于高于生理阈值的热应激可导致死亡9。结合可变的区域局部压力源7，全球海带种群每年下降约2%10，在某些地区损失惨重，并持续向交替的社区状态转移6,11,12,13,14。仅靠海带种群的自然恢复可能不足以扭转目前和预计损失的程度15,16,17,18，这突出了积极恢复的重要性。

目前的海带恢复工作可以使用多种方法的组合，在沿海岩礁上重建这些重要的基础物种3,19。为解决特定地点问题而选择的方法取决于地理环境、海带恢复的具体障碍以及社会生态环境11.了解社会生态系统之间的联系和相互依存关系是关键，让地方机构参与并获得当地社区支持的干预措施可以提高恢复工作成功的可能性20.

除气候变化外，食草动物压力或种间竞争也会推动、下降或抑制恢复（例如，海胆13、草食性鱼类21、22、草皮藻类 9,23 或入侵藻类24）。恢复可能侧重于去除这些生物应激源25，尽管这些方法需要大量资源和持续维护11。为了促进海带物种的恢复，人们一直在努力采用直接播种方法，例如，将装满肥沃海带叶片的网袋称重到将游动孢子释放到环境中的底栖动物中 26.然而，这种方法非常耗时，并且需要技术性的水下安装和拆除。其他情况侧重于移植大量完整的成年供体植物，这可能会损害密切相关和脆弱的供体种群，并且由于依赖连续移植，通常仅限于小规模27.

对于海带孢子限制可能因生境破碎化而阻碍海带森林恢复的地区，引入了一种相对较新的海带恢复方法，称为“绿色砾石”技术。该技术在挪威南部的Flødevigen研究站成功进行了试验28，由于成本效益和可扩展性，该技术代表了一种很有前途的恢复选择。该技术的工作流程如下：（1）从田间繁殖成鱼中收集的肥沃组织中产生孢子溶液，然后播种到小基质上，例如砾石;（2）在实验室控制的非生物条件下在基质上饲养早期海带;（3）具有可见孢子体的基质作为 “绿色砾石” 部署在特定珊瑚礁的田间，孢子体继续生长。请注意，成年个体的典型移植工作需要潜水员费力且成本低廉的水下安装，而“绿色砾石”技术使用从水面28 的简单部署。

目前，许多国际工作组29的成员正在尝试“绿色砾石”技术，这些工作组涉及不同的环境和几种海带物种。该协议描述了在使用巨型海带 Macrocystis pyrifera 在田间部署这种恢复技术之前，组织收集、孢子形成、播种、饲养条件、定期维护和监测早期海带所需的设施、材料和方法。该协议是研究人员，管理人员和利益相关者的宝贵资源，他们寻求深入了解该方法在不同田间环境中对M. pyrifera的成功和局限性。

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Protocol

本协议中描述的海带组织由加州鱼类和野生动物部根据 S-202020004-20205-001 许可证收集和监督。

1. 设施和材料的准备

  1. 确保海带养殖设施能够保持温度（10-15°C），提供全光谱光（0-180μmol光子m-2 s-1）和过滤曝气（0.2μm孔径）。使用带有内置插座或接入端口的培养箱系统，用于电线和管道、灯和气源（图 1）。如果孵化器系统不在项目的范围、预算或预期规模范围内，请使用由凉爽的天然海水或冷却器回火的水浴（图 2）。具体细节请参考 材料表 。
    1. 将温度计放入生长培养基中或使用温度枪确保温度在 10-18 °C 之间。
      注：饲养温度因地和季节而异，为30。
    2. 通过更改光源上的定时设置或使用机械计时器，将全光谱光编程为 12 小时光周期：12 小时暗。在砾石附近的表面以下使用防水光合有效辐射 （PAR） 量子计测量光强度，并使用可调光光源或通过分层玻璃纸（在营养配子体培养的情况下，参见 第 9 节）或在光源上网格（有关光强度调整的详细信息，请参阅 第 6.3 节）进行调整。
    3. 孢子形成后一天使用气泵31 确保适当的曝气。使用过滤器（0.2μm孔径）减少空气中的细菌污染。
      注意：对于“绿色砾石” 培养，曝气压力必须足以使所有培养容器中的水循环，同时不干扰早期海带与播种基质的附着。如果存在膨胀的配子体生物量（见 第 9.2 节），曝气压力必须足以维持悬浮在培养基中的配子体。
  2. 对材料和工位进行消毒。提前准备这些（见 材料表）。
    1. 使用70%异丙醇清洁表面。如果可能的话，在 “绿色砾石”苗圃外处理生殖组织并清洁收集设备。
    2. 使用以下灭菌方法：使用实验室级洗涤剂冲洗，然后用蒸馏水彻底冲洗，浸泡在稀释的漂白剂溶液中（根据制造商的说明），然后用蒸馏水彻底冲洗，并使用适当的设置（玻璃器皿或器械）进行高压灭菌器。灭菌后，材料可以存放在密封容器中或用箔纸包裹。
    3. 使用实验室级洗涤剂擦洗和清洁带盖的容器，然后用蒸馏水彻底冲洗。
      注意：带盖的培养容器将有助于减少生长培养基的蒸发。将盖子稍微打开以允许空气交换，或使用止回阀以减少空气污染。如果没有带盖的容器，请用石蜡膜等热塑性塑料密封培养容器，并打孔 2-3 个孔。如果使用较大的水箱，请使用由透明塑料制成的防蒸发盖。
    4. 确保砾石具有纹理或轻微凹陷的表面，因为配子体更有可能保留在具有高粗糙度的基质上 32,33。擦洗并冲洗砾石，直到水变清，以去除任何灰尘或碎屑。将砾石浸泡在10%稀释的漂白剂溶液中至少24小时，并用过滤灭菌的海水冲洗（参见第2.1节）。或者，在擦洗和冲洗后，将砾石浸泡在去离子 （DI） 水中1 周 32.
      注意：理想情况下，使用当地收获的基质来减少对修复部位的污染。或者，建议使用水族箱级砾石。避免石灰石等钙质基质，这会导致移植海带的组织漂白和随后的死亡32.

2.生长培养基的制备

  1. 根据资源可用性，根据以下方法过滤和消毒海水。计算每周更新培养容器所需的过滤灭菌海水量（见 第 7 节），并相应地安排此过滤/灭菌任务。将大批量过滤灭菌的海水储存在深色容器中，在8-10°C下储存长达6个月。 如果没有冷藏，请存放在黑暗、阴凉的地方。
    1. 使用孔径为0.55-1μm的真空过滤系统过滤水。在将所有水拉入之前关闭真空源，以免损坏过滤器，并将过滤后的水倒入专用的无菌容器中。对于较大的体积，请使用流通式过滤系统。例如，让海水流过一系列三个褶皱过滤器（10 μm、5 μm 和 1 μm），从最大到最小的孔径排列。
      注意：如果无法获得天然海水，可以制备人工海水。或者，天然海水可以从水族箱商店批量购买，并且通常经过过滤、消毒和 pH 平衡。对于这些选项，媒体扩充仍然是必要的。
    2. 使用紫外线和/或高压灭菌方法对过滤后的海水进行灭菌。以制造商推荐的流速将流通系统连接到水族箱紫外线灯。将海水高压灭菌在高压灭菌安全的玻璃器皿中，盖子略微打开或用箔纸覆盖，并进行液体循环（121°C;1-2 PSI，15-30分钟，取决于液体的体积34。
      注意：建议在培养的早期阶段使用高压灭菌过滤的海水。
  2. 用营养物质和维生素富集过滤灭菌的海水对 M. pyrifera 的生长至关重要。Provasoli 富集海水培养基 （PES） 是一种广泛使用的培养基，设计用于藻类培养35。从藻类培养中心购买此培养基。用于 M. pyrifera 生长的 PES 和附加维生素的制备方法在34 中描述。
    1. 每 1 升过滤海水用 20 mL PES 富集。或者，使用工业级培养基。
    2. 根据制造商的建议存储浓缩解决方案。当需要生长培养基时，富集过滤灭菌的海水，以避免富集溶液降解。

3. 现场收集

  1. 确定孢子叶收集的时间，以模拟当地 M. pyrifera 种群的自然繁殖周期。 咨询当地专家（例如，海带研究人员、管理人员、生态学家、公民科学家、潜水团体），以确保收集孢子叶的适当时间。
  2. 获得符合当地法律法规的海带组织采集必要许可。这可能是培养过程中耗时的一部分，必须纳入项目时间表。
  3. 通过自给式水下呼吸器（SCUBA）从10-15个可育的 M. pyrifera 个体中选择3-5个孢子叶叶片，具有可见的sori，间隔至少为2 m。如果可能的话，选择干净和完整的孢子叶，几乎没有结垢或降解。从现在开始，根据亲本单独储存孢子叶叶片。
    注意：孢子叶生长在成鱼海带固定物上方基部的密集“裙子”中，可以通过它们缺乏充满气体的气囊来识别 1.成熟的鼻腔组织通常比周围组织略微隆起，颜色更深1。
  4. 将孢子叶叶片在深色收集袋中运输，以避免过度暴露在阳光下，用最少的海水来自现场以保持叶片湿润，并储存在大约 12 °C 的冷却器中，直到到达培养空间。确保样品不与冰直接接触。
    注意：孢子叶可以运送到其他地方或从其他地方运送。
    1. 用海水冲洗孢子叶。将从单个 M. pyrifera 个体收集的刀片包裹在浸泡在海水中的湿纸巾中，然后再次浸泡在铝箔中，以避免光线穿透和额外的干燥36.这种储存方法通常被称为“墨西哥卷饼法”。
    2. 将这些包装放入装有冰块的冷却器中，并带有保护屏障，例如回收的气泡膜或纸板。准备冷却器以备隔夜运输。确保有人可以接收货件并将包裹放在冷藏条件下。

4. 孢子形成

  1. 如果可能，在10-15°C之间的温度受控环境中处理孢子叶，并远离任何其他培养物。提前准备和消毒器械和工作站。处理海带组织时戴上防护手套，以减少污染。
  2. 任选地将孢子叶在冷藏条件下储存12-48小时，促进孢子从sorus组织37中释放。要存储，请使用第 3.3 节中描述的“墨西哥卷饼方法”。
  3. 选择成熟的 sorus 组织，并使用无菌剪刀将其切成 25 cm2 段。从 10-15 个海带亲本中选择 1-2 个干净的 sori 部分，以促进遗传多样性。
    注意：如果储存，可以选择在纸巾上找到部分孢子形成的证据，表明存在肥沃的伤口组织。Sorus 组织通常比周围组织略微凸起且颜色更深。
  4. 清洁时，仅用无菌纱布向一个方向轻轻擦洗 sorus 组织的两侧amp用过滤消毒的海水。如果需要，用无菌剃须刀片轻轻刮擦 sorus 组织以完全去除污垢。将sori部分浸入淡水浴中30秒至1分钟，然后用过滤消毒的海水冲洗。
    注意： 在处理来自不同个体的不同 sori 部分时，请刷新淡水浴并对使用的材料进行消毒，以减少交叉污染。
  5. 将每个sori部分浸没在无菌50mL离心管中回火至10-15°C的过滤灭菌海水中。将试管置于4-12°C的黑暗中，最多发孢4小时。如果没有冰箱，请将其存放在光线不足、阴凉的地方。
    注意：或者，sori切片可以在单个无菌容器中孢子。
  6. 使用复合显微镜和血细胞计数器，每30分钟观察3-4个样品的孢子密度，最多4小时。在样品之间更换移液器吸头。如果密度至少为 10,000 个孢子 mL-1 （参见 第 5.1.1 节），请继续下一步。如果sori切片在4小时后不产生孢子，则丢弃样品。孢子可以在释放后数小时内沉降，但可以观察到以圆周运动游泳。
  7. 用无菌镊子从试管中取出每个sori部分。将所得孢子溶液混合到一个灭菌的容器中，并量化最终的组合密度。

5. 接种

  1. 计算接种所需的孢子溶液的最终体积。确保培养容器中的最终浓度约为 500-1,000 个孢子 mL-1 。
    1. 要根据血细胞计数器中心网格的计数计算合并孢子样品的浓度，请将计数除以 10-4 mL（代表在血细胞计数器中查看的溶液体积）。
    2. 要确定要添加到每个容器中的孢子溶液的体积，请确定将底物浸没在培养容器中所需的生长培养基量。
    3. 要找到每个容器中的孢子总数，请将该海水体积乘以所需的浓度。
    4. 要确定要添加的孢子溶液的总体积，请将孢子总量除以孢子溶液中每毫升的孢子浓度。
  2. 将无菌载玻片放入培养容器中以监测海带的发育。包括至少 30 张幻灯片，这些载玻片随机分布在培养容器中，以便进行充分监测（详见 第 7 节）。
  3. 使用含有浸没在生长培养基中的底物的无菌移液管吸头将计算体积的孢子溶液接种到培养容器中。关闭容器并轻轻搅拌以分配孢子。密封容器并将其放入培养系统中。

6.饲养条件

  1. 根据部署地点的温度将温度设置在 10-15 °C 之间。
  2. 1 天后，使用过滤后的气源进行轻度曝气。
  3. 将水生植物的全光谱 LED 灯设置为 12 小时光：12 小时黑暗循环，光强度范围在 0-180 μmol 光子 m-2 s-1 之间：
    1. 从 0-1 天将光强度设置为 5-10 μmol 光子 m-2 s-1 ，并在 20 周结束时增加到 20 - 30 μmol 光子 m-2 s-1 。
    2. 从此时开始，每 3-4 天增加 10-20 μmol 光子 m-2 s-1 的辐照度，直到在 6 周结束时达到 180 μmol 光子 m-2 s-1 的辐照度。
    3. 继续以180μmol光子m-2s-1培养物直到8周结束时，或者当孢子体长度达到约1-2cm时。

7. 监控

  1. 在前两周内，每天/每隔一天监测至少两张随机载玻片以评估发育情况。
    1. 要进行监测，请用灭菌镊子处理载玻片，并将其放入干净的培养皿中，培养皿中含有足够的灭菌海水以淹没载玻片。取出后不要将载玻片放回培养物中，以免交叉污染。
    2. 使用40-400倍放大倍率的复合或倒置显微镜观察早期海带。使用以下时间线跟踪发育（有关发育生活史阶段的示例，请参见图 3）。
      注意：在0-1天时观察到沉降孢子。孢子可以在几个小时内发芽，如胚管的形成所证明的那样。通常在1-2天观察到发芽。早期配子体通常在1-4天观察到。配子发生是细胞经历分裂和分化以形成雄性和雌性配子的过程，通常在前两周内观察到。雌性细胞比雄性细胞大5-7倍。雄性配子体长出细细的丝状分枝，而雌性则呈圆形或卵形。雌性通常在 2-3 周内产卵或卵子。从雄性释放的精子游向雌性并使卵子受精，导致二倍体受精卵的形成。具有正确的接种密度将确保通过接近38,39成功繁殖。受精卵发育成胚胎孢子体。孢子体通常在 2-4 周内观察到。受精卵经历快速细胞分裂，在大约 6-8 周内生长 1-2 厘米的叶片。
  2. 两周后，每周监测至少两张随机载玻片 1-2 次，以确保健康生长和污染，直到孢子体达到 1-2 厘米大小。
    注意：健康生长的特征是金棕色（而不是绿色或透明）颜色。在倒置显微镜的载玻片上可以观察到几个定量指标，包括存活率、发芽率、营养发育、生殖成熟度和繁殖力以及性别比40。
  3. 用显微镜评估细菌、真菌、纤毛酸盐和硅藻的污染。去除分离的污染物。用二氧化锗（GeO2）（见 第8.3节）处理控制硅藻污染的早期迹象。

8. 维护

  1. 根据第 6.3 节调整光照条件。
  2. 每周更换生长培养基，以补充 M. pyrifera 生长所需的营养和矿物质。
    1. 将新鲜的生长培养基冷却至适当的温度。在此过程中确保温度不超过 15 °C。
    2. 将培养基从培养容器中抽出，以避免干扰接种基质。让介质排空，直到容器几乎为空。立即刷新介质以尽量减少干燥。重新填充生长容器时，稍微倾斜它们，使培养基沿着培养容器的侧面流下，以尽量减少对基质的干扰。
    3. 在每周更换培养基期间随机重新排列容器或桶的位置，以考虑光辐照度的差异。
      注意：请参阅 补充文件 1 以获取跟踪大囊藻培养活动和期望的日历。它指示调整光线和曝气的时间，以及每周的介质变化。
  3. 或者，通过二氧化锗（GeO2）处理来控制硅藻污染。向接种基质中每加入 1 L 海水，加入 0.3-0.5 mL 250 mg/mL GeO2，以减少广泛的硅藻污染。
    注意：GeO2 可能会抑制藻类配子的产生。在萌发后的短窗口内，在卵子和精子产生高峰期之前（1-7天）和/或卵子受精和孢子体观察后（>21天）应用GeO2 处理，然后在48小时后更换培养基以去除化学物质。这些时间表可能因培养条件而异，因此用显微镜监测生命阶段的发育是评估 GeO2 应用时间的最佳方法。如果培养容器中硅藻污染持续存在，并且观察到早期海带过度生长，请考虑重新播种基质。

9. 巨型海带营养配子体培养

  1. 全年在营养条件下繁殖配子体培养物，以减少对天然珊瑚礁季节性孢子叶收集的依赖。
    1. 根据源群体将配子体培养物储存在装有生长培养基的烧瓶中，在4-12°C的红光下，在12光：12暗循环中以5-20μmol光子m-2 s-1 的强度储存。
    2. 提供恒定的曝气，每 2-6 个月更换一次介质。
  2. 为了增加无性生长的配子体的生物量，用于“绿色砾石”播种，增加通气以悬浮配子体，将培养基更换的频率增加到每周一次，并每两周切割一次配子体。
    1. 通过摇晃或搅拌将配子体生物质悬浮在培养瓶中，并在必要时用无菌工具刮擦培养瓶的侧面以去除附着的配子体。
    2. 将悬浮的配子体倒入无菌搅拌机或咖啡研磨机中，并将配子体溶液脉冲约5-15次，视生物量浓度而定，直到看不到团块。
  3. 为了诱导“绿色砾石”播种的繁殖，如上所述，将配子体碎片化。然后，接种底物并将全光谱LED光从5-20增加到45-60μmol光子m-2 s-1 （+10μmol光子m-2 s-1 每天用于光驯化），然后每3-4天增加10-20μmol光子m-2 s-1 ，直到达到180μmol光子m-2 s-1的辐照度。

10. 部署

  1. 实验室培养6-8周后，确保幼年孢子体长1-2厘米并准备好部署（图4）。在部署前 24 小时刷新培养箱中的生长培养基。
  2. 获得符合当地法律法规的砾石部署必要许可证。这可能是培养过程中耗时的一部分，必须纳入项目时间表。
  3. 将“绿色砾石”装在托盘中，上面覆盖着浸泡在海水中的毛巾，以保持海带水分。将托盘放入装有冰块的保温冷却器中，确保它们不与冰直接接触。确保 “绿色砾石” 紧密包装，以避免在运输过程中滚动基质和孢子体分离。
    注意：根据空间的可用性，基质也可以在其培养容器或桶中运输，以减少处理。
  4. 在阴凉的冷却器中运输 “绿色砾石”长达 6 小时。部署时间应避免阳光直射。如果从船上部署，请在部署过程中使用遮荫结构以避免阳光直射。
  5. 在新地点和小规模试验时，小心地将 “绿色砾石”从表面撒到下面的珊瑚礁上或通过水肺潜水。

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Representative Results

“绿色砾石”恢复技术仍处于试点阶段，其他物种的外植体存活数据有限28，尚未公布 Macrocystis pyrifera 的数据。使用本协议中概述的现场收集和实验室维护，在假设的 “绿色砾石” 部署之前，我们测试了两个不同供体海带种群的特定地点饲养条件的重要性（图5）。在加利福尼亚州（美国）从较冷的K1（圣克鲁斯36.60167°N，121.88508°W）和较暖的K4（San Diego，32.85036°N，-117.27600°W）种群中收集繁殖海带组织，并在两种温度下饲养：（1）12°C（海藻养殖的标准养殖温度，K1的平均冬季SST）和（2）20 °C（K4的平均夏季SST， 和 K1 的 4 °C 热浪）。所有用于监测海带生命阶段发育的载玻片都标有标准化网格，并使用该网格作为参考捕获高分辨率图像，以便能够使用倒置显微镜和相机观察一段时间内的固定场（N = 每个样品 5 张图像，2.479 mm x 1.859 mm）。

孢子形成后24 d后，从显微镜图像中计数配子体（N = 来自60个样品的300张图像）。为了检验配子体计数的差异，使用软件包 glmmTMB41 中的函数 glmmTMB（） 采用具有泊松分布的广义线性混合效应模型，并使用 R 中软件包 emmeans 42的 emtrends（） 进行成对比较。我们的结果表明，K1 和 K4 种群之间配子体对热变异性的响应不同 （t = 2.7， p = 0.007），其中温度对较暖的 K4 种群没有影响（估计值 = -0.01，标准误差 [SE] = 0.01，置信区间 [CI] = [-0.03， 0.01]），但对较冷的 K1 种群有影响（估计值 = -0.06， SE = 0.02，CI = [-0.10，-0.03]）（图6A），表明热耐受性状可能存在适应性差异。海带配子体通常被描述为抗性阶段 43，这意味着它们产生一种通用的表型，该表型具有耐压力性且对环境变异性相对不敏感。然而，这些结果表明，热变异性在这个早期阶段施加了巨大的压力。

孢子形成后 32 d 后，通过 7.5 cm 载玻片（N = 72 个总样品）在每 2.5 cm 的整个 2.5 cm 上计数长度大于约 1 mm 的可见孢子体。为了检验可见孢子体计数的差异，使用软件包 glmmTMB 中的函数 glmmTMB（） 采用具有泊松分布的广义线性混合效应模型，并使用 R 中软件包 emmeans 的 emtrends（） 进行成对比较。我们的结果表明，孢子体对热变异性的响应在 K1 和 K4 分化种群之间相似 （z = 0.92， p = 0.36），其中温度对较暖的 K4 种群（估计 = -0.66，SE = 0.04，CI = [-0.74， - 0.57]）以及较冷的 K1 种群（估计 = -0.85，SE = 0.13，CI = [-1.10， -0.60]）有影响（图 6B).与在12°C下饲养的样品相比，在20°C下饲养的样品（平均±SE=0.4±0.2）生长的样品很少可见的孢子体（平均±SE=82.4±9.8）。这一结果表明，孢子体生产比配子体阶段对温度更敏感，并且特定地点的培养温度不得超过15°C才能实现方案中概述的孢子体发育。

Figure 1
图1：“ 绿色砾石” 孵化器系统示意图。 （A） 用于营养增大配子体培养物的红光源。（B） 电线和管道的接入端口，通向外部插座。（C） 阻挡红光部分全光谱光的结构。（D） “绿色砾石” 养殖区。（五）全光谱光源。（F） 连接到外部过滤空气源的管路。（G） 止回阀以减少空气污染。（H） 尽量减少污染的单独培养容器。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2：“ 绿色砾石” 水浴系统示意图。 （A） 带浸没式泵的冷水机组（ I）。（B） 20加仑浴缸用于水浴。（C） 排水以再循环水浴。（D） 水浴再循环阀门。（E） 光源。（F） 2.5升“ 绿色砾石” 容器，带透明盖和曝气口。（G） 曝气源。（H） 使用水下泵进行再循环水的管道。（I） 水浴接收器从/到冷却器从/到带潜水泵的浴缸。（J） 亚克力覆盖层，以尽量减少水浴蒸发。（K） 网状阴影以调节光照强度。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3： Macrocystis pyrifera的 发育。 来自实验室生长试验的 Macrocystis pyrifera 的发育生活史阶段。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4：播种了Macrocystis pyrifera的“绿色砾石”。 在实验室中培养播种有大囊藻的绿色砾石，直到孢子体达到1-2厘米，然后部署“绿色砾石”并继续在田间生长。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5：实验时间序列。 来自大 囊藻配 子体和孢子体的实验生长和发育的时间序列示例图像，这些孢子体起源于在加利福尼亚（美国）收集并在两种不同温度下培养的两个种群。K1 = 圣克鲁斯，K4 = 圣地亚哥。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6：代表性结果。 在12和20°C的恒定热条件下培养的K1圣克鲁斯圣地亚哥K4圣克鲁斯种群观察到的大囊虫生命阶段。 误差线，平均值± 1 SE。 星号 （*） 表示统计学上的显著差异 （p < 0.05）。（A） 第 24 天的配子体（N = 来自 60 个样品的 300 张总图像）。（B） 第 32 天可见的孢子体（N = 72 个样品，在标准化的 2.5 cm x 7.5 cm 区域内）。请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件 1.请点击此处下载此文件。

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Discussion

人为气候变化对世界海洋健康的威胁越来越大 44,45,46,47,48，造成重大干扰和生物多样性丧失 49,50,51,52。为了加速恢复退化的生态系统，联合国宣布 2021 年至 2030 年为“联合国生态系统恢复十年”，恰逢“联合国海洋科学促进可持续发展十年”，旨在扭转海洋健康恶化的趋势53.根据这一全球行动呼吁，海带森林联盟发起了海带森林挑战，以在2040年之前恢复100万公顷海带森林并保护300万公顷海带森林54。海洋恢复被低估了55，海带生态系统受到的关注远低于珊瑚礁、红树林和海草草甸等栖息地56。恢复退化的生态系统已被证明对重建海洋生态系统是有效的，但平均每公顷的成本可能在80,000美元至1,600,000美元之间，总成本中位数可能高出两到四倍57。当前和预计的损失需要开发可扩展、可行且具有成本效益的海带恢复方法，作为紧急保护干预措施。

目前的海带恢复工作使用多种方法来解决海带损失的特定地点驱动因素，包括成年海带的移植、游动孢子和/或配子体的直接播种、食草动物控制以及人工鱼礁的安装 11.但是，这些方法需要大量资源，并且可伸缩性有限。成年海带的典型移植需要潜水员在底栖动物上费力地部署人造材料或结构。自下而上的重建沿海岩礁的干预措施，如控制竞争对手和食草动物，也受到劳动力成本的限制，因为它们依赖于人工水下清除或排除这些生物压力源11。 “绿色砾石” 技术克服了这些限制，只需从水面轻松部署，不需要水下安装或技术知识，并且成本相对较低28。这种创新方法提供了一种很有前途的恢复工具，敦促在不同的地点和环境中进行广泛的试验，以释放其全部潜力32.

虽然在挪威的避风峡湾中，使用糖海带 Saccharina latissima26 成功恢复了“绿色砾石”，但这种技术仍处于东太平洋大囊藻的试点阶段。需要更多的试验来解决其范围内 M. pyrifera 外植体的预期存活率。在 M. pyrifera 生长的典型波浪暴露条件下，较小的砾石可能更容易移动和磨损，导致外植体受损。此外，由充满气体的 M. pyrifera 气囊提供的正浮力可能导致“绿色砾石”外植体被有效地带离恢复地点，因此砾石大小和重量是探索该物种的重要因素。在最近的一项试点研究中（2022 年 5 月;Ensenada， Baja California， Mexico），在田间观察到 M. pyrifera 的初步成功，表现为单翅目附着在周围基质上，在田间两个月后幼体的生长长度达到 1.2 m（图 4）。这表明在利用“绿色砾石”在东太平洋对 M. pyrifera 进行开发方面存在着一个明显的机会。该视频展示了 M. pyrifera 的“绿色砾石”技术，是一种宝贵的资源，可以简化和集中恢复培养阶段的现有实践，以支持解决不同田间环境中的成功和局限性的研究。

通过“绿色砾石”技术，可以播种许多较小的单个砾石单元，与更常见的成年植物移植方法相比，可以增加成功的可能性。然而，这种技术的关键可扩展方面是它从地面的简单部署，这可以促进乘船恢复大面积区域。对于不适合部署小砾石的田间环境，该协议可以适用于将 M. pyrifera 移植到各种基质上，包括较大的砾石甚至小巨石、可以绑在天然或部署的水下锚上的绳子，或可以在更暴露的条件下使用海洋环氧树脂用螺栓或粘附到海底的瓷砖。这些部署调整不会改变 M. pyrifera 培养所需的设施，但随后会增加部署成本。

目前，人为干扰和气候变化正在克服自然种群的适应能力。这给将生态系统恢复到历史状态的传统保护工作带来了重大挑战58,59,60,61,62,63。因此，保护框架已经扩大到包括考虑复原力和适应能力的预期管理64.正在对森林生态系统中的树种实施应对气候变化的预期管理65，并建议进一步恢复工作，以提高外植体的进化潜力66,67。尽管这些策略本质上更容易在陆地环境中操纵，但一些研究开始探索它们在海洋环境中的应用62,68,69,70。例如，珊瑚礁受到许多人为压力因素的威胁，导致前所未有的下降71,72。为了应对这些重要基础物种的丧失，人们越来越多地提倡积极恢复和辅助适应技术，以保护剩余的珊瑚礁及其相关功能62,73,74。一种技术涉及在其当前物种分布范围内转移个体，以增加对热应激的耐受性75。关于树冠形成海带的恢复，“绿色砾石”有一个可定制的框架来探索辅助适应技术，例如将有弹性的基因型转移到脆弱地区，非遗传操作，如杂交，或个体适应环境压力62，其结果旨在为恢复计划获得更多的抗性菌株76,77。

利用当地的支持来加强恢复工作对于维持海带生态系统保护的成功至关重要。让当地利益攸关方参与进来可以增加当地对恢复需求的支持6,50，并促进沿海管理，从而增加资金和延长海带生态系统保护的寿命。与所有其他海带恢复方法一样，整合各种生态、社会经济和保护目标的结构化决策框架将有助于实现海带生态系统及其支持的社区的最佳结果11.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由加州海洋格兰特海带恢复研究计划 R/HCE-17 资助给 JBL 和 MESB，美国国家科学基金会研究培训奖 DGE-1735040 授予 PDD、大自然保护协会、施密特海洋技术合作伙伴、可持续海洋联盟、廷克基金会到 AP-L，以及气候科学联盟巴哈工作组到 RBL 和 JL。我们感谢加州大学欧文分校的 Steven Allison、Cascade Sorte、Samantha Cunningham、Sam Weber 和 Caitlin Yee;加州大学圣克鲁兹分校的 Mark Carr、Peter Raimondi、Sarah Eminhizer、Anne Kapuscinski;大自然保护协会的沃尔特·海迪（Walter Heady）和诺拉·埃迪（Norah Eddy）;威斯康星大学密尔沃基分校的菲利普·阿尔贝托（Filipe Alberto）和加布里埃尔·蒙特西诺斯（Gabriel Montecinos）;下加利福尼亚自治大学的何塞·安东尼奥·泽图切-冈萨雷斯、亚历杭德拉·费雷拉-阿列塔和莉莉安娜·费雷拉-阿列塔;来自 MexCal 的 Luis Malpica-Cruz、Alicia Abadía-Cardoso 和 Daniel Díaz-Guzmán;MexCalitos 潜水员亚历杭德拉·雷耶斯、莫妮卡·佩拉尔塔、特蕾莎·塔维拉、朱莉娅·纳瓦雷特、艾诺亚·维拉塔、杰雷米·鲍尔和阿方索·费雷拉;南希·卡鲁索（Nancy Caruso）提供技术建议。我们感谢下加利福尼亚自治大学海洋研究所（Instituto de Investigaciones Oceanológicas， Universidad Autónoma de Baja California）提供用于开发水浴系统的设施。我们感谢艾拉·斯皮策（Ira Spitzer）的水下和无人机视频内容。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filters Milipore SCGPS05RE Natural seawater sterilization
1 L glass bottles Amazon B07J6JP4D1 Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air) Amazon B01M1VWUWL Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow Home Depot 203812125 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
10 µm filters Amazon B00D04BG56 Natural seawater sterilization
20 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
3x5mm tubing Amazon B0852HXPN6 Option 1 Small scale - Incubator
4x4'' Sterile Gauze Amazon B07NDK8XM3 Sporulation
4x6mm tubing Amazon B08BCRV1FY Option 1 Small scale - Incubator
5 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing Amazon B01M04HGPJ Sporulation
8x10mm tubing Amazon B01MSM3LLZ Option 1 Small scale - Incubator
Air filters Thermo Fisher MTGR85010 Option 1 Small scale - Incubator
Alcohol lamp Amazon B07XWD9WWC Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99% Sigma 215406-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel Amazon B07XRCKFBJ Option 1 Small scale - Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99% Sigma B4639-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g Thermo Fisher 5090113707 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA Thermo Fisher P001225G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves Amazon B08HRZR4MM Option 1 Small scale - Incubator
Clear tubing 3/8'' - 10 ft Amazon B07MTYMW13 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING - California - Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA Thermo Fisher 5090114752 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera OMAX M83EZ-C50S Monitoring
Culture flask Thermo Fisher 07-250-080 Option 1 Small scale - Incubator
Culture light Amazon B07RRRPJ63 Option 1 Small scale - Incubator
Culture stoppers Amazon B07DX6J7QD Option 1 Small scale - Incubator
Drainage connector Amazon B00GUZ6CV0 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2 Thermo Fisher 50213299 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL Thermo Fisher S81273 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL Thermo Fisher S81275 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets - Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye Thermo Fisher S81271 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder Amazon B07LCKBKCT Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA Thermo Fisher S63460 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera Leica FLEXACAM C1 Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN Thermo Fisher AAJ6083314 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink Amazon B094TLH19L Option 2 - Medium scale - Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR Thermo Fisher AC190000100 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA Thermo Fisher S88442 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides Amazon B00L1S93PS Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture Sigma G6501-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid Container store #10014828 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Growth light Amazon B086R14MFW Option 1 Small scale - Incubator
Hemocytometer Amazon B07TJQDKLJ Sporulation
Hinged plastic jars SKS Bottle & Packaging 40280125.01S Option 1 Small scale - Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size - 100G Storage Conditions - +15 C TO +30 C Catalog Number - 26310.01 CAS 87-89-8 Thermo Fisher 50247745 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean - 50 G Amazon B000255NKA Option 1 Small scale - Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1 Leica DMi1 Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97% Sigma 236489-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger Licor LI-250A Monitoring
Light/temperature HOBO data logger Amazon B075X2SWKN Monitoring
Lights 150W Amazon B0799DQM9V Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications Sigma M8179-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds Home Depot 206823930 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11, Thermo Fisher AAA1268330 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA Thermo Fisher ICN10256925 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement Amazon B001D9WRWG Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Plastic water valve Amazon B0006JLVE4 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Plastic water valve Amazon B07G5FY7X1 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Precision scale 1mg Amazon B08DTH95FN Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air Amazon B0BG2BT9RX Option 1 Small scale - Incubator
PVC tubing 1x24'' Home Depot 202300505 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Quantum Light meter Apogee Instruments MQ-510 Monitoring
Refrigerated Incubator Thermo Fisher 15-103-1566 Option 1 Small scale - Incubator
Rubber Grommets Amazon B07YZD22ZP Option 1 Small scale - Incubator
Salinity refractometer ATC B018LRO1SU Monitoring
Shade mesh 6x50 ft Home depot 316308418 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA Thermo Fisher BP360500 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening Amazon B08R3515SF Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Spray isporopyl alcohol Amazon ‎ B08LW5P844 Sporulation
Stainless steel sissors Amazon B07BT4YLHT Sporulation
Stainless steel tray Amazon B08CV33YXG Sporulation
Stainless steel twizzers Amazon B01JTZTAJS Sporulation
Stir Bars Amazon B07C4TNKXB Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH Amazon B07RZKRM13 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor Waltz US-SQS/L Monitoring
Temperature gun Infrared Thermometer 749 B07VTPJXH9 Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture Sigma T1270-25G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA Thermo Fisher AC157850250 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24x48 inch Home Depot 202038048 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft Amazon B07ZC1PSF3 Option 2 - Medium scale - Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization Amazon B018OI7PYS Natural seawater sterilization
Vacum pump Amazon B087XBTPVW Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98% Sigma V6629-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA Thermo Fisher S89446 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA Thermo Fisher S89445 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM Amazon B07BHHP71C Option 2 - Medium scale - Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing Amazon B08XTJKFCH Option 1 Small scale - Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture Sigma Z0251-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment

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环境科学， 第208期，
对形成冠层的巨型海带进行野外采集和实验室维护，以促进恢复
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Dawkins, P. D., Paz-Lacavex, A.,… More

Dawkins, P. D., Paz-Lacavex, A., Fiorenza, E. A., Rush, M. A., Beas-Luna, R., Lorda, J., Malpica-Cruz, L., Sandoval-Gil, J. M., McHugh, T. A., Han, M. K., Bracken, M. E. S., Lamb, J. B. Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration. J. Vis. Exp. (208), e66092, doi:10.3791/66092 (2024).

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