使用光学相干弹性成像量化环境生物膜的弹性特性
Summary
本文重点介绍了光学相干弹性成像（OCE）技术在快速、无损地表征生物膜弹性特性方面的功效。我们阐明了用于精确测量的关键OCE实施程序，并提出了两种颗粒生物膜的杨氏模量值。
Abstract
生物膜是复杂的生物材料，由包裹在自产细胞外聚合物物质 （EPS） 中的组织良好的微生物细胞网络组成。本文详细介绍了为生物膜弹性表征量身定制的光学相干弹性成像 （OCE） 测量的实施情况。OCE是一种无损光学技术，能够以高空间和时间分辨率对部分透明软材料的微观结构、形态和粘弹性进行局部映射。我们提供了一个全面的指南，详细介绍了正确实施该技术的基本程序，以及从收集的测量值中估计颗粒生物膜的体积杨氏模量的方法。这些包括系统设置、数据采集和后处理。在讨论中，我们深入研究了OCE中使用的传感器的基本物理特性，并探讨了OCE测量的空间和时间尺度的基本限制。我们总结了推进OCE技术以促进环境生物膜弹性测量的潜在未来方向。
Introduction
在废水处理和水资源回收中，越来越多地使用附属生长反应器中的有益生物膜，使微生物能够将不需要的污染物（如有机物、氮和磷酸盐）转化为易于从水中去除的稳定形式1。在这些系统中，生物膜的涌现功能，即生化转化，与居住在其中的微生物的多样性以及这些微生物接受的营养密切相关2。因此，持续的生物膜生长可能会对维持一致的反应器功能构成挑战，因为新的生物膜生长可能会改变生物膜的整体代谢过程、传质特性和群落组成。尽可能稳定生物膜环境可以防止这种变化3.这包括确保营养物质的一致流动，并保持生物膜的结构稳定，厚度稳定4。监测生物膜的硬度和物理结构将使研究人员能够深入了解生物膜的整体健康状况和功能。
生物膜表现出粘弹性 5,6,7。这种粘弹性导致响应外部机械力的瞬时和缓慢、随时间变化的变形的结合。生物膜的一个独特之处在于，当它们发生重大变形时，它们会像粘稠液体一样做出反应。相反，当受到轻微变形时，它们的响应与固体5 相当。此外，在这个小变形区域内，存在一个变形范围，在该范围内，生物膜表现出线性力-位移关系5,6,7。该线性范围内的变形是评估生物膜力学特性的最佳选择，因为这些特性会产生可重复的测量结果。有几种技术可以量化此范围内的弹性响应。光学相干弹性成像 （OCE） 是一种新兴技术，适用于分析该线性范围内的生物膜（菌株量级为 10-4-10-5）8,9。
迄今为止，OCE最成熟的应用是在生物医学领域，该技术已被应用于表征只需要表面光学访问的生物组织。例如，Li 等人使用 OCE 表征皮肤组织的弹性特性10。其他作者描述了猪和人角膜组织的各向异性弹性特性以及它们如何受到眼内压的影响11,12,13,14,15,16。用于研究生物膜的OCE方法的一些优点是它是无损的，并提供中尺度空间分辨率，它不需要任何样品制备，并且该方法本身是快速的;它提供了物理结构和弹性特性（例如孔隙率、表面粗糙度和形态）的共同注册测量值8,9,17,18。
OCE方法使用相敏光学相干断层扫描（OCT）测量样品中传播的弹性波的局部位移。OCT是一种低相干光学干涉仪，可将样品位移的局部变化转换为用光谱仪记录的强度变化。OCT技术还被用于生物膜研究，用于表征中尺度结构、三维孔隙率分布和生物膜变形17,19,20,21。此外，Picioreanu等人使用OCT横截面变形图像的流固耦合逆模型估计了生物膜的力学性能22。
另一方面，OCE测量与逆弹动力波建模相结合，可以产生样品中弹性波的波速，从而能够表征样品的弹性和粘弹性。我们小组将OCE技术用于定量测量生物膜弹性和粘弹性8,9,18，并在琼脂糖凝胶板样品中的剪切流变测量中验证了该技术18。OCE方法提供了对生物膜特性的精确和可靠的估计，因为测量的弹性波速与样品的弹性特性相关。此外，由于材料中的粘性效应，弹性波振幅的空间衰减可以与粘弹性能直接相关。我们已经报告了在旋转环形反应器 （RAR） 中试样上生长的混合培养细菌生物膜和使用弹性动力学波模型18 的具有复杂几何形状的颗粒生物膜的粘弹性特性的 OCE 测量。
OCE 技术也是传统流变测量法18的有力替代方案，传统流变测量法用于粘弹性表征。流变测量方法最适合具有平面几何形状的样品。因此，具有任意形状和表面形态的颗粒状生物膜无法在流变仪上准确表征 8,23。此外，与OCE不同，流变测量方法可能难以适应实时测量，例如，在流通池中的生物膜生长过程中24,25。
在本文中，我们表明，表面波的频率无关波速的OCE测量可用于表征生物膜弹性特性，而无需复杂的模型。这一发展将使更广泛的生物膜社区更容易使用OCE方法来研究生物膜的力学特性。
图 1 显示了本研究中使用的 OCT 系统的示意图。该系统包含多种仪器，包括商用频谱域相敏OCT系统、延迟发生器、函数发生器和压电换能器。OCT 系统采用中心波长为 930 nm 的宽带光源，以干涉测量原理运行。收集到的光强度与样品中复杂的结构细节相关，在后处理单元中进行分析，然后转换为样品的横截面图像 – 通常称为OCT图像。OCT 成像深度取决于样品中光学散射的严重程度，该散射源于折射率的局部变化，并且在生物组织和生物膜中仅限于 1-3 mm。由于样品中的光学相位和干涉强度由运动调制，因此OCT可用于检测局部样品位移。我们利用OCE方法中OCT的位移灵敏度来跟踪样品中弹性波的稳态位移场。具体来说，函数发生器输出正弦电压来驱动压电传感器。反过来，换能器会随着振荡时间历史而拉伸和收缩。换能器的振荡位移通过换能器顶端的 3D 打印楔形尖端在样品表面产生正弦力，从而在样品中产生谐波弹性波。楔形尖端与样品轻微接触，使得在致动器从样品表面缩回后样品保持完整。为了记录样品中的局部位移，在样品中的每个像素处采集由固定时间延迟分隔的相邻深度扫描。每个像素点的连续扫描之间的光学相位差与同一点的局部垂直位移成正比。在OCT系统中，传感器的位移和扫描光学器件之间的同步是通过源自函数发生器并在延迟发生器中延迟的触发脉冲实现的。该同步步骤有助于获取样品中局部光学相位分布的一致横截面图像。这些图像与样品中的局部垂直谐波位移成正比，称为OCE图像。在不同的换能器驱动频率下采集OCE图像，以获得弹性波长和波速随频率的变化。使用弹性动力学模型分析测量的波速，以确定样品的弹性特性。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT系统中可达到的成像深度由光源的光穿透程度决定，这取决于光源的波长。此外，波长决定了轴向分辨率。较长的波长可以更深入地穿透样品，但与较短的波长相比，轴向分辨率会降低。另一方面，横向分辨率取决于系统的数值孔径和波长，波长越短，分辨率越高。增加数值孔径通过限制景深29 来引入权衡。空间分辨率被限制为以足够的信噪比可以检测到的最短弹性波长。目?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Aqua-Aerobic Systems，Inc.（美国伊利诺伊州罗克福德）提供本文研究的颗粒状生物膜。作者还感谢美国国家科学基金会通过奖项#210047和#193729的支持。
Materials
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
Riferimenti
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. d. e. C., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J., et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
- Graff, K. F. . Wave motion in elastic solids. , (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography – OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
