Анализ для выявления защиты сосудистой сети сетчатки от смерти от диабета у мышей

Summary

Был разработан защитный тест для мониторинга устойчивости сосудов сетчатки к смерти от инсультов, связанных с диабетом/диабетической ретинопатией, таких как окислительный стресс и цитокины.

Abstract

Диабетическая ретинопатия (ДР) является сложным и прогрессирующим заболеванием глаз, характеризующимся двумя различными фазами патогенеза. Первая фаза включает в себя потерю защиты от вызванного диабетом повреждения сетчатки, в то время как вторая фаза сосредоточена на накоплении этого повреждения. Традиционные анализы в первую очередь сосредоточены на оценке капиллярной дегенерации, которая указывает на тяжесть повреждения, в основном обращаясь ко второй фазе ДР. Тем не менее, они лишь косвенно дают представление о том, были ли нарушены защитные механизмы сосудистой сети сетчатки. Чтобы устранить это ограничение, был разработан новый подход для непосредственной оценки защитных механизмов сетчатки, в частности, ее устойчивости к вызванным диабетом повреждениям, таким как окислительный стресс и цитокины. Этот защитный анализ, хотя изначально был разработан для диабетической ретинопатии, имеет потенциал для более широкого применения как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Таким образом, понимание патогенеза диабетической ретинопатии включает в себя распознавание двух фаз потери защиты и накопления повреждений, при этом этот инновационный защитный анализ предлагает ценный инструмент для исследований и потенциально распространяется на другие медицинские состояния.

Introduction

Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из микрососудистых осложнений сахарного диабета (СД) и ведущей причиной слепоты у лиц трудоспособного возраста в развитых странах¹. Основными факторами риска развития диабетической ретинопатии являются продолжительность и степень гипергликемии ^2,3,4. В то время как СД вызывает дисфункцию как сосудистого, так и нервного компонентов сетчатки⁵, диагностика ДР основывается на морфологических особенностях сосудистой сети сетчатки⁶.

Окислительный стресс, индуцированный гипергликемией, является одним из факторов патогенеза ДР⁷. Повышенный окислительный стресс вызывает обширные повреждения, которые ставят под угрозу функциональность митохондрий и тем самым еще больше повышают уровень активных форм кислорода. Эти явления сопровождаются утечкой сосудов сетчатки, повышением уровня воспалительных цитокинов и гибелью как нервных, так и сосудистых типов клеток в сетчатке. Потеря сосудистых клеток и, следовательно, функциональности обширной капиллярной сети сетчатки приводит к гипоксии, которая является мощным стимулом для^{различных реакций}. Такие ответы включают повышенную экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который управляет как проницаемостью, так и ангиогенезом, кардинальные особенности прогрессирующих, угрожающих зрению стадий ДР – диабетического макулярного отека и пролиферативной диабетической ретинопатии⁶.

Некоторые особенности ДР позволяют предположить, что организм (как больные, так и экспериментальные животные) обладает врожденной способностью сопротивляться этому показанию. Пациенты переживают несколько десятилетий СД, прежде чем у них развивается угрожающая зрению ДР 8,9,10,11,12,13. В то время как у грызунов не развиваются прогрессирующие, угрожающие зрению стадии ДР¹⁴, начальная/легкая форма ДР, которая проявляется, развивается только через несколько недель или месяцев СД^15,16. Кроме того, как у пациентов, так и у экспериментальных животных ДР прогрессирует, и дисфункция/повреждение сетчатки нарастает по мере увеличения продолжительности СД. Наконец, у некоторых пациентов с СД ДР никогда не развивается. В некоторых случаях это связано с тем, что такие люди не страдают диабетом достаточно долго, чтобы развилась ДР. В других случаях это происходит потому, что они проявляют чрезвычайную устойчивость к DR; как и в случае с участниками исследования Medalist, у которых не развивается ДР после 50 и более лет СД¹⁷. Несмотря на столь убедительные доводы в пользу существования защиты от DR и ее огромную трансляционную значимость, механизм, лежащий в основе защиты, не подвергался интенсивному исследованию.

Описанный в настоящем документе защитный тест был разработан для облегчения изучения причин задержки развития ДР с момента начала СД у мышей с сахарным диабетом. Основные этапы этого анализа, применяемого к мышам с СД и без СД, включают (1) нанесение субмаксимального смертельного удара по глазу (ex vivo или in vivo), (2) изоляцию сосудистой сети сетчатки, (3) окрашивание сосудистой сети TUNEL и DAPI, (4) фотографирование полученных изображений и количественную оценку процента дважды положительных видов TUNEL/DAPI.

Protocol

Все исследования на животных были одобрены Управлением по уходу за животными и институциональной биобезопасности Иллинойского университета в Чикаго. Семинедельные самцы мышей C57/BL6/J содержались в групповых клетках в среде, свободной от патогенов, по циклу 12 часов между светом и темнотой, и им был предоставлен бесплатный доступ к еде и воде. Мышей усыпляли асфиксиейСО2 , а глаза были энуклеированы и обработанынемедленно 18. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Основные инструменты, необходимые для исследования, представлены на рисунке 1. 1. Нанесение смертельного оскорбления Выполняйте окислительный стресс с TBH (ex vivo).Усыпляют мышей в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами и делают энуклеацию их глаз18 (рисунок 2A). Поместите глазные яблоки непосредственно в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего DMEM + 1% BSA, с 5 мМ трет-бутилгидропероксида (TBH) или без него (см. таблицу материалов); инкубируют в течение 1 ч при 37 °С. Положительный контрольный образец обрабатывают ДНКазой (50 U/100 мкл) в течение 10 мин для фрагментации ДНК.ПРИМЕЧАНИЕ: Доза TBH (агента, вызывающего окислительный стресс) была выбрана таким образом, чтобы индуцировать легко обнаруживаемый и субмаксимальный уровень гибели клеток в изолированных сосудах сетчатки18. Зафиксируйте глаза в 10% буферном формалине на ночь (минимум 16 часов). Используйте цитокиновый коктейль, чтобы вызвать воспаление (in vivo).Обезболивайте мышей внутрибрюшинной инъекцией 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина. Используйте индивидуальную иглу 33 G (см. таблицу материалов) для введения 1 мкл/глаз цитокинового коктейля в стекловидное тело; место инъекции находится в 2-3 мм от лимба (рис. 2Б).ПРИМЕЧАНИЕ: Цитокиновый коктейль содержит соотношение 1:1:1 1 мкг/мл TNF-α, 1 мкг/мл IL-1β и 1500 U/мкл ИФН-γ18 (см. таблицу материалов). Через 24 часа после инъекции усыпите мышей (в соответствии с утвержденными протоколами), сделайте энуклеацию их глаз и зафиксируйте 10% буферизованным формалином на ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен после фиксации максимум на 1 неделю, а затем возобновлен позже. 2. Изоляция сетчатки Разрежьте глазное яблоко.Используйте прямые щипцы, чтобы осторожно захватить зрительный нерв (Рисунок 2C). Другой рукой придерживая микронож, сделайте надрез на 2-3 мм кзади от лимба. Переключитесь с микроножа на микроножницы, чтобы резать параллельно лимбу, вращая глазное яблоко вместе со зрительным нервом, пока глазное яблоко не будет разрезано на две половины. Выбросьте переднюю половину глаза, включая хрусталик (рис. 2C). Удалите склеру.Прямыми щипцами аккуратно приподнимите склеру на 1-3 мм от сетчатки. С помощью микроножниц сделайте два радиальных надреза в склере на участке пути к зрительному нерву. Избегайте разрезания нижележащей сетчатки. Используйте изогнутые щипцы, чтобы захватить склеральный лоскут и оторвать его от сетчатки. Слой РПЭ сойдет вместе со склерой. Промойте сетчатку.С помощью микрошпателя перенесите изолированную сетчатку в лунку в чашке на 24 лунки, наполненную водой двойной дистилляции. Аккуратно встряхните блюдо на средней-умеренной скорости при комнатной температуре. Меняйте воду каждые 30 мин до 1 ч, не менее 4-5 раз, затем оставьте на ночь. 3. Изоляция сосудов сетчатки Разложение: Замените двойную дистиллированную воду 800 мкл раствора YL трипсина (3% трипсин в 0,1 М буфере Tris (pH 7,8)). Инкубируют при 37 °C при слабом встряхивании или без него в течение 4 ч 15 мин19 (рис. 2D).ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте быстрой тряски, так как это может повредить сосудистую сеть. Перенос: Окуните широкий конец стеклянной пипетки в раствор YL трипсина, чтобы перенести сетчатку в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую безворсовую воду двойной дистилляции. Удалите внешний ядерный слой (фоторецепторы) (рис. 2E).Переверните полусферу сетчатки вниз. Используйте прямую щетку с одним волоском, чтобы аккуратно прижать сетчатку ко дну посуды. Используйте петлевую щетку, чтобы аккуратно смахнуть фоторецепторы сетчатки. Мазки кистью наносятся в направлении от зрительного нерва к периферии сетчатки. Фоторецепторы могут отслаиваться большими листами, потому что они не прикреплены к остальной части сетчатки кровеносными сосудами. С помощью пипетки на 200 мкл собирайте и выбрасывайте листы нервной ткани. Удалить стекловидное тело.Переверните полусферу сетчатки так, чтобы она была обращена вверх. Используйте пару изогнутых щипцов (А), чтобы максимально захватить стекловидное тело под препарирующим микроскопом.ПРИМЕЧАНИЕ: Стекловидное тело выглядит как лист прозрачной ткани, прикрепленный к зрительному нерву или сетчатке. Используйте другие изогнутые щипцы (В), чтобы захватить конец стекловидного тела в том месте, где оно соединяется со зрительным нервом. Удалите стекловидное тело, оттянув щипцы А от щипцов Б. Откажитесь от стекловидного тела. Осмотрите остатки стекловидного тела и повторите этот шаг, чтобы удалить все стекловидное тело, так как остатки будут препятствовать следующим этапам. Удалите оставшуюся нервную и глиальную ткань (рис. 2F).Переверните полусферу сетчатки так, чтобы она снова была обращена вниз. Еще раз с помощью прямой щетки аккуратно прижмите сетчатку ко дну посуды (не используйте кончик волоса). С помощью петлевой щетки осторожно проведите щеткой по сосудистому руслу от головки зрительного нерва по направлению к периферии, чтобы удалить оставшуюся нервную ткань20. Медленно вращайте сетчатку прямой щеткой и используйте петлевую щетку, чтобы удалить все маленькие кусочки нервной ткани на сосудистой сети сетчатки, пока сосудистая сеть не будет хорошо очищена (рис. 2G, H). 4. Установка изолированной сосудистой сети сетчатки на предметное стекло микроскопа Поместите предметное стекло микроскопа.Поместите чистую монтажную кассету (см. Таблицу материалов) под препарирующий микроскоп. Наполните кассету дважды дистиллированной водой. Используйте черный фон под препарирующим микроскопом, чтобы создать контраст и увидеть освещенную прозрачную сосудистую сеть. С помощью щипцов поместите чистое предметное стекло микроскопа с этикеткой в нижнюю часть монтажной кассеты. Перенос сосудов сетчатки.Окуните широкий конец стеклянной пипетки в раствор YL-трипсина. Перенесите очищенную сосудистую сеть сетчатки и осторожно переместите ее в воду двойной дистилляции внутри монтажной кассеты и над предметным стеклом микроскопа. Монтируем сосудистую сеть сетчатки.ПРИМЕЧАНИЕ: Пока сосудистая сеть плавает над предметным стеклем микроскопа, изолированная сосудистая сеть приобретает свою нормальную форму чаши.Используйте петлевую щетку, чтобы перевернуть полусферу сетчатки вверх и осторожно надавить сосудистую сеть вниз на предметное стекло, а затем с помощью волос прикрепите открытую сосудистую сеть к центру предметного стекла. Сосудистая сеть должна прилипать к предметному стеколу при его соприкосновении. Плоское крепление сосудистой сети путем расчесывания чашеобразного сосуда сетчатки от зрительного нерва к периферии. Повторяйте чистку зубов во всех направлениях до тех пор, пока сосудистая сеть полностью не прилипнет к предметному стеколу. Сушат на воздухе сосудистую сеть сетчатки.После того, как вся сосудистая сеть сетчатки прикрепится к предметному стеклу, выньте предметное стекло из воды, либо осторожно приподняв один край, либо медленно слив воду в углу кассеты, чтобы свести к минимуму ток, а затем вытащите его (рис. 2I).ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистая сеть станет хорошо видна после того, как она высохнет на воздухе (Рисунок 2J). Отметьте окружность сосудистой сети сетчатки на обратной стороне предметного стекла маркером. Приступайте к окрашиванию образца без паузы. 5. Обнаружение смерти с помощью окрашивания TUNEL ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее об этой процедуре см. Zheng et al.21. Репрезентативные изображения апоптотических тел, индуцированных ишемией +/- бычьим стрессом в изолированных сосудах сетчатки, изображены на рисунке 3. Регидратируйте изолированную сосудистую сеть с помощью PBS. Промойте его 3 раза в PBS, а затем инкубируйте с 1% Triton X-100 в PBS в течение 2 минут на льду, чтобы проникнуть в изолированную сосудистую сеть. Дважды промойте предметные стекла PBS, чтобы удалить остатки Triton X-100. Высушите область вокруг образца. Добавьте 50 мкл реакционной смеси TUNEL (см. таблицу материалов) на образец. Выдержать предметное стекло во влажной атмосфере в течение 60 мин при температуре 37 °C в темноте. Промойте предметное стекло 3 раза PBS, чтобы удалить реакционную смесь TUNEL. Высушите область вокруг образца. Добавьте каплю монтажного носителя DAPI для окрашивания ядер DAPI и закрепите образец с помощью покровного стекла. Хранить при температуре 4 °C в темноте.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на срок до 1 недели перед съемкой изображений. Сфотографируйте полученную сосудистую сеть с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа (см. таблицу материалов). Захватите от шести до восьми случайно выбранных полей на дальней периферии, окружающей зрительный нерв (рис. 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные изображения цитокин-индуцированных апоптотических тел в изолированных сосудах сетчатки проиллюстрированы на рисунке 5. Проанализируйте результаты.Для образцов, обработанных ex vivo, TBH, выполните следующие действия.Подсчитайте количество апоптотических тел (двойные положительные виды TUNEL/DAPI) в каждом поле, используя рисунок J (см. таблицу материалов). Подсчитайте среднее значение апоптотических тел во всех полях одного образца. Вычислить кратное изменение числа апоптотических тел между случайно выбранной парой образцов без СД и СД. Определите, есть ли статистически значимая разница, с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента18.ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивайте контрольный и экспериментальный образцы (не DM и DM) в одном и том же случае, потому что степень окрашивания TUNEL может варьироваться, даже если это делается одним и тем же способом. Поскольку опытный пользователь может очистить и установить до 10 сетчаток в день, запланируйте обработку равного количества контрольных и экспериментальных сетчаток перед запуском этого протокола. Для образцов, обработанных коктейлем цитокинов in vivo, выполните следующие действия.Вручную подсчитайте количество апоптотических телец (дважды положительных видов TUNEL/DAPI) во всей сосудистой системе сетчатки. Вычислить кратное изменение числа апоптотических тел между случайно выбранной парой образцов без СД и СД. Определите, есть ли статистически значимая разница, с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента.

Representative Results

Успешная изоляция сосудистой сети сетчатки приводит к плоскому креплению всей сети сосудов сетчатки мыши с сохранением архитектурной целостности (рис. 2J). При периодическом окрашивании кислотно-шиффовым гематоксилином (ПАШ) можно выделить два типа сосудистых клеток: эндотелиальные клетки (ЭК) и перициты (ПК) (рис. 6). Ядра эндотелиальных клеток удлиненные, слегка окрашены и полностью находятся в стенках сосудов. Ядра перицитов округлые, густо окрашены, выступают из стенок капилляров. В образцах, окрашенных PASH, также обнаружены бесклеточные капилляры, в которых отсутствуют ядра. Подход к индуцированию смерти руководствовался следующим обоснованием. Было высказано предположение, что защита была ограниченной, т.е. могла быть подавлена очень сильным смертельным оскорблением. Следовательно, повреждения (как ишемия/окислительный стресс, так и цитокины18) были оптимизированы таким образом, чтобы они вызывали легко обнаруживаемое увеличение, но все же субмаксимальную степень смерти (рис. 3 и рис. 5). Важно подчеркнуть, что присутствие TUNEL-положительных ядер зависело от специфического типа повреждения, используемого для запуска гибели клетки. Повреждение ишемией/окислительным стрессом привело к трамвайному паттерну апоптоза клеток, как показано на рисунке 3, в то время как цитокиновое повреждение привело к отчетливому и четко определенному паттерну, как показано на рисунке 5. Оба паттерна можно наблюдать в сосудах сетчатки у пациентов с ДР22, что позволяет предположить, что оба типа агентов индуцируют гибель клеток у людей. Более того, наблюдаемые морфологические различия позволяют оценить, была ли патология вызвана окислительным стрессом или цитокинами. Рисунок 1: Инструменты для изоляции сосудистой сети сетчатки мыши. Слева направо: монтажная кассета, две одноволосые щетки, перевернутая пипетка, микрошпатель, два изогнутых щипца, пружинные ножницы, микронож и щипцы с прямыми кончиками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Схема, показывающая основные этапы нанесения смертельного удара и последующей изоляции сосудистой сети сетчатки от мышиного глаза. (А) Индукция ишемии/окислительного повреждения, ex vivo. После энуклеации глазное яблоко подвергается ишемии при наличии ТБК. (Б) Введение цитокинов in vivo (интравитреальная инъекция). (C) Разрезание глазного яблока на две половины. (D) Ферментативное пищеварение сетчатки: удаление склеры и промывание сетчатки в воде двойной дистилляции на ночь. Инкубируют в растворе YL трипсина при 37 °С в течение 4 ч 15 мин в лунке 24-луночного планшета. (E) Удаление фоторецепторов. (F) Удаление оставшейся нервной и глиальной ткани. (G) Очищенная чашеобразная сосудистая сеть, обращенная вверх. (H) Изолированная сосудистая сетка в 35-миллиметровой чашке на черном фоне на предметном столике препарирующего микроскопа. (I) Сосудистая сеть сетчатки с плоским расположением на предметном стекле. (J) Высушенная на воздухе сосудистая сеть сетчатки на предметном стекле. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Обнаружение апоптотических тел в сосудах сетчатки мыши, обработанных ex vivo с ишемией +/- TBH. Репрезентативные изображения апоптотических тел, индуцированных ишемией +/- ox-стрессом в изолированных сосудах сетчатки. Заголовок каждого столбца указывает на окрашивание. (А-С) Сосуды сетчатки, выделенные из глазных яблок, подвергшихся только ишемии в течение 1 ч. (Д-Ж) То же, что и (А-С), за исключением того, что в течение 1 ч инсульт представлял собой комбинацию ишемии и окислительного стресса (5 мМ ТЧ). Красные стрелки указывают на репрезентативные двойные положительные виды TUNEL/DAPI. (Г-И) Положительный контроль, обработанный ДНКазой. Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Иллюстрация выбора поля для количественной оценки результатов. Сканирование сосудистой сети сетчатки размером 5 x 5 с объединением сигналов TUNEL и DAPI. Выделение шести-восьми полей на дальней периферии, окружающей зрительный нерв, показано красными квадратами. Увеличение, 200х. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Обнаружение апоптотических тел в сосудах сетчатки мыши в ответ на интравитреальное введение цитокинов (введение in vivo). Репрезентативные изображения цитокин-индуцированных апоптотических тел в изолированных сосудах сетчатки. Заголовок каждого столбца указывает на окрашивание. (А-С) Изображения сосудов сетчатки, выделенных у мышей, интравитреально введенных PBS. (Д-Ж) То же, что и (А-С), за исключением того, что вместе с PBS вводили коктейль цитокинов. Красные стрелки указывают на репрезентативные TUNEL-положительные виды. Масштабные линейки = 100 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Li et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Репрезентативное изображение сосудов сетчатки, окрашенных PASH. Сосуды сетчатки мыши, перенесшей 20 недель СД, индуцированного STZ, выделяли, как описано на рисунке 2, окрашивали PASH и визуализировали при освещении видимым светом. Ядра перицитов в капиллярах, как правило, более круглые и густо окрашенные (синие стрелки), в то время как удлиненные и менее плотно окрашенные ядра являются диагностическими для эндотелиальных клеток (красные стрелки). Желтая стрелка указывает на бесклеточный капилляр. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В этом исследовании был установлен анализ для выявления резистентности/уязвимости сосудистой сети сетчатки к смерти, вызванной инсультами, связанными с СД/ДР, такими как ишемия/окислительный стресс и цитокины. В данной рукописи приводится подробное описание этого анализа, который является модификацией нескольких опубликованных протоколов 19,20,21.

Протокол включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, необходимо скрупулезно рассечь сетчатку, обеспечив сохранность сосудистой сетки и предотвратив существенные разрывы. Этого можно достичь, сделав разрез на 2-3 мм позади лимба, так как сетчатка плотно прилегает к ora serrata, и ее разделение является сложной задачей. Во-вторых, покройте трипсином все инструменты, которые соприкасаются с сосудами (например, одноволосые щетки, пипетки и щипцы), окунув эти инструменты в раствор YL-трипсина на протяжении всей процедуры. Это предотвращает прилипание сосудистой сети к инструментам, которые используются в этом протоколе. В-третьих, поскольку микроциркуляторное русло почти незаметно при нормальном освещении, требуется повышенная бдительность во время аспирации мусора и его переноса на предметное стекло микроскопа, чтобы предотвратить случайную потерю.

Соответствующая степень ферментативного переваривания различных слоев сетчатки имеет решающее значение; Недостаточное пищеварение препятствует отделению нейрональной ткани от сосудистой сети, в то время как чрезмерное пищеварение растворяет сосудистое сплетение. Сообщалось о различном времени пищеварения в диапазоне от 1 ч¹⁹ до ^{ночи 23} ч. По наблюдениям, время сбраживания 4 ч 15 мин дает наиболее благоприятные результаты по сравнению с продолжительностью 2 ч, 3 ч и 4 ч. Продление пищеварения после этой точки вряд ли ускорит процесс, а вместо этого может поставить под угрозу целостность сосудистой системы.

В тех случаях, когда переваренная сетчатка прилипает к одноволосой щетке, окуните волосы в раствор YL трипсина несколько раз. Это уменьшает липкие участки кисти. Если расческа все-таки прилипла к сосудистой ткани, то осмотрите ее на наличие остаточных фрагментов стекловидного тела, и удалите их щипцами.

Оптимальным моментом для полного удаления стекловидного тела является устранение фоторецепторов, но до удаления оставшейся нервной и глиальной ткани. Сетчатка сохраняет ригидность до тех пор, пока фоторецепторы не будут удалены. Извлечение стекловидного тела на этой стадии потенциально может привести к разрыву сетчатки/сосудистой сети. Нежные слои остаточной нервной и глиальной ткани играют ключевую роль в сохранении изогнутой формы сосудистой структуры. Они предотвращают разрыв сетчатки в ее центре, когда стекловидное тело отделено от зрительного нерва.

Если изолированная сосудистая сеть вообще не прилипает к предметному стеклу микроскопа, то это указывает на то, что участок предметного стекла, где ожидается адгезия, загрязнен. Попробуйте переместить сосуды по поверхности слайда, чтобы найти липкое место, переключиться на другой слайд или тщательно очистить слайд и повторить попытку. Если сосуды прилипают к горке до того, как они развернутся в форме чаши, поднимите сосудистую сеть из горки, чтобы позволить ей снова свободно плавать в воде. Проделайте этот шаг с помощью щипцов, которые были многократно окунуты в раствор трипсина YL.

Сообщалось о нескольких альтернативных методах изоляции сосудистой сети, которые не подходят для описанного здесь защитного анализа. Например, осмотический лизис был использован для выделения сосудистой сети из нефиксированных образцов сетчатки, что облегчало биохимические исследования ткани^24,25. Тем не менее, эта процедура может не сохранить анатомию сосудистой сети, а также подход, использованный в этой статье. Аналогичным образом, в то время как метод тканевой печати для выделения больших сегментов микроциркуляторного русла позволяет проанализировать электротоническую архитектуру сосудистой сети²⁶, все сосудистое русло, как правило, не восстанавливается.

Этот анализ был разработан в связи с тем, что существующие подходы к мониторингу капиллярной дегенерации не решают проблему защиты. Капиллярная дегенерация, возникающая после длительного СД, указывает на то, развилась ли ДР. В дополнение к диагностике ДР, этот результат полезен для оценки того, предотвращает ли препарат/терапия ДР. Тем не менее, существующие анализы капиллярной дегенерации не говорят о базовом механизме действия агента. Такой агент может предотвратить патологические события, которые приводят к ДР, такие как повышенный окислительный стресс или цитокины. Кроме того, агент может усиливать защиту, повышая устойчивость к окислительному стрессу и цитокинам и/или способствуя восстановлению повреждений. Этот новый защитный тест может быть использован для определения того, связан ли положительный эффект данной терапии с усилением эндогенной системы, которая защищает от смерти, связанной с СД.

Недостатком этого защитного теста является то, что он не различает два типа клеток в сосудах сетчатки: эндотелиальные клетки (ЭК) и перициты (ПК). Несмотря на то, что внешний вид их ядер на участках, окрашенных PASH, зависит от типа клетки (рис. 6), не каждое ядро проявляет диагностические признаки. Примерно 30% ядер не могут быть однозначно определены как ЕС или ПК, по крайней мере, частично, поскольку двумерные изображения, полученные из образцов, окрашенных PASH, не полностью разрешают трехмерную структуру сосудистого сплетения. Это препятствие может быть преодолено с помощью дополнительного анализа, такого как иммунофлуоресцентное окрашивание маркерами, специфичными для конкретного типа клеток. Такие изображения, которые различают два типа клеток, могут быть окрашены совместно с TUNEL для определения резистентности/уязвимости каждого из типов сосудистых клеток.

Этот сосудисто-фокусированный анализ не дает никакой информации о нервной сетчатке. Для получения такой информации могут быть разработаны дополнительные анализы. Например, вместо того, чтобы изолировать сосудистую сеть сетчатки, можно создать одноклеточную суспензию всей сетчатки, а затем проанализировать (путем флуоресцентной сортировки клеток) на резистентность/уязвимость. Включение специфичных для типа клеток маркеров (как нервных, так и сосудистых) наряду с индикаторами клеточной гибели позволило бы получить более полную картину типов клеток сетчатки, обладающих способностью к защите от СД/ЛУ-опосредованной смерти.

В заключение следует отметить, что описанный в данной статье защитный анализ обеспечивает мощный подход к изучению механизма, ответственного за задержку между началом СД и проявлением ДР у мышей.

Materials

10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4	Fixation
24-well plates	Falcon	353047
33 G needle	Hamilton	customized
Ammonium hydroxide	Sigma	221228-1L-PCA
C57/BL6/J mice	The Jackson Laboratory	Jax #000664
Cytokine cocktail			consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate.
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools (FST)	11231-30	Straight tips
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools (FST)	11253-25	Micro-blunted tips
Easy-Grip Tissue Culture Dishes	Falcon	353001	35 x 10 mm
Glass transfer pipet	Fischer Scientific	1367820A	snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb.
Harris modified hematoxylin	Sigma	HHS32
Image J	NIH, Bethesda		https://imagej.nih.gov/ij/
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein	Milipore	11684795910	TUNEL reaction mixture
Micro cover glasses	VWR	48366-227	22 mm x 22 mm
Microknife	Sharpoint	72-1551
Micro-spatula	Fine Science Tools	10091-12
Mounting cassette			Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide
Periodic acid	Sigma	3951
Periodic acid solution			35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate  in H2O
Permount mounting medium	Fischer Scientific	SP15- 100
Prism 9	GraphPad
Prolog Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935
Recombinant human IFN- γ	Peprotec	300-02
Recombinant human IL-1 β	Peprotec	200-01B
Recombinant human TNF-α	Peprotec	300-01A
Schiff reagent base	Sigma	3952016
Shaker Incubator (belly button shaker)	IBI Scientific	BBUAAUV1S
Sodium acetate	Sigma	71196
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
Superfrost Plus treated microscope slides	Fischer Scientific	12-550-15	use slides from unopened box
Tert-butyl hydroperoxide (TBH)	Sigma	75-91-2
TRIZMA base	Fischer Scientific	11-101-5522	make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl)
Trypsin 1:250	Amresco	0458-50G
Two “brushes”			made from single black hair  taped to the end of plastic transfer pipet.  One brush with a free end. The other brush with a loop
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-00
Xylene	Sigma	65351-M
YL trypsin solution			3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8)
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope	Zeiss Microscopy