Summary
Es wird ein detailliertes Protokoll für die Reinigung und Wiederverwendung von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen zur Durchführung einer extrazellulären Vesikelisolierung bereitgestellt, die für Proteomik-Experimente geeignet ist.
Abstract
Einweg-Laborkunststoffe verschärfen die Verschmutzungskrise und tragen zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Bei der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EV) werden Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen (UC) verwendet, um den damit verbundenen hohen Zentrifugalkräften standzuhalten. Die EV-Proteomik ist ein fortschrittliches Gebiet, und es fehlen validierte Wiederverwendungsprotokolle für diese Röhrchen. Die Wiederverwendung von Verbrauchsmaterialien für Proteinisolierungsprotokolle mit geringer Ausbeute und nachgeschaltete Proteomik erfordert die Kompatibilität der Reagenzien mit Massenspektroskopie-Akquisitionen, wie z. B. das Fehlen einer Kontamination durch synthetische Polymere aus Zentrifugenröhrchen und eine ausreichende Entfernung von Restproteinen.
Dieses Protokoll beschreibt und validiert eine Methode zur Reinigung von Polycarbonat-UC-Röhrchen für die Wiederverwendung in EV-Proteomik-Experimenten. Der Reinigungsprozess umfasst das sofortige Eintauchen der UC-Schläuche in H2O, um ein Austrocknen der Proteine zu verhindern, das Waschen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Reinigungsmittel, das Spülen in heißem Leitungswasser, demineralisiertem Wasser und 70 % Ethanol. Um das Protokoll zur Wiederverwendung von UC-Röhrchen für die nachgeschaltete EV-Proteomik zu validieren, wurden verwendete Röhrchen nach einem Experiment gewonnen, bei dem EVs aus kardiovaskulärem Gewebe mittels differentieller UC- und Dichtegradiententrennung isoliert wurden. Die Röhrchen wurden gereinigt und der experimentelle Prozess wurde ohne EV-Proben wiederholt, wobei leere, nie verwendete UC-Röhrchen mit gereinigten UC-Röhrchen verglichen wurden. Die aus den Isolationsverfahren gewonnenen Pseudo-EV-Pellets wurden lysiert und für die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines kommerziellen Proteinprobenvorbereitungskits mit Modifikationen für Proteinproben mit geringer Abundanz vorbereitet.
Nach der Reinigung wurde die Anzahl der identifizierten Proteine im Pseudo-Pellet im Vergleich zur vorherigen EV-Isolationsprobe aus demselben Röhrchen um 98 % reduziert. Beim Vergleich eines gereinigten Röhrchens mit einem leeren Röhrchen enthielten beide Proben eine sehr geringe Anzahl von Proteinen (≤20) mit einer Ähnlichkeit von 86 %. Das Fehlen von Polymerpeaks in den Chromatogrammen der gereinigten Röhren wurde bestätigt. Letztendlich wird die Validierung eines Reinigungsprotokolls für UC-Röhren, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von den EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die Versuchskosten senken.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid-Doppelschicht-abgegrenzte Partikel, die von Zellen freigesetzt werden, die biologisch aktive Fracht, wie z. B. Proteine, transportieren und an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Zell-Zell-Kommunikation und der Bildung biologischer Mineralisation1. Diese Partikel kommen in allen Körperflüssigkeiten und Geweben vor, und ihre biologischen Aktivitäten und Verwendungen sind ein sich schnell entwickelndes Gebiet der wissenschaftlichen Forschung. Die Isolierung und Validierung dieser Nanopartikel stellt aufgrund ihrer geringen Größe und Bioähnlichkeit mit anderen Partikeln wie Liposomen und Proteinaggregaten verschiedene Herausforderungen dar. Die neuesten Richtlinien der International Society of Extracellular Vesicles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), sind der anerkannte Standard für die wissenschaftliche Forschung im Bereich EV2.
Für die EV-Isolierung müssen je nach vorgelagerter Quelle und nachgeschalteten Anwendungen verschiedene Methoden, oft im Tandem, verwendet werden. Im Jahr 2015 war die gebräuchlichste primäre Isolationsmethode für EVs die differentielle Ultrazentrifugation (UC)2. Im Prinzip trennt die anfängliche Zentrifugation mit niedrigerer Geschwindigkeit größere oder dichtere unerwünschte Bestandteile wie Zellen und Zelltrümmer, so dass EVs im Überstand verbleiben. Anschließend verwendet UC eine sehr hohe Zentrifugalkraft, um EVs auszupelletieren und somit von anderen Partikeln zu trennen und zu reinigen, die kleiner oder weniger dicht sind, aber auch dichte Nicht-EV-Partikel enthalten können. Die meisten Protokolle verwenden häufig in dem einen oder anderen Schritt UC, um EVs aus einer Flüssigkeit zu isolieren3. Darüber hinaus wird UC in anderen Methoden der EV-Isolierung verwendet, wie z. B. der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC), bei der Medien wie OptiprepTM Iodixanol und Zentrifugalkraft verwendet werden, um EVs entsprechend ihrer Auftriebsdichtezu trennen 4. Es gibt auch andere Methoden der EV-Isolierung3.
In Anbetracht des sich schnell entwickelnden Verständnisses der biologischen Prozesse, die von EVs diktiert werden, und ihres Potenzials als Biomarker und Informationen zur Pathophysiologie haben forschungsbasierte Analysen wie die Proteomik an Bedeutung gewonnen 5,6,7,8. EVs sind klein und haben je nach Quelle eine geringe Proteinausbeute (<1 μg) im Vergleich zu Ganzgewebe- oder Zelllysat. Die Isolierung von EVs für die Proteomik-Analyse erfordert besondere Überlegungen, wie z. B. die Entfernung von Nicht-EV-Proteinverunreinigungen aus der vorgelagerten Flüssigkeit oder dem Gewebe, die Berücksichtigung des EV-Proteinabbaus während des Isolierungsprozesses und die Verwendung von Methoden zur Herstellung von Proteinlösungen, die chemisch mit Peptidpräparations- und Massenspektrometrieanalysen kompatibel sind.
Verbrauchsmaterialien für Forschungslabore sind oft aus Kunststoff und Einweg. Diese Einwegmaterialien tragen zur globalen Plastikverschmutzungskrise und zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Spezialisierte UC-Rohre aus Polycarbonat und Polystyrol sind so konzipiert, dass sie den hohen Zentrifugalkräften standhalten, die zum Pelletieren von Elektrofahrzeugen in Laboranwendungen erforderlich sind. Während es möglich ist, UC-Röhrchen für die Wiederverwendung zu sterilisieren und zu desinfizieren, erfordert die proteomische Analyse, insbesondere bei niedrigen Proteinausbeuten wie z. B. EVs, besondere Aufmerksamkeit. Nicht nur die ausreichende Entfernung von Proteinresten aus der vorherigen Verwendung ist von größter Bedeutung, sondern auch die chemische Verträglichkeit mit Massenspektroskopie und kunststoffbedingter Polymerkontamination muss berücksichtigt werden.
Hier stellen wir ein Reinigungsprotokoll von Polycarbonattuben mit massenspektrometrischen Detergenzien vor und führen Experimente durch, um die erfolgreiche Entfernung von Proteinresten unterhalb der Nachweisgrenzen und das Fehlen von nachweisbaren Polymerverunreinigungen zu validieren. Um das Reinigungsprotokoll für proteomische EV-Anwendungen sowohl mit UC- als auch mit DGUC-Zwecken zu validieren, erhielten wir Röhrchen aus Isolationen von EVs aus humanem Gefäßgewebe mit einem kombinierten UC- und DGUC-Protokoll. Die Röhrchen wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gereinigt, und der experimentelle Prozess wurde ohne Proben wiederholt, bei denen eine leere, nie verwendete UC-Röhre mit einer gereinigten UC-Röhre verglichen wurde. Letztendlich wird die Validierung eines UC-Rohrreinigungsprotokolls, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die mit solchen Experimenten verbundenen Kosten senken.
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Protocol
1. Reinigung der Rohre
HINWEIS: Bei dem EV-Isolationsverfahren werden sowohl verschlossene als auch unverschlossene Polycarbonat-UC-Schläuche verwendet (siehe unten). Das gleiche Verfahren wurde sowohl für verschlossene als auch für unverschlossene Röhrchen angewendet. Bei verschlossenen Tuben wurden die Deckelteile einzeln gereinigt und nach der Trocknung und Vorlagerung wieder zusammengebaut.
- Tauchen Sie die UC-Röhrchen nach der ersten Verwendung der Polycarbonat-Röhrchen und der Entnahme der Probe sofort in Leitungswasser, um ein Austrocknen der Probe an der Seite des Röhrchens zu verhindern.
- Röhrchen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in Leitungswasser geben und 10 min lang eintauchen.
- Delambieren Sie nacheinander den größten Teil, aber nicht die gesamte SDS-Lösung aus dem Rohr und wischen Sie mit einem Wattestäbchen den Bereich des Rohrs, in dem sich das EV-Pellet befand, gründlich ab.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Gegenstände mit Borsten. Für dieses Protokoll wurden normale Wattestäbchen verwendet; Für die Reinigung der Röhrchen können jedoch spezielle, fusselarme Wattestäbchen verwendet werden. - Mindestens 3x mit heißem Leitungswasser (~50 °C) nachspülen. Achten Sie darauf, die Tube vollständig zu füllen und zu dekantieren.
- 1x mit demineralisiertem Wasser mit einer Sprühflasche oder einer Enghals-Waschflasche spülen.
- 1x mit 70%igem Ethanol in einer Sprühflasche spülen.
- Lassen Sie die Tube kopfüber trocknen.
HINWEIS: Röhrchengestelle für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung eignen sich gut zum Trocknen der UC-Röhrchen. - Legen Sie die vollständig getrockneten Röhrchen in ein sauberes Glas; Sie sind bereit für die Wiederverwendung.
HINWEIS: Derzeit ist das Protokoll für die Wiederverwendung von bis zu 2x validiert.
2. EV-Anreicherung
HINWEIS: Das folgende EV-Isolations- und Proteomik-Protokoll wurde sowohl für die ursprüngliche Gewebe-EV-Isolierung als auch für die "Scheinproben" verwendet, die zur Gewinnung der leeren (nie verwendeten) und gereinigten Röhrchenproben verwendet wurden. Bei den ursprünglichen Proben handelte es sich um resuspendierte, in Gewebe eingeklemmte EVs aus Karotis-Plaques von Patienten, die sich einer Karotis-Endarterektomie unterzogen hatten. Die chirurgischen Proben wurden vom University Health Network (Toronto, Kanada) entnommen und von der institutionellen Ethikkommission genehmigt. Alle Patienten gaben ihre Einverständniserklärung zur Probenentnahme und Datenanalyse in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki. Bei den Scheinproben handelte es sich um Pseudopellets, die durch die Behandlung von leeren und gereinigten Röhrchen mit den gleichen Lösungen und Verarbeitungsschritten wie die EV-Isolationsproben gewonnen wurden.
- Tauen Sie EV-Proben oder Scheinproben in PBS auf Eis auf.
- Stellen Sie einen NTE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) und einen Sterilfilter her.
- Die Proben bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C schleudern.
- Den Überstand in ein oben offenes 1-ml-Polycarbonat-Röhrchen umfüllen.
- Der Überstand wird bei 100.000× g 1 h bei 4 °C zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 150 μl sterilfiltriertem NTE-Puffer mit Proteaseinhibitor.
- In ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und NTE-Puffer hinzufügen, um ein Gesamtprobenvolumen von 1,5 ml zu erreichen.
- Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
3. Vorbereitung von Dichtegradienten und Trennung von Dichtegradienten
HINWEIS: Dieses EV-Isolationsprotokoll wurde bereits von Blaser et al. beschrieben.9 In Kürze:
- Bereiten Sie fünf Lösungen von Iodixanol Density Gradient Medium (10 %, 15 %, 20 %, 25 % und 30 %) mit NTE-Puffer als Verdünnungsmittel vor.
- Schichten Sie die fünf Dichtelösungen nacheinander in verschlossene Ultrazentrifugenröhrchen, wobei 30 % unten und 10 % oben liegen.
- Befestigen Sie die Kappen auf den Röhrchen und bringen Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur vorsichtig in eine stabile horizontale Position.
- Bewegen Sie nach 1 h die Röhre(n) 30 Minuten lang vorsichtig in eine vertikale Position auf dem Eis, um das Gefälle abzukühlen.
- Geben Sie 1,5 mL der Probe oder Scheinprobe (NTE-Puffer) auf die Oberseite der vorbereiteten Dichtegradientenröhrchen.
- Ultrazentrifugenröhrchen mit 250.000 × g für 40 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie die oberen Fraktionen des Dichtegradienten (2,4 ml) zu den unverschlossenen Ultrazentrifugenröhrchen. Auf 9 mL mit steril gefiltertem NTE-Puffer auffüllen.
- Pelletieren Sie die Elektrofahrzeuge durch Ultrazentrifugieren bei 100.000 × g für 1 h bei 4 °C.
HINWEIS: Kreisen Sie die Position des sichtbaren EV-Pellets oder die erwartete Position mit einer Markierung ein. Auf diese Weise können Sie den Bereich des Pellets direkt mit dem Tupfer reinigen. - Saugen Sie den Überstand an, während Sie den Schlauch 3 Minuten lang auf den Kopf stellen. Entfernen Sie die restlichen Tröpfchen mit einem Wattestäbchen, bevor Sie das Röhrchen mit der rechten Seite nach oben drehen.
- Resuspendieren Sie das EV-Pellet in 12 μl Lysepuffer im referenzierten Kit.
4. Peptidpräparat für die Proteomik
HINWEIS: Die Proteomik-Probenvorbereitung wurde gemäß dem Kit-Protokoll mit internen Modifikationen für Proteinproben mit geringer Abundanz durchgeführt. Das geänderte Protokoll lautet wie folgt:
- Die Proben werden durch 10 Minuten Erhitzen in Lysepuffer bei 95 °C lysiert, denaturiert, reduziert und alkylatiert.
- Die Proben werden 2 h lang bei 37 °C mit der Lys-C/Trypsin-Aufschlusslösung unter Verwendung von 10 μl Lyselösung aus der Probe und 10 μl der Aufschlusslösung aufgeschlossen.
- Reinigen Sie Peptide durch eine Kartusche, indem Sie hydrophile und hydrophobe Verunreinigungen auswaschen und gereinigte Peptide mit Kit-Lösungen eluieren.
- Trocknen Sie die gereinigten Peptide im Schnellvakuum bei 45 °C für 45 min oder bis sie trocken sind.
HINWEIS: Vermeiden Sie ein Übertrocknen der Peptide. - Lagern Sie die Proben bis zum Zeitpunkt der Massenspektrometrie-Sequenzierung bei -80 °C.
- Geben Sie 17 μl LC-Load-Lösung zu den getrockneten Peptiden.
- Lassen Sie die Proben 1 h auf Eis.
- Die Proben kurz vortexen und dann 5 min in einem Ultraschall-Wasserbad beschallen.
- Zentrifugieren Sie die LC-geladenen Proben 1 Minute lang bei 16.000 × g , saugen Sie 15 μl von oben an und trennen Sie sie in ein neues Röhrchen.
5. Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie-Sequenzierung
- Injizieren Sie 2 μl LC-geladene Peptidlösung in ein Massenspektrometer.
- Fraktionieren Sie die Peptide mit einem Dual-Säulen-Setup.
- Die Säule auf eine konstante Temperatur von 45 °C erhitzen.
- Führen Sie den analytischen Gradienten bei 300 nL/min von 5 % auf 21 % Lösungsmittel B (Acetonitril/0,1 % Ameisensäure) für 60 Minuten durch, gefolgt von 10 Minuten mit 21 % bis 30 % Lösungsmittel B und weiteren 10 Minuten mit einer 95 %-5 %-Stichsäge.
- Stellen Sie die MS1-Auflösung auf 120 K ein (maximale Injektionszeit, 25 ms), setzen Sie die Top-Vorläufer-Ionen (innerhalb einer Zykluszeit von 3,0 s) einer HCD-Isolationsbreite von 1,2 m/z aus, dynamischer Ausschluss aktiviert (60 s), und stellen Sie die MS2-Auflösung auf 60 K ein (maximale Injektionszeit, automatisch; normalisierte Kollisionsenergie, 24 %, 26 % und 28 %).
- Stellen Sie den Erfassungsbereich von MS1 und MS2 auf 400 m/z-1.200 m/z bzw. 120 m/z-1.200 m/z ein.
6. Identifizierung von Peptiden/Proteinen
- Durchsuchen Sie die erfassten Peptidspektren mit einer proteomischen Suchsoftware unter Verwendung eines kommerziellen Suchalgorithmus gegen eine humane uniProt-Datenbank.
- Stellen Sie das Verdauungsenzym auf Trypsin ein und lassen Sie bis zu zwei fehlende Spaltungen zu.
- Legen Sie die Toleranz des Vorgängers auf 10 ppm und das Fenster für die Fragmenttoleranz auf 0,02 Da fest.
- Methioninoxidation und N-terminale Acetylierung als variable Modifikationen und Cysteincarbamidomethylierung als feste Modifikation einstellen.
- Filtern Sie die Peptide basierend auf einem Schwellenwert (False Discovery Rate) von 1,0 %, der vom Percolator-Algorithmus berechnet wird.
- Betrachten Sie nur Peptide, die einer bestimmten Proteingruppe zugeordnet sind und in keiner anderen Proteingruppe nachgewiesen wurden, als einzigartig und verwenden Sie sie für weitere Analysen.
- Nehmen Sie nur mindestens zwei einzigartige Peptide für jedes Protein in die Analysen auf.
- Maximieren Sie IDs mit der Erkennung von Vorläuferionen.
- Führen Sie eine chromatographische Ausrichtung mit einer maximalen Retentionszeitverschiebung von 10 Minuten, einer Massentoleranz von 10 ppm und einem Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 5 durch.
- Normalisieren Sie die Peptidhäufigkeit nach der Gesamtpeptidmenge.
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Representative Results
Um das Reinigungsprotokoll (Abbildung 1) zu validieren, wurden zwei Experimente durchgeführt. Zunächst wurde das Proteom der "Scheinprobe" aus dem gereinigten Röhrchen mit dem Proteom der Gewebe-EV-Probe aus der ersten Verwendung des Röhrchens verglichen, um die Verschleppung der identifizierten Proteine zu bestimmen. Repräsentative Chromatogramme zeigen eine Verringerung der Peakheterogenität nach Reinigung der Röhrchen (Abbildung 2). In der ursprünglichen EV-Isolierung wurden 806 Proteine mit zwei oder mehr einzigartigen Peptiden identifiziert. Nach der Reinigung konnte die Anzahl der identifizierten Proteine um 98% auf 19 Proteine reduziert werden. Zwölf Proteine wurden in beiden geteilt, und sieben Proteine waren einzigartig für das gereinigte Röhrchen (Abbildung 3A). Anhand einer Literaturrecherche wurde eine Liste charakteristischer EV-Proteine zusammengestellt, wie sie bereits veröffentlicht wurde9. Von den aufgelisteten 24 charakteristischen EV-Proteinen, die in der Originalprobe identifiziert wurden, wurde nach der Reinigung nur eines identifiziert (Tabelle 1). Von den gemeinsamen Proteinen war MFGE8, ein charakteristisches EV-Protein, das am stärksten differentiell angereicherte Protein in der EV-Probe. Im Vergleich dazu waren zwei kontaminante Proteine, KRT14 und KRT5, in der nachgereinigten Probe am stärksten unterschiedlich angereichert (Abbildung 3B).
Um die Entfernung des Proteins aus den Röhrchen nach dem Waschen zu bestätigen, wurde ein SDS-PAGE-Gel mit einer BSA-Standardkurve von 1 μg (typisches unteres Ende der EV-Isolationsausbeute) bis 16,5 ng durchgeführt und dann die "Schein"-EV-Pellets der Röhrchen in dreifacher Ausfertigung abgeblendet und gereinigt. Alle Standardkurvenbanden waren sichtbar, die Proben jedoch nicht, was auf eine Reinigungsentfernung von mindestens 98 % des Proteins und keinen beobachtbaren Unterschied zwischen dem Blind- und dem gereinigten Röhrchen hinweist (Abbildung 4A). Um die in den gereinigten Röhrchen identifizierten spezifischen Proteine im Vergleich zu einem leeren, nie benutzten Röhrchen weiter zu bewerten, wurde ein direkter Vergleich durchgeführt (N = 4, Gruppe). Die Chromatogramme der blinden und der gereinigten Röhren waren sehr ähnlich (Abbildung 4B). In den leeren, nie benutzten Röhrchen wurden 19 Proteine identifiziert. In ähnlicher Weise wurden im gereinigten Röhrchen 20 Proteine identifiziert, von denen 18 in den beiden Gruppen verteilt waren (Abbildung 4C). Ordnet man alle Proteine nach ihrer Häufigkeit, so sind die kontaminierten Keratinproteine KRT1, KRT9 und KRT10 in beiden Gruppen am häufigsten vorgekommen (Abbildung 4D). In dem gereinigten Röhrchen wurde ein charakteristisches EV-Protein identifiziert: Lactadherin (MFGE8). Es gab eine hohe Ähnlichkeit zwischen den sauberen und den leeren Röhrchen in der Anzahl der ausgelösten MS2-Sequenzierungsereignisse bei jedem 5-Minuten-Retentionszeit-Bin (Abbildung 4E), der Anzahl der sequenzierten Peptide und der Konfidenz, in der sie sequenziert wurden (Abbildung 4F), sowie einer großen Überlappung zwischen den Peptiden (Abbildung 4G). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass keine erkennbaren Auswirkungen der Wiederverwendung von Sonden mit diesem Reinigungsprotokoll auf das Proteom erkennbar sind.
Das Monomer von Polycarbonat liegt bei 254,3 MH1+, was unter dem MS1-Erfassungsbereich liegt. Die Chromatogramme wurden auf das Vorhandensein von einfach geladenen Dimeren und Trimeren untersucht, die nicht nachgewiesen wurden (Daten nicht gezeigt, N = 4).
Abbildung 1: Schema des Reinigungsprotokolls für Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen. Abkürzungen: UC = Ultrazentrifuge; SDS = Natriumdodecylsulfat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentativer Vergleich des Proteoms der vorherigen EV-Probe mit der "Scheinprobe" aus dem gereinigten Röhrchen (N = 2). Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TIC-MS = Gesamtionenchromatographie-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich der in der EV-Probe identifizierten Proteine mit der "Mock"-Probe, die aus den gereinigten Röhrchen gewonnen wurde. (A) Venn-Diagramm-Proteinidentifikationen im Proteom der vorherigen EV-Probe mit der "Mock-Probe" aus dem gereinigten Röhrchen (N = 2). (B) Differentielle Anreicherung gemeinsamer Proteine, geordnet nach logarithmus 2-facher Veränderung. Abkürzung: EV = extrazelluläres Vesikel, FC = Faltenveränderung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich von leeren, nie benutzten Röhrchen mit gereinigten Röhrchen. (A) Ein SDS-PAGE-Gel wurde mit einer BSA-Standardkurve von 1 μg bis 16,5 ng durchgeführt, und dann wurden leere und gereinigte Röhrchen-"Schein"-EV-Pellets in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. (B) Repräsentative Chromatogramme für leere und gereinigte Röhrchen. (C) Venn-Diagramm der gemeinsamen oder eindeutigen Proteine aus leeren und gereinigten Röhrchen (N = 4). (D) Alle Proteine, die in jeder Gruppe identifiziert wurden, geordnet nach ihrer Abundanz für (i) leere und (ii) gereinigte Röhrchen. Die Medianwerte werden dargestellt. (E) Histogramm aller ausgelösten MS2-Ereignisse nach Retentionszeit, summiert nach Gruppe (N = 4). (F) Anzahl der Peptid-IDs in jeder Gruppe nach Konfidenz, wobei sich Peptide mit hohem Vertrauen von Intragruppen-Matching-Peptiden unterscheiden, wobei die Identifizierungskonfidenz niedriger ist, aber durch den Abgleich mit anderen Spektren verstärkt wird, Mittelwert/SD. (G) Anzahl der eindeutigen und von den Gruppen gemeinsam genutzten Peptide. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TIC-MS = Gesamtionenchromatographie-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Charakteristische EV-Proteine, die in der Prä- und Post-UC-Röhrchenreinigungsanalyse gefunden wurden. Abkürzungen: UC = Ultrazentrifuge; EV = extrazelluläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier beschreiben und validieren wir ein Protokoll für die Reinigung von Polycarbonat-UC-Rohren für EV-Anreicherungs- und Proteomik-Anwendungen. Wir zeigten die erfolgreiche Entfernung von Restprotein aus der vorherigen UC-Röhrchenprobe im Vergleich zu einer gereinigten Pseudo-Pellet-Analyse unterhalb der Nachweisgrenze dieses Massenspektrometrie-Erfassungsprotokolls und zeigten die proteomische Ähnlichkeit von leeren, nie benutzten UC-Röhrchen im Vergleich zu gereinigten UC-Röhrchen-Pseudopellets.
Um die versehentliche Adsorption von Protein an der inneren Polycarbonatwand zu verhindern, wurden die UC-Röhrchen zunächst in H2O10 getaucht. Das Waschen der UC-Rohre aus Polycarbonat von Hand wird von den Herstellern empfohlen11. Andere Reinigungsmittel, wie z. B. Lipsol, sollten mit Vorsicht verwendet werden. Es handelt sich um ein proprietäres Laborwaschmittel, das aus einer Mischung aus Waschmittel, Tensiden und Chelatbildnern mit einem nicht neutralen pH-Wert besteht. Daher wurde für diesen Schritt ein massenspektrometrisches Waschmittel, 0,1 % SDS, verwendet und die Wäsche nicht länger als 10 min durchgeführt11. Unserer Erfahrung nach kann der Einsatz von Borstenreinigungswerkzeugen bei Nichtvorsicht zu Rohrkratzern führen. Um mögliche Kratzer zu vermeiden, die ein Reservoir für Proteinreste darstellen könnten, wurde ein Wattestäbchen verwendet, um das Innere des Polycarbonatrohrs abzuwischen, wobei der Schwerpunkt auf dem Bereich der EV-Pelletbildung lag. Wiederholtes Autoklavieren kann die Lebensdauer des Polycarbonatrohrs verkürzen11; Stattdessen wurden drei kurze Heißwasserspülungen durchgeführt. Es ist auch zu beachten, dass die Hersteller zwar nicht-thermische Sterilisationsmethoden vorschlagen, eine bestimmte Temperatur, die vermieden werden soll, jedoch nicht beschrieben wird. Rohre sollten vor der Wiederverwendung gemäß den Empfehlungen des Herstellers immer auf Anzeichen von Verformungen oder Rissen untersucht werden. Es wird nicht empfohlen, brennbare Substanzen in der Nähe von in Betrieb befindlichen Zentrifugen zu verwenden. Daher trocknen wir die Tuben über Nacht nach dem letzten Spülschritt mit 70 % Ethanol.
Bei der manuellen Beurteilung von Chromatogrammen wurde keine signifikante Polymerkontamination beobachtet. Es ist nicht zu erwarten, dass SDS Polycarbonat abbaut, und kurze Exposition gegenüber heißem Wasser (<60 °C) hat keine Auswirkungen, während eine längere Expositiondies tut 12. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass Polycarbonat-Spezies in einer Retentionszeit vor der Entnahme eluieren, die auf unserem Acetonitril-Gradienten13 basiert. Wir können zwar nicht sicher sein, dass keine Polymere vorhanden sind, aber mit unseren Erfassungsmethoden sind wir zuversichtlich, dass das Proteom nicht wesentlich beeinflusst wird.
Bei der Wiederverwendung von Laborgeräten für markierungsfreie Proteomik-Experimente müssen Restproteinkontaminanten aus der vorherigen Verwendung speziell berücksichtigt werden. Darüber hinaus wird die EV-Proteomik oft mit Proben mit sehr geringer Ausbeute durchgeführt, die manchmal Proteinmengen im Bereich von <100 ng ergeben. Diese Mengen an Ausgangsprotein eignen sich für die Massenspektrometrie, erhöhen aber den Einfluss selbst kleiner Mengen an Restprotein auf das Gesamtproteom erheblich. Angesichts der Empfindlichkeit der fortschreitenden Massenspektrometrie-Sequenzierung werden Kontaminanten aus der Handhabung und Herstellung durch den Menschen identifiziert. In diesem Protokoll zeigen wir eine erhebliche Reduzierung der Anzahl der identifizierten Proteine um 98% nach der Reinigung. Die restlichen Proteine wurden fast ausschließlich zwischen den leeren, nie benutzten Röhrchen und den sauberen Röhrchen aufgeteilt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei den identifizierten Proteinen um Kontaminanten aus dem Proteomik-Präparat selbst oder um Restelemente aus der Röhrchenherstellung handelte und nicht um Verschleppungen aus der vorherigen Verwendung. Die bei weitem häufigsten drei identifizierten Proteine nach Größenordnungen in den leeren und gereinigten Röhrchen waren humanes Keratin Typ I (KRT1, KRT10, KRT9), das in Haaren und Haut vorkommt und in dieser Art von Präparaten allgemein als Kontaminanten aus dem Umgang mit dem Menschen anerkannt ist (https://www.thegpm.org/crap/). Neun der geteilten 18 Proteine waren andere Keratine. Ebenfalls als anerkannter Schadstoff für den Menschen enthalten ist Dermcidin (DCD), ein Protein, das im menschlichen Schweiß vorkommt14. Andere identifizierte Proteine finden sich auch in der Epidermis (CSTA15, HRNR16, FLG217) oder wurden zuvor in Hausstaubmilben (S100A7, S100A8, S100A9)18,19 identifiziert. Es ist zu beachten, dass ein wesentlicher Bestandteil von "Staub" die menschliche Hautist 20. Die beiden einzigartigen Proteine, die in den gereinigten Röhrchen identifiziert wurden, wurden beide in EVs involviert, sind jedoch im Vergleich zu anderen identifizierten EV-Proteinen sehr gering 1,21. Die in den Proben identifizierten Proteine stimmen mit der Zubereitung überein und weisen auf eine sehr deutliche Überlappung zwischen leeren und gereinigten Röhrchen hin, was die Wiederverwendung unterstützt.
EVs spielen eine wichtige Rolle in biologischen Prozessen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Zell-Zell-Kommunikation und die Bildung biologischer Mineralisation. EVs sind im menschlichen Körper allgegenwärtig und stellen aufgrund ihres Potenzials als Biomarker, Therapeutika und Informationsquellen für die (Patho-)Physiologie ein schnell wachsendes Gebiet der Grundlagenforschung dar. Die Anreicherung dieser Partikel für Experimente mit differentieller UC erfordert spezielle Polycarbonatrohre. Die einmalige Verwendung und Entsorgung dieser Thermoplaste tragen zu höheren Kosten für experimentelle Verbrauchsmaterialien und der weltweiten Belastung durch die Plastikverschmutzung bei. Darin haben wir ein Protokoll für die Reinigung und Wiederverwendung von Polycarbonat-UC-Röhrchen vorgestellt und validiert, um eine EV-Isolierung durchzuführen, die für Proteomik-Experimente geeignet ist. Letztendlich wird dies den von EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die mit solchen Experimenten verbundenen Kosten senken.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der National Institutes of Health Grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 und R01HL136431, Kowa Company, Ltd. und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Grant Agreement Nr. 101023041 (R. Cahalane) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt. Das aktuelle Reinigungsprotokoll wurde durch die Änderung eines empfohlenen Schlauchreinigungsprotokolls entwickelt, das auf dem Bildungstag der International Society of Extracellular Vesicles 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) vorgestellt wurde. Vielen Dank an Dr. Kathryn Howe und Dr. Sneha Raju vom University Health Network (University of Toronto, Kanada) für die originalen EV-Proben des Karotisgewebes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
| 10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
| an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
| Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
| Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
| Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
| MilliQ water | water | ||
| PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
| Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
| SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
| Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
References
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
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