Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.
Abstract
Die Kalziumsignalisierung ist ein integraler Regulator fast jedes Gewebes. Im Darmepithel ist Kalzium an der Regulierung der sekretorischen Aktivität, der Aktindynamik, der Entzündungsreaktionen, der Stammzellproliferation und vieler anderer nicht charakterisierter zellulärer Funktionen beteiligt. Daher kann die Kartierung der Kalzium-Signaldynamik im Darmepithel Einblicke in homöostatische zelluläre Prozesse geben und einzigartige Reaktionen auf verschiedene Reize aufdecken. Humane intestinale Organoide (HIOs) sind ein vom Menschen abgeleitetes Hochdurchsatzmodell zur Untersuchung des Darmepithels und stellen somit ein nützliches System zur Untersuchung der Kalziumdynamik dar. In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um HIOs mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) stabil zu transduzieren, Live-Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen und Bilddaten zu analysieren, um Kalziumsignale aussagekräftig zu charakterisieren. Als repräsentatives Beispiel wurden 3-dimensionale HIOs mit Lentivirus transduziert, um GCaMP6s, eine grün fluoreszierende Protein-basierte zytosolische GECI, stabil zu exprimieren. Die entwickelten HIOs wurden dann in einer einzelligen Suspension dispergiert und als Monolagen ausgesät. Nach der Differenzierung wurden die HIO-Monolayer mit Rotaviren infiziert und/oder mit Medikamenten behandelt, von denen bekannt ist, dass sie eine Kalziumreaktion stimulieren. Ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer temperaturkontrollierten, befeuchteten Live-Imaging-Kammer ausgestattet war, ermöglichte die Langzeitbildgebung von infizierten oder medikamentös behandelten Monoschichten. Im Anschluss an die Bildgebung wurden die aufgenommenen Bilder mit der frei verfügbaren Analysesoftware ImageJ analysiert. Insgesamt etabliert diese Arbeit eine anpassungsfähige Pipeline zur Charakterisierung zellulärer Signaltransduktion in HIOs.
Introduction
Kalzium ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellphysiologie spielt1. Aufgrund seiner starken Ladung, seiner geringen Größe und seiner hohen Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen ist Kalzium ein idealer Manipulator der Proteinkonformation. Dies macht Kalzium zu einem leistungsstarken Mittel, um elektrochemische Signale in enzymatische, transkriptionelle oder posttranskriptionelle Veränderungen umzuwandeln. Die strengen Kalziumkonzentrationsgradienten über das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Plasmamembranen erzeugen eine hohe Antriebskraft, die schnelle Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration ermöglicht. Mehrere Mechanismen, darunter sowohl die Pufferung als auch der aktive Transport, halten diesen Gradienten aufrecht. Diese Aufrechterhaltung ist zwar für normale Zellfunktionen notwendig, aber energetisch teuer, was sie besonders anfällig für Stresszustände macht 2.
Daher ist eine Dysregulation von Kalzium im Zytosol ein nahezu universelles Signal für viele Arten von zellulärem Stress. Stoffwechselstörungen, Toxine, Krankheitserreger, mechanische Schäden und genetische Störungen können die Kalziumsignalisierung stören. Unabhängig vom Stimulus kann ein anhaltender, unkontrollierter Anstieg des zytosolischen Kalziums auf Ganzzellebene die Apoptose und schließlich die Nekrose fördern 3,4. Veränderungen des zytosolischen Kalziumspiegels mit geringerer Amplitude oder höherer Frequenz haben jedoch unterschiedliche Auswirkungen2. Ebenso können die Ergebnisse von Kalziumschwankungen je nach räumlicher Mikrodomäne, in der sie auftreten, unterschiedlich sein5. Die Überwachung des Kalziumspiegels kann daher Aufschluss über dynamische Signalprozesse geben, erfordert jedoch eine Probenahme mit relativ hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.
Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) sind leistungsfähige Werkzeuge für die kontinuierliche Probenahme in lebenden Zellsystemen6. Einige der am weitesten verbreiteten GECIs sind GFP-basierte, auf Kalzium reagierende fluoreszierende Proteine, die als GCaMPsbekannt sind 7. Die kanonische GCaMP ist eine Fusion von drei verschiedenen Proteindomänen: einem zirkulär permutierten GFP (cpGFP), Calmodulin und M136. Die Calmodulindomäne erfährt bei der Bindung von Kalzium eine Konformationsänderung, die ihre Interaktion mit M13 ermöglicht. Die Calmodulin-M13-Wechselwirkung induziert eine Konformationsänderung des cpGFP, die seine Fluoreszenzemission bei Anregung erhöht. Daher korreliert ein Anstieg der Kalziumkonzentration mit einem Anstieg der GCaMP-Fluoreszenzintensität. Diese Sensoren können zytosolisch oder auf bestimmte Organellen gerichtet sein8.
Ähnlich wie die meisten Gewebe reguliert Kalzium eine Vielzahl von Funktionen innerhalb des Magen-Darm-Epithels. Das Darmepithel ist ein wesentlicher Bestandteil der Nährstoff- und Flüssigkeitsaufnahme, muss aber auch eine dichte Barriere und Immunschnittstelle bilden, um das Eindringen von Krankheitserregern oder toxische Beleidigungen zu vermeiden. Kalziumabhängige Signalwege beeinflussen fast alle diese lebenswichtigen Funktionen 9,10,11. Die Kalziumsignalisierung im Darmepithel ist jedoch nach wie vor ein wenig erforschtes Gebiet mit vielversprechendem Potenzial als therapeutisches Ziel. Während die Überwachung der Kalziumdynamik im Darmepithel in vivo weiterhin eine Herausforderung darstellt, bieten humane Darmorganoide (HIOs) ein anpassungsfähiges ex vivo System für Experimente12. HIOs sind 3-dimensionale (3D) Sphäroide, die aus menschlichen Darmstammzellen gewonnen werden und bei Differenzierung einen Großteil der zellulären Vielfalt des nativen Darmepithels rekapitulieren12.
Dieses Protokoll beschreibt umfassende Methoden zur Entwicklung von HIOs, die GECIs exprimieren, und zur Herstellung von künstlich hergestellten HIOs als Monolayer für die Kalziumbildgebung lebender Zellen. Es bietet eine Virusinfektion als Beispiel für eine pathologische Manipulation, die die Kalziumsignalisierung stört, und bietet einen analytischen Ansatz zur Quantifizierung dieser Veränderungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veränderungen des zytosolischenCa2+-Spiegels können sowohl Ursache als auch Wirkung von Pathologien innerhalb des Epithels sein 10,16,17. Ein Anstieg des zytosolischen Kalziums kann die Sekretion über die Aktivierung des kalziumabhängigen Chloridkanals direkt antreiben TMEM16A18,19. Die Aktivierung von TMEM16A als Reaktion auf Ca2+ ermöglicht d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DK115507 und R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) der National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Die Praktikanten wurden von NIH Grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) und F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) unterstützt. Wir danken dem Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core für die Bereitstellung der organoiden Erhaltungsmedien.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
Riferimenti
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