Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)
Summary
다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
종양 미세환경은 숙주 세포, 종양 세포, 면역 세포, 기질 세포 및 혈관 조직 간의 상호 작용을 포함합니다. 면역 세포 subset과 표적 단백질을 특성화하고 공간적으로 구성하는 것은 예후 및 치료 목적에 매우 중요합니다. 이는 다중 면역조직화학 염색법의 개발로 이어졌습니다. 다중 형광 면역조직화학을 통해 여러 마커를 동시에 검출할 수 있어 세포 기능 및 세포 간 상호 작용에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다. 이 논문에서는 다중 순환 형광 면역조직화학 분석을 위한 워크플로우와 림프구 하위 집합의 정량 분석에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 다중 순환 형광 면역조직화학 염색은 항원 회수, 순환 항체 배양 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 슬라이드 염색을 포함하는 표준 면역조직화학과 유사한 단계 및 시약을 따릅니다. 항원-항체 반응 중에 서로 다른 종의 항체 혼합물이 준비됩니다. 항원 회수 시간 및 항체 농도와 같은 조건은 신호 대 잡음비를 높이기 위해 최적화되고 검증됩니다. 이 기술은 재현성이 있으며 면역 요법 연구 및 임상 응용 분야에 유용한 도구 역할을 합니다.
Introduction
뇌 전이(BM)는 가장 흔한 중추신경계(CNS) 종양으로, 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 거의 절반에서 발생하며 예후가 좋지 않다1. 비소세포폐암 환자의 약 10%-20%가 초기 진단 시점에 이미 BM을 가지고 있으며, 약 40%의 비소세포폐암 환자가 치료 과정에서 BM으로 발전한다2. 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)은 혈관, 섬유아세포, 대식세포, 세포외기질(ECM), 림프구, 골수 유래 면역세포, 신호전달 분자 3,4와 같은 다양한 구성 요소를 포함하여 비소세포폐암(NSCLC) 발생 및 BM과 밀접한 관련이 있습니다. 미세환경 면역세포는 암세포의 성장과 발달에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. 뇌 전이는 복잡한 면역학적 미세환경과 신호전달 과정을 특징으로 하는 수많은 잠재적 치료 표적을 제시합니다. 예를 들어, PD-1 억제제는 면역관문억제제(ICI)로서 폐암 뇌전이(LCBM) 환자에게 임상적 효능을 보였다. 그러나 PD-1 요법에 대한 반응 빈도는 원발성 NSCLC와 LCBM5 간에 다르며, 이는 종양 면역 미세환경이 중요한 ICI 조절자로 작용한다는 것을 시사한다.
면역조직화학(IHC)은 생물학, 기초 의학 및 병리학 분야에서 매우 유용한 도구입니다6. 이 검출 방법은 조직 슬라이드(7) 상의 항원-항체의 상호작용을 통해 항원 발현을 시각화한다. IHC는 예측 마커를 진단하고, 예후 마커를 평가하고, 표적 치료를 안내하고, 종양 세포의 생물학적 기능을 탐색하는 데 사용됩니다8. 그러나 기존의 IHC 방법은 한 번에 하나의 바이오마커만 검출할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 면역조직화학 기술의 혁신은 다중 형광 면역조직화학(mfIHC)의 개발로 이어졌으며, 이를 통해 명시야 및 형광 필드 모두에서 동일한 조직 슬라이드에서 여러 단백질 마커를 동시에 식별할 수 있습니다9. 이러한 발전은 TME 내에서 기질 세포, 면역 세포 및 암세포 간의 세포 구성 및 분자 상호 작용에 대한 정확한 분석을 제공합니다.
본 연구에서는 면역세포의 공간적 분포를 분석하기 위한 multiplex cyclic immunohistochemistry 프로토콜을 제시합니다. 토끼와 쥐와 같은 서로 다른 종의 두 가지 1차 항체를 동시에 선택하여 배양한 후 형광 표지 2차 항체를 선택합니다. 항원 회수는 항원-항체 반응의 각 라운드 후에 수행됩니다. 자가형광은 차단되고 4′, 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 핵 염색에 사용됩니다. 이 패널에는 CD3, CD8, CD20 및 CK의 순차 검출이 포함되어 있으며, 세포는 마커에 따라 종양 세포(CK+), 성숙 T 세포(CD3+), 세포 독성 T 세포(CD3+CD8+), B 세포(CD20+)로 분류됩니다10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 다중 순환 형광 면역조직화학 염색 과정을 설명했습니다. 1차 항체 선택은 형광 면역조직화학 분석의 중요한 측면이며, 더 나은 특이성과 반복성을 위해 단클론 항체를 권장합니다. 1차 항체의 작동 농도를 최적화하기 위해 면역조직화학 실험을 통해 일련의 희석액을 테스트했습니다. 양성 대조군(표적 항원 발현 평가)과 음성 대조군(1차 항체 배양 없음)은 모두 필수적이며 설정해야 합니?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NO.81860413, 81960455), 윈난 과학 기술부 기금 (202001AY070001-080), 윈난성 교육부 과학 연구 재단 (2019J1274)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
Riferimenti
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