الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة
Summary
تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية الدورية المتعددة بالكشف في الموقع عن علامات متعددة في وقت واحد باستخدام حضانة الأجسام المضادة المستضدية المتكررة ، ومسح الصور ، ومحاذاة الصورة وتكاملها. هنا ، نقدم بروتوكول التشغيل لتحديد ركائز الخلايا المناعية بهذه التقنية في سرطان الرئة وعينات ورم خبيث في الدماغ المقترن.
Abstract
تتضمن البيئة المكروية للورم تفاعلات بين الخلايا المضيفة والخلايا السرطانية والخلايا المناعية والخلايا اللحمية والأوعية الدموية. يعد توصيف المجموعات الفرعية للخلايا المناعية والبروتينات المستهدفة وتنظيمها مكانيا أمرا بالغ الأهمية للأغراض التنبؤية والعلاجية. وقد أدى ذلك إلى تطوير طرق تلطيخ الكيمياء المناعية المتعددة. تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية متعددة التألق بالكشف المتزامن عن علامات متعددة ، مما يسهل الفهم الشامل لوظيفة الخلية والتفاعلات بين الخلايا. في هذه الورقة ، نصف سير عمل لمقايسة الكيمياء المناعية الفلورية الدورية المتعددة وتطبيقها في التحليل الكمي للمجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية. يتبع تلطيخ الكيمياء المناعية الفلورية الحلقية المتعددة خطوات وكواشف مماثلة للكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، بما في ذلك استرجاع المستضد ، وحضانة الأجسام المضادة الدورية ، والتلوين على شريحة نسيج مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين (FFPE). أثناء تفاعل المستضد والجسم المضاد ، يتم تحضير خليط من الأجسام المضادة من أنواع مختلفة. يتم تحسين الظروف ، مثل وقت استرجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة ، والتحقق من صحتها لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه التقنية قابلة للتكرار وتعمل كأداة قيمة لأبحاث العلاج المناعي والتطبيقات السريرية.
Introduction
تمثل نقائل الدماغ (BM) أكثر أورام الجهاز العصبي المركزي شيوعا (CNS) ، والتي تحدث في ما يقرب من نصف حالات سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ، مع سوء التشخيص1. ما يقدر بنحو 10٪ -20٪ من مرضى NSCLC لديهم بالفعل BM في وقت التشخيص الأولي ، وحوالي 40٪ من حالات NSCLC ستتطور BM أثناء العلاج2. ترتبط البيئة المكروية للورم (TME) ارتباطا وثيقا بحدوث NSCLC و BM ، بما في ذلك المكونات المختلفة ، مثل الأوعية الدموية ، والخلايا الليفية ، والبلاعم ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا المناعية اللمفاوية ، والخلايا المناعية المشتقة من نخاع العظام ، وجزيئات الإشارة 3,4. تلعب الخلايا المناعية البيئية الدقيقة دورا حاسما في التأثير على نمو الخلايا السرطانية وتطورها. تقدم نقائل الدماغ العديد من أهداف العلاج المحتملة التي تتميز بالبيئات الدقيقة المناعية المعقدة وعمليات الإشارات. على سبيل المثال ، أظهرت مثبطات PD-1 فعالية سريرية للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث في الدماغ بسرطان الرئة (LCBM) كمثبط لنقطة التفتيش المناعية (ICI). ومع ذلك ، فإن تواتر الاستجابات للعلاج PD-1 يختلف بين NSCLC الأساسي و LCBM5 ، مما يشير إلى أن البيئة الدقيقة المناعية للورم تعمل كمنظم حاسم ل ICI.
الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي أداة لا تقدر بثمن في مجالات علم الأحياء والطب التأسيسي وعلم الأمراض6. تصور طريقة الكشف هذه تعبير المستضد من خلال تفاعل الجسم المضاد للمستضد على شريحة الأنسجة7. يستخدم IHC لتشخيص العلامات التنبؤية ، وتقييم العلامات النذير ، وتوجيه العلاجات المستهدفة ، واستكشاف الوظائف البيولوجية للخلايا السرطانية8. ومع ذلك ، يمكن لطريقة IHC التقليدية اكتشاف علامة حيوية واحدة فقط في كل مرة. لمعالجة هذا القيد ، أدى ابتكار التكنولوجيا الكيميائية المناعية إلى تطوير الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية المتعددة (mfIHC) ، والتي تسمح بالتحديد المتزامن لعلامات البروتين المتعددة على نفس شريحة الأنسجة ، سواء في المجال الساطع أو المجال الفلوري9. يوفر هذا التقدم تحليلا دقيقا لتكوين الخلايا والتفاعلات الجزيئية بين الخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا السرطانية داخل TME.
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا للكيمياء المناعية الحلقية المتعددة لتحليل التوزيع المكاني للخلايا المناعية. يتم اختيار اثنين من الأجسام المضادة الأولية من أنواع مختلفة ، مثل الأرانب والفئران ، للحضانة في وقت واحد ، تليها الأجسام المضادة الثانوية الموصوفة بالتألق. يتم إجراء استرجاع المستضد بعد كل جولة من تفاعل المستضد والجسم المضاد. يتم حظر التألق الذاتي ، ويتم استخدام 4 ‘، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتلطيخ النوى. تتضمن اللوحة الكشف المتسلسل عن CD3 و CD8 و CD20 و CK ، ويتم تصنيف الخلايا وفقا للعلامات: الخلايا السرطانية (CK +) ، الخلايا التائية الناضجة (CD3 +) ، الخلايا التائية السامة للخلايا (CD3 + CD8 +) ، الخلايا البائية (CD20 +) 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا عملية تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة. يعد اختيار الأجسام المضادة الأولية جانبا مهما من مقايسة الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، ويوصى باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لتحسين الخصوصية والتكرار. لتحسين تركيز العمل للجسم المضاد ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81860413 ، 81960455) ، صندوق قسم العلوم والتكنولوجيا في يوننان (202001AY070001-080) ، مؤسسة البحث العلمي التابعة لإدارة التعليم في مقاطعة يوننان (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
Riferimenti
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
