Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex
Summary
A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.
Abstract
O microambiente tumoral envolve interações entre células hospedeiras, células tumorais, células imunes, células estromais e vasculatura. Caracterizar e organizar espacialmente subgrupos de células imunes e proteínas-alvo são cruciais para fins prognósticos e terapêuticos. Isso levou ao desenvolvimento de métodos de coloração imunoistoquímica multiplexada. A imunohistoquímica por fluorescência multiplex permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores, facilitando uma compreensão abrangente da função celular e das interações intercelulares. Neste trabalho, descrevemos um fluxo de trabalho para o ensaio de imunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex e sua aplicação na análise de quantificação de subgrupos de linfócitos. A coloração por imunoistoquímica fluorescente cíclica multiplex segue etapas e reagentes semelhantes aos da imunohistoquímica padrão, envolvendo recuperação de antígenos, incubação cíclica de anticorpos e coloração em lâmina de tecido fixada em formalina e emblocada em parafina (FFPE). Durante a reação antígeno-anticorpo, uma mistura de anticorpos de diferentes espécies é preparada. Condições, como tempo de recuperação de antígenos e concentração de anticorpos, são otimizadas e validadas para aumentar a relação sinal-ruído. Esta técnica é reprodutível e serve como uma ferramenta valiosa para pesquisas em imunoterapia e aplicações clínicas.
Introduction
As metástases cerebrais (MB) representam os tumores mais comuns do sistema nervoso central (SNC), ocorrendo em quase metade dos casos de câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC), com mau prognóstico1. Estima-se que 10%-20% dos pacientes com CPNPC já apresentam MB no momento do diagnóstico inicial, e aproximadamente 40% dos casos de CPNPC desenvolverão MB durante o curso do tratamento2. O microambiente tumoral (TME) está intimamente associado à ocorrência de CPNPC e MB, incluindo vários componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células imunes linfoides, derivadas da medula óssea e moléculas sinalizadoras 3,4. As células imunes microambientais desempenham um papel crucial na influência do crescimento e desenvolvimento de células cancerosas. Metástases cerebrais apresentam inúmeros alvos potenciais de tratamento caracterizados por microambientes imunológicos complexos e processos de sinalização. Por exemplo, os inibidores de PD-1 demonstraram eficácia clínica para pacientes com metástase cerebral de câncer de pulmão (MBCL) como um inibidor de ponto de verificação imunológica (ICI). No entanto, a frequência de respostas à terapia com PD-1 varia entre CPNPC primário e MCCBL5, sugerindo que o microambiente imune tumoral atua como um regulador crítico da ICI.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma ferramenta valiosa nos campos da biologia, medicina de fundação e patologia6. Esse método de detecção visualiza a expressão antigênica através da interação antígeno-anticorpo em uma lâminatecidual7. A imunoistoquímica é utilizada para diagnosticar marcadores preditivos, avaliar marcadores prognósticos, orientar terapias-alvo e explorar as funções biológicas das célulastumorais8. No entanto, o método tradicional de IHQ só pode detectar um biomarcador de cada vez. Para suprir essa limitação, a inovação da tecnologia imunoistoquímica levou ao desenvolvimento da imunohistoquímica por fluorescência multiplex (mfIHC), que permite a identificação simultânea de múltiplos marcadores proteicos na mesma lâmina tecidual, tanto em campo claro quanto em campofluorescente9. Esse avanço fornece uma análise precisa da composição celular e das interações moleculares entre células estromais, células imunes e células cancerosas dentro da TME.
Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunohistoquímica cíclica multiplex para analisar a distribuição espacial das células imunes. Dois anticorpos primários de espécies diferentes, como coelho e rato, são escolhidos para incubação simultaneamente, seguidos por anticorpos secundários marcados com fluorescência. A recuperação do antígeno é realizada após cada rodada de reação antígeno-anticorpo. A autofluorescência é bloqueada e 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) é usado para colorir os núcleos. O painel inclui detecção sequencial de CD3, CD8, CD20 e CK, as células são categorizadas de acordo com os marcadores: células tumorais (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos o processo para coloração imunoistoquímica por fluorescência cíclica multiplex. A seleção primária de anticorpos é um aspecto crucial do ensaio imunohistoquímico de fluorescência, e anticorpos monoclonais são recomendados para melhor especificidade e repetibilidade. Para otimizar a concentração de trabalho do anticorpo primário, uma série de diluições tem sido testada através de experimentos de imunohistoquímica. Tanto os controles positivos (para avaliar a expressão do antígeno alvo) qu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NO.81860413, 81960455), Fundo do Departamento de Ciência e Tecnologia de Yunnan (202001AY070001-080), Fundação de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
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