Multiplex cyklisk immunhistokemi möjliggör in situ-detektion av flera markörer samtidigt med hjälp av upprepad antigen-antikroppsinkubation, bildskanning och bildjustering och integration. Här presenterar vi operationsprotokollet för att identifiera immuncellssubstrat med denna teknik i lungcancer och parade hjärnmetastasprover.
Tumörens mikromiljö involverar interaktioner mellan värdceller, tumörceller, immunceller, stromaceller och kärl. Att karakterisera och rumsligt organisera immuncellers undergrupper och målproteiner är avgörande för prognostiska och terapeutiska ändamål. Detta har lett till utvecklingen av multiplexerade immunhistokemiska färgningsmetoder. Multiplex fluorescensimmunhistokemi möjliggör samtidig detektion av flera markörer, vilket underlättar en omfattande förståelse av cellfunktion och intercellulära interaktioner. I den här artikeln beskriver vi ett arbetsflöde för multiplex cyklisk fluorescerande immunhistokemianalys och dess tillämpning i kvantifieringsanalys av lymfocytundergrupper. Den multiplexa cykliska fluorescerande immunhistokemiska färgningen följer liknande steg och reagenser som standardimmunhistokemi, vilket involverar antigenhämtning, cyklisk antikroppsinkubation och färgning på ett formalinfixerat paraffininbäddat (FFPE) vävnadsglas. Under antigen-antikroppsreaktionen framställs en blandning av antikroppar från olika arter. Förhållanden, såsom antigenhämtningstid och antikroppskoncentration, optimeras och valideras för att öka signal-brusförhållandet. Denna teknik är reproducerbar och fungerar som ett värdefullt verktyg för immunterapiforskning och kliniska tillämpningar.
Hjärnmetastaser (BM) är de vanligaste tumörerna i centrala nervsystemet (CNS) och förekommer i nästan hälften av fallen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC), med en dålig prognos1. Uppskattningsvis 10-20 % av NSCLC-patienterna har BM redan vid tidpunkten för den första diagnosen, och cirka 40 % av NSCLC-fallen kommer att utveckla BM under behandlingens gång2. Tumörens mikromiljö (TME) är nära förknippad med förekomst av NSCLC och BM, inklusive olika komponenter, såsom blodkärl, fibroblaster, makrofager, extracellulär matris (ECM), lymfoida, benmärgsderiverade immunceller och signalmolekyler 3,4. Mikroekologiska immunceller spelar en avgörande roll för att påverka cancercellers tillväxt och utveckling. Hjärnmetastaser utgör många potentiella behandlingsmål som kännetecknas av komplexa immunologiska mikromiljöer och signalprocesser. Till exempel har PD-1-hämmare visat klinisk effekt för patienter med lungcancerhjärnmetastaser (LCBM) som en immuncheckpointhämmare (ICI). Frekvensen av svar på PD-1-behandling varierar dock mellan primär NSCLC och LCBM5, vilket tyder på att tumörens immunmikromiljö fungerar som en kritisk ICI-regulator.
Immunhistokemi (IHC) är ett ovärderligt verktyg inom biologi, grundmedicin och patologi6. Denna detektionsmetod visualiserar antigenuttryck genom interaktion mellan antigen-antikropp på ett vävnadsglas7. IHC används för att diagnostisera prediktiva markörer, utvärdera prognostiska markörer, vägleda riktade terapier och utforska tumörcellers biologiska funktioner8. Den traditionella IHC-metoden kan dock bara detektera en biomarkör åt gången. För att ta itu med denna begränsning har innovationen av immunhistokemisk teknik lett till utvecklingen av multiplex fluorescensimmunhistokemi (mfIHC), som möjliggör samtidig identifiering av flera proteinmarkörer på samma vävnadsglas, både i ljusfält och fluorescensfält9. Detta framsteg möjliggör en noggrann analys av cellsammansättning och molekylära interaktioner mellan stromaceller, immunceller och cancerceller inom TME.
I denna studie presenterar vi ett protokoll för multiplex cyklisk immunhistokemi för att analysera den rumsliga fördelningen av immunceller. Två primära antikroppar av olika arter, såsom kanin och råtta, väljs ut för inkubation samtidigt, följt av fluorescensmärkta sekundära antikroppar. Antigenhämtning utförs efter varje omgång av antigen-antikroppsreaktion. Autofluorescens blockeras och 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) används för färgning av kärnorna. Panelen inkluderar sekventiell detektion av CD3, CD8, CD20 och CK, celler kategoriseras enligt markörerna: tumörceller (CK+), mogna T-celler (CD3+), cytotoxiska T-celler (CD3+CD8+), B-celler (CD20+)10,11.
Vi har beskrivit processen för multiplex cyklisk fluorescens immunhistokemisk färgning. Det primära antikroppsvalet är en avgörande aspekt av fluorescensimmunohistokemianalysen, och monoklonala antikroppar rekommenderas för bättre specificitet och repeterbarhet. För att optimera arbetskoncentrationen av den primära antikroppen har en serie utspädningar testats genom immunhistokemiska experiment. Både positiva kontroller (för att bedöma målantigenuttrycket) och negativa kontroller (ingen primär antikroppsin…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
DAPI | sig-ma | D8417 | |
ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
slide viwer | 3D histech Ltd | ||
xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |