Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך להדפסה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של מושבות חיידקים כדי לחקור את תנועתיותן וצמיחתן במטריצות הידרוג'ל נקבוביות תלת-ממדיות מורכבות הדומות יותר לבתי הגידול הטבעיים שלהן מאשר תרביות נוזליות קונבנציונליות או צלחות פטרי.
Abstract
חיידקים נמצאים בכל מקום בסביבות נקבוביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) מורכבות, כגון רקמות וג'לים ביולוגיים, קרקעות ומשקעים תת-קרקעיים. עם זאת, רוב העבודות הקודמות התמקדו במחקרים של תאים בנוזלים בתפזורת או על משטחים שטוחים, אשר אינם משקפים באופן מלא את המורכבות של בתי גידול חיידקיים טבעיים רבים. כאן, פער הידע הזה מטופל על ידי תיאור הפיתוח של שיטה להדפיס בתלת-ממד מושבות צפופות של חיידקים לתוך מטריצות הידרוג'ל גרגיריות תקועות. למטריצות אלה יש גודל נקבוביות מתכוונן ותכונות מכניות; הם כולאים פיזית את התאים, ובכך תומכים בהם בתלת-ממד. הם שקופים אופטית, ומאפשרים הדמיה ישירה של התפשטות חיידקים בסביבתם באמצעות הדמיה. כהוכחה לעיקרון זה, כאן, היכולת של פרוטוקול זה מודגמת על ידי הדפסה תלת ממדית והדמיה של Vibro cholerae שאינו נע ותנועתי, כמו גם Escherichia coli שאינו נע, במטריצות הידרוג'ל גרגיריות תקועות עם גדלים שונים של נקבוביות interstitial.
Introduction
חיידקים מאכלסים לעתים קרובות סביבות נקבוביות תלת-ממדיות מגוונות ומורכבות, החל מג'לים ריריים במעיים ובריאות, וכלה באדמה 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. בסביבות אלה, תנועת חיידקים באמצעות תנועתיות או גדילה יכולה להיות מעוכבת על ידי מכשולים מסביב, כגון רשתות פולימרים או אריזות של גרגרי מינרלים מוצקים - המשפיעים על יכולתם של התאים להתפשט בסביבתם26, לגשת למקורות מזון, ליישב שטחים חדשים וליצור קהילות ביופילם מגינות27. עם זאת, מחקרי מעבדה מסורתיים משתמשים בדרך כלל בגיאומטריות פשוטות מאוד, תוך התמקדות בתאים בתרביות נוזליות או על משטחים שטוחים. בעוד שגישות אלה מניבות תובנות מפתח על מיקרוביולוגיה, הן אינן משחזרות באופן מלא את המורכבות של בתי גידול טבעיים, מה שמוביל להבדלים דרמטיים בקצב הצמיחה ובהתנהגות התנועתיות בהשוואה למדידות שבוצעו בסביבות בעולם האמיתי. לכן, יש צורך קריטי בשיטה להגדיר מושבות חיידקים ולחקור את תנועתיותן וצמיחתן בסביבות נקבוביות תלת-ממדיות הדומות יותר לרבים מבתי הגידול הטבעיים שלהן.
חיסון תאים לג'ל אגר ולאחר מכן הדמיה של התפשטותם המקרוסקופית בעין או באמצעות מצלמה מספק דרך פשוטה אחת להשיג זאת, כפי שהוצע לראשונה על ידי טיטסלר וסנדהולצר בשנת 193628. עם זאת, גישה זו סובלת ממספר אתגרים טכניים מרכזיים: (1) בעוד שגודל הנקבוביות יכול, באופן עקרוני, להשתנות על ידי שינוי ריכוז האגרוז, מבנה הנקבוביות של ג'לים כאלה מוגדר בצורה גרועה; (2) פיזור אור גורם לג'לים אלה להיות עכורים, מה שמקשה על הדמיה של תאים בקנה מידה אינדיבידואלי ברזולוציה גבוהה ובאמינות, במיוחד בדגימות גדולות; (3) כאשר ריכוז האגר גדול מדי, נדידת התאים מוגבלת למשטח השטוח העליון של הג'ל; (4) הריאולוגיה המורכבת של ג'לים כאלה מקשה על החדרת אינוקולה עם גיאומטריות מוגדרות היטב.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה, בעבודה קודמת, פיתחה מעבדתו של דאטה גישה חלופית המשתמשת במטריצות הידרוג'ל גרגיריות - המורכבות מחלקיקי הידרוג'ל תקועים ותואמים ביולוגית הנפוחים בתרבית חיידקים נוזלית - כ"צלחות פטרי נקבוביות" לכליאת תאים בתלת-ממד. מטריצות אלה הן מוצקים רכים, בעלי יכולת ריפוי עצמי, מניבים עקה; לכן, שלא כמו עם ג'לים צולבים המשמשים בתהליכי הדפסה ביולוגית אחרים, מיקרו-זרבובית הזרקה יכולה לנוע בחופשיות בתוך המטריצה לאורך כל נתיב תלת-ממדי שנקבע על ידי סידור מחדש מקומי של חלקיקי ההידרוג'ל29. חלקיקים אלה מתצטופפים מחדש במהירות ומרפאים את עצמם סביב חיידקים מוזרקים, ותומכים בתאים במקומם ללא כל עיבוד מזיק נוסף. תהליך זה הוא, אם כן, סוג של הדפסה תלת-ממדית המאפשרת לסדר תאי חיידקים - במבנה תלת-ממדי רצוי, עם הרכב קהילתי מוגדר - בתוך מטריצה נקבובית בעלת תכונות פיסיקוכימיות. יתר על כן, מטריצות ההידרוג'ל שקופות לחלוטין, ומאפשרות להמחיש את התאים ישירות באמצעות הדמיה.
התועלת של גישה זו הודגמה בעבר בשתי דרכים. בקבוצה אחת של מחקרים, תאים מדוללים פוזרו ברחבי מטריצת הידרוג'ל, מה שאפשר מחקרים על תנועתיות של חיידקים בודדים30,31. בסדרת מחקרים אחרת, קהילות רב-תאיות הודפסו בתלת-ממד בג'לים בקנה מידה של סנטימטר באמצעות פיית הזרקה שהורכבה על שלב מיקרוסקופ ניתן לתכנות, שאפשרה מחקרים על התפשטות קולקטיבים חיידקיים בסביבתם32,33. בשני המקרים, מחקרים אלה חשפו הבדלים שלא היו ידועים בעבר במאפייני ההתפשטות של חיידקים המאכלסים סביבות נקבוביות בהשוואה לאלה בתרבית נוזלית / על משטחים שטוחים. עם זאת, בהתחשב בכך שהם הותקנו על שלב המיקרוסקופ, מחקרים קודמים אלה היו מוגבלים לנפחי מדגם קטנים (~ 1 מ"ל), ולכן, סקאלות זמן ניסוי קצרות. הם גם היו מוגבלים ביכולתם להגדיר גאומטריות אינוקולה ברזולוציה מרחבית גבוהה.
כאן מתואר הדור הבא של פלטפורמה ניסיונית זו המתייחסת לשתי המגבלות. באופן ספציפי, פרוטוקולים מסופקים שבאמצעותם ניתן להשתמש במדפסת תלת ממד שונה עם מכבש מזרק מחובר להדפסת תלת מימד ומושבות חיידקים תמונה בקנה מידה גדול. יתר על כן, נתונים מייצגים מצביעים על האופן שבו גישה זו יכולה להיות שימושית לחקר תנועתיות וצמיחה של חיידקים, תוך שימוש בביופילם לשעבר Vibrio cholerae ו פלנקטוני Escherichia coli כדוגמאות. גישה זו מאפשרת לקיים מושבות חיידקים לאורך זמן ולהמחיש אותן באמצעות טכניקות הדמיה שונות. לפיכך, ליכולתה של גישה זו לחקור קהילות חיידקים בבתי גידול נקבוביים תלת-ממדיים יש פוטנציאל מחקרי ויישומי עצום, המשפיעים על הטיפול והמחקר של מיקרובים במעיים, בעור, בריאה ובאדמה. יתר על כן, גישה זו יכולה לשמש בעתיד להדפסה תלת-ממדית של חומרים חיים מהונדסים מבוססי חיידקים לצורות מורכבות יותר העומדות בפני עצמן.
Protocol
גישה זו היא להמיר מדפסת מסחרית למידול תצהיר התכה תלת-ממדית למדפסת ביולוגית תלת-ממדית באמצעות פרוטוקול שנקבע בעבר על ידי Tashman et al.34. בקצרה, Tashman et al. החליפו ראש מכבש מסחרי במכבש משאבת מזרקים בהתאמה אישית. מכבש זה מאפשר הדפסה של תרחיפים נוזליים מרוכזים מאוד של תאי חיידקים בתלת-ממד, כאשר נפחו ומיקומו התלת-ממדי נשלטים על ידי שפת התכנות G-code. אמצעי האחסון המושחל מצוין בתוכנה על ידי שלב האקסטרודר (E-step) ובנוסף מכויל כמתואר בהמשך. תרחיפים חיידקיים אלה מודפסים ישירות לתוך מטריצת הידרוג'ל גרעינית, הפועלת כתמיכה תלת ממדית לתאים. בהמשך, הפרוטוקול מתאר גם כיצד להכין מטריצות עם ריכוזי פולימרים שונים, לאפיין את השינויים הנובעים מכך בגודל הנקבוביות ובתכונות הריאולוגיות, ולאפיין את תנועתיות וצמיחת החיידקים לאחר מכן באמצעות הדמיה ישירה.
1. הסבה של מדפסת תלת-ממד מסחרית למדפסת ביולוגית תלת-ממדית
- הסר את המכבש ואת תנור החימום ממדפסת תלת-ממד מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- עקוב אחר פרוטוקולים קודמים כדי לייצר את מכבש משאבת המזרק34, עם שינוי נוסף כדי להתאים מזרק נעילת Luer חד פעמי. הרכיבו את מכבש משאבת המזרק על המדפסת.
הערה: קובצי CAD הדרושים לשינוי מכבש משאבת המזרק עבור מזרקי פלסטיק מסופקים בקבצים משלימים 1-3. - התקן ופתח את תוכנת מדפסת התלת-ממד (ראה טבלת חומרים) במחשב. חבר את מדפסת התלת-ממד למחשב.
- טען מזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל עם מחט בגודל מתאים לתוך מלחציים המודפסים בתלת-ממד על-ידי יישור החצי העליון והתחתון של המנגנון (איור 1). הדקו את המהדקים סביב המזרק באמצעות שלושה ברגים לשקעי M8 ואומי משושה דקים מפלדה (ראו טבלת חומרים). בוכנת המזרק מתחברת לבורג העופרת במכבש משאבת המזרק. הרם ידנית את הבוכנה על ידי סיבוב בורג העופרת כדי ליצור מרווח אוויר של 0.5 מ"ל במזרק.
- אם זיהום הוא חשש לניסוי, להעביר את קומפלקס מהדק מזרק לביוהוד ולעקר עם 70% תרסיס אתנול עם הכניסה לפני השלמת השלבים הבאים.
2. הכנת ההשעיה החיידקית
- עבור V. cholerae ו- E. coli, לגדל לילה על 2% Lennox LB (מרק לוריא, ראה טבלה של חומרים) צלחת אגר ב 37 ° C.
- עבור V. cholerae, לחסן את התאים לתוך 3 מ"ל של LB נוזלי עם עשרה חרוזי זכוכית סטרילית. גדל את התאים באינקובטור רועד ב 37 ° C במשך 5-6 שעות עד השלב המעריכי האמצעי לצפיפות אופטית (OD) 600 של ~0.9.
- עבור E. coli, לחסן את התאים לתוך 3 מ"ל של LB נוזלי. לגדל את התאים באינקובטור רועד ב 37 ° C במשך הלילה. 200 μL של תרבית לילה ב LB טרי במשך 3 שעות עד OD מגיע 0.6.
- מעבירים את התרבית לצינור צנטריפוגה של 10 מ"ל. צנטריפוגה את התרבית במשך 5 דקות ב 5,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי ליצור כדור. הסר את supernatant. השהה מחדש עם ~ 10 μL של LB נוזלי כדי להשיג צפיפות תאים של ~ 9 x10 10 תאים למ"ל.
3. העמסת התרחיף החיידקי לתוך המזרק
הערה: שתי שיטות ניתנות להעמסת החיידקים לתוך המזרק (שלב 3.1 ושלב 3.2). שלב 3.1 עובד לטעינת כמויות קטנות של תרחיפים חיידקיים, <200 μL, ושלב 3.2 עובד לטעינת נפחים גדולים יותר של תרחיפים חיידקיים, >200 μL. שלב 3.1 שימש לתוצאות המייצגות המוצגות כאן.
- טען מזרק נעילה Luer ריק מפלסטיק בנפח 1 מ"ל לתוך המדפסת הביולוגית התלת-ממדית. חבר את בוכנה מזרק עם בורג עופרת. משוך ידנית את המזרק כדי להוסיף 0.2 מ"ל של מרווח האוויר כדי לספק מקום לבוכנה לנוע במזרק כמו נפח קטן של תאים ~ 20-50 μL משמשים עבור כל אצווה של ניסויים.
- חבר מחט קהה לקצה המזרק עם גודל המחט הדרוש לגודל תכונות ההדפסה הנדרשות. כאן, מחט 2 אינץ '20 G משמש.
- טען את התרחיף החיידקי לתוך המזרק על ידי הנחת צינור צנטריפוגה 10 מ"ל עם החיסון החיידקי מתחת למחט. סובב ידנית את הבורג כדי למשוך את בוכנה מזרק לטעון את התאים לתוך מזרק. נפחי תאי החיידק קטנים כל כך, שלעתים קרובות התאים נטענים רק לתוך המחט.
- הסר את הבוכנה ממתחם מהדק המזרק והשתמש במזרק ומחט אחרים כדי לטעון בזהירות את קומפלקס מהדק המזרק עם המתלים החיידקיים הרצויים, תוך זהירות להימנע מלכידת בועות אוויר. יש למלא את קומפלקס מהדק המזרק מעט מעל השוליים בתרחיף החיידקי הרצוי ולאחר מכן להעביר למדפסת הביולוגית.
- הכנס בזהירות את קומפלקס מהדק המזרק ללא הבוכנה לשקע המתאים בליבה הראשית של מכבש הביו-מדפסת.
- ודא כי עגלת המדפסת נמצאת בערך באמצע בורג העופרת, וכי צלחת איסוף נמצאת מתחת למזרק הטעון. לאחר מכן, הכנס בזהירות את הבוכנה דרך הכרכרה וגם דרך קומפלקס מהדק המזרק עד שהוא תופס על הכרכרה. לחץ על הבוכנה באיטיות לתוך המתלה החיידקי כדי למנוע לכידת בועות אוויר במזרק.
- החלק את מהדק המתאם על הכרכרה מעל גב הבוכנה כדי לאבטח אותה במקומה הן לתמרוני אקסטרוזיה והן לתמרוני משיכה.
4. כיול שלב המכבש לנפח שהופקד
- כדי לכייל את שלב המכבש (E-step) לנפח שהופקד, הגדירו תחילה את המדפסת הביולוגית עם המזרק, מחט המזרק וההפקדה המדויקים של תרחיף חיידקי שישמשו בניסוי. כאן, מזרק מנעול Luer 1 מ"ל משמש.
- קבע טווח משוער של צעד E לכיול על-ידי שחול מספר שרירותי של צעד E (~200) ושים לב לשינוי נפח הבוכנה עם סמני נפח מזרק.
- השתמש ביחס גס זה בין E-step לעוצמת קול כדי לקבוע את הגדרות E-step לביצוע ניקוי הכיול. לדוגמה, אם E-step של 200 extrudes כ 20 μL על ידי בדיקה חזותית אחד רוצה להפקיד 10-200 μL, לבדוק E-steps בין 100-2000.
- כדי לבצע את טאטוא הכיול הלינארי, תחילה תייג ומדד את המסה היבשה של עשרים צינורות דגימה של 1.5 מ"ל על איזון אנליטי עם רגישות של 0.1 מ"ג.
- הבליטו את התרחיף החיידקי לתוך צינורות 1.5 מ"ל שנמדדו מראש. עבור כל שלב E, בצע לפחות 2 עותקים משוכפלים. חזור על הפעולה עבור כל צעדי ה-E לאורך הטווח הליניארי, והחליף את המתלה החיידקי לפי הצורך. אם זיהום הוא חשש לניסוי, נגבו את החלק החיצוני של מחט המזרק עם מגבון ללא סיבים רווי באתנול 70% לאחר כל דגימה.
- למדוד את המסה של כל צינורות 1.5 מ"ל עם איזון אנליטי זהה. הפחת את ערך המסה הראשון מהשני כדי לקבל מסה נטו של תרחיף חיידקי שהופקד.
- להמיר את המסה של תרחיף חיידקי לתוך נפח עם צפיפות החומר. עבור תרחיפים חיידקיים רבים המורכבים בעיקר ממים, 1 גרם/מ"ל הוא קירוב צפיפות מתאים.
- בצע התאמה ליניארית בין מדרגת E לנפח האקסטרוזי כדי לסיים את תהליך הכיול.
5. הכנת מטריצת הידרוג'ל גרגירית
- בארון בטיחות ביולוגית, הוסף גרגירים יבשים של קופולימרים חומצה אקרילית/אלקיל אקרילט צולבים (ראה טבלת חומרים) ל-400 מ"ל של 2% לנוקס לוריא-ברטאני (LB) כדי לשמור על המטריצה סטרילית; עם זאת, ניתן להשתמש גם במדיה אחרת של תרבית תאים נוזליים כדי לנפח את מטריצת ההידרוג'ל.
הערה: אחוז המשקל של גרגירים שנוספו ל-LB תלוי בגודל הנקבוביות שאליו מכוונים. במחקר הנוכחי, עבור מטריצת הידרוג'ל גרגירית 0.9%, 3.6 גרם של גרגירים יבשים מתווספים ל- LB ועבור מטריצת הידרוג'ל גרגירית של 1.2%, 4.8 גרם של גרגירים יבשים מתווספים ל- LB. גרגרי ההידרוג'ל מפוזרים בצורה הומוגנית על ידי ערבובם במיקסר עומד למשך 2 דקות. - לאחר הערבוב, כוונן את ה- pH ל- 7.4 על ידי הוספת תוספות של 20 עד 500 μL של נתרן הידרוקסידי 10 M (NaOH) כדי להבטיח את קיום התא. לאחר כל תוספת של NaOH, מדדו את רמת החומציות על ידי טבילת קצה פיפטה בתערובת ולאחר מכן ניגוב מטריצת ההידרוג'ל על נייר בדיקת pH.
הערה: כאשר מוסיפים את ה-NaOH, צמיגות התערובת תגדל ככל שגרגירי ההידרוג'ל יתחילו להתנפח. גרגרי ההידרוג'ל הנפוחים הם ~ 5 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר בקוטר ותקועים יחד במטריצת הידרוג'ל. גודל הרשת הפנימית של הגרגירים הוא ~ 40 ננומטר עד 100 ננומטר, כפי שנקבע בעבר32. גודל הרשת גדול מספיק כדי שמולקולות קטנות (למשל, חמצן וחומרי מזון) יתפזרו בחופשיות, אך קטן מספיק כדי שחיידקים יהיו כלואים בין נקבוביות הביניים. - לאחר מכן, להעביר את מטריצת הידרוג'ל גרגירי צינור צנטריפוגה 50 מ"ל באמצעות מזרק פלסטיק סטרילי 50 מ"ל. צנטריפוגה את מטריצת ההידרוג'ל ב 161 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הבועות שנוצרו במהלך תהליך הערבוב.
- אפשרו למטריצת ההידרוג'ל לשבת לפחות יומיים בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שלא התרחש זיהום. הזיהום מופיע כמיקרו-מושבות המושעות במטריצת ההידרוג'ל. לאחר יומיים, צנטריפוגו את מטריצת ההידרוג'ל ב 161 x גרם למשך דקה אחת כדי להסיר בועות נוספות שנוצרו.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי אחסון מטריצת ההידרוג'ל בטמפרטורת החדר למשך עד שבוע. - בארון הבטיחות הביולוגית, באמצעות מזרק פלסטיק סטרילי 30 מ"ל, להעביר את הכמות הרצויה של מטריצת הידרוג'ל למיכל שבו תתרחש הדפסה (כאן ~ 20 מ"ל עבור בקבוק תרבית רקמה 20 מ"ל או 1 מ"ל עבור 1 מ"ל מיקרו קוביות פלסטיק שימשו).
6. אפיון התכונות הריאולוגיות של מטריצת הידרוג'ל גרגירית
- טען ~ 3 מ"ל של מטריצת ההידרוג'ל לתוך ראומטר גזירה (ראה טבלת חומרים) עם רווח של 1 מ"מ בין לוחות מקבילים בקוטר 50 מ"מ כדי למדוד את התכונות הראולוגיות.
- כמת את התנהגות התשואה באמצעות מדידות גזירה חד-כיווניות על ראומטר הגזירה על-ידי מדידת מתח הגזירה כפונקציה של טאטוא לוגריתמי של קצב גזירה מ-10-4 s-1 עד 102 s-1 (לדוגמה, איור 2A).
הערה: בקצב גזירה נמוך, מטריצת ההידרוג'ל תהיה בעלת מתח גזירה קבוע (מתח התשואה) שאינו תלוי בקצב הגזירה. בקצב גזירה גבוה, לחץ הגזירה יגדל עם תלות חוק כוח בקצב הגזירה, המציין את הנוזל של מטריצת ההידרוג'ל. התנהגות זו של עקה מאפשרת להדפיס חיידקים בתלת-ממד בתוך מטריצת הידרוג'ל גרגירית29. - מדוד את מודולי האחסון וההפסד, G' ו-G'' בהתאמה, כפונקציה של תדר באמצעות ריאולוגיה תנודתית של משרעת קטנה עם משרעת מאמץ של 1% ותדרים בין 0.1 ל-1 הרץ (לדוגמה, איור 2B).
הערה: מטריצת ההידרוג'ל הגרגירית האידיאלית להדפסה תלת-ממדית צריכה להיות בעלת מודולוס אחסון גדול יותר ממודולוס ההפסד, המציין את המדיום פועל כמוצק אלסטי תקוע29.
7. אפיון גודל נקבוביות אינטרסטיציאלי של מטריצת הידרוג'ל גרגירית
- סוניק 100 ננו-חלקיקי פוליסטירן פלואורסצנטיים קרבוקסילטים (~ 3.6 x 1013 חלקיקים/מ"ל, ראה טבלת חומרים) באריזתם למשך 15 דקות להשהיה מחדש כדי לפרק כל צבירה/אשכול של חלקיקים. להעביר 50 μL של ננו-חלקיקים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,500 x גרם בטמפרטורת החדר עד שהגלולה נוצרת והסופרנאטנט ברור. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מצע הצמיחה הנוזלי (כאן LB) המשמש להכנת מטריצת הידרוג'ל גרגירי.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי אחסון הננו-חלקיקים המרחפים מחדש ב-4°C למשך עד 3 חודשים.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,500 x גרם בטמפרטורת החדר עד שהגלולה נוצרת והסופרנאטנט ברור. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מצע הצמיחה הנוזלי (כאן LB) המשמש להכנת מטריצת הידרוג'ל גרגירי.
- סוניק את הננו-חלקיקים המרחפים מחדש למשך 30 דקות. העבר 1 מ"ל של מטריצת הידרוג'ל גרגירית לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הוסף 1 μL של ננו-חלקיקים מרחפים למטריצת הידרוג'ל גרגירית ומערבבים אותם עם קצה פיפטה. לאחר הערבוב, צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 161 x גרם בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את מטריצת ההידרוג'ל ואת תערובת הננו-חלקיקים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בעובי 0.1 מ"מ היטב. קוטרה של הבאר 20 מ"מ ועומקה 1 מ"מ. הניחו על גבי כיסוי זכוכית ולחצו כלפי מטה כדי להשבית את הזרימה והאידוי במהלך הצילום. חלופה לכיסוי זכוכית היא להוסיף 1 מ"ל של שמן פרפין על גבי.
- דמיינו את הננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת שמן של 40x עם זום נוסף פי 8 בתוכנת ההדמיה (ראו טבלת חומרים).
הערה: ניתן להשתמש במטרת הגדלה גבוהה יותר במקום להשתמש בזום דיגיטלי נוסף בתוכנה.- תמונה של לולאת זמן ללא השהיה (באופן אידיאלי ~ 19 פריימים לשנייה) במישור z יחיד למשך 2 דקות עם לפחות ארבעה ננו-חלקיקים בשדה הראייה. חזור על הפעולה 15 עד 20 פעמים במקומות שונים כדי לאסוף מספיק נתונים לסטטיסטיקה (100 עד 200 ננו-חלקיקים).
- השתמש בתוכנה למעקב אחר חלקיקים כדי לנתח את התזוזה של החלקיקים. כאן, נעשה שימוש בסקריפט מותאם אישית המבוסס על אלגוריתם קרוקר-גריר הקלאסי כדי לעקוב אחר מרכז המסה של ננו-חלקיק35 (ראה קובץ משלים 7).
- מתוך מעקב אחר חלקיקים, חשב את התזוזה הריבועית הממוצעת (MSD). ה-MSD יציג דיפוזיה חופשית בחלל הנקבוביות באורכים קצרים ובסקאלות זמן קצרות ויעבור לקנה מידה תת-דיפוזי באורכים גדולים ובסקאלות זמן עקב ריתוק35.
- זהה את סקאלת האורך שבה מתרחש המעבר לשינוי קנה מידה תת-דיפוזי כדי להעריך את גודל הנקבוביות המקומי. חשב את גודל הנקבוביות על ידי הוספת סקאלת אורך זו לקוטר הננו-חלקיקים. חזור על ניתוח גודל הנקבוביות עבור כל ננו-חלקיק שנמדד. זה יניב התפלגות גודל נקבוביות שממנה ניתן לחשב גודל נקבוביות ממוצע (לדוגמה, איור 3).
תהליך הדפסה 8. 3D
- מחזיקי הדפסה תלת-ממדית בהתאמה אישית עבור מכלי המדגם (ראה קבצים משלימים 4-6 לקובצי CAD). כאן, מחזיקי תרבית הרקמה צלוחיות microcuvettes משמשים. המחזיקים מאפשרים לתכנת את המדפסת להדפיס דוגמאות מרובות בסשן הדפסה יחיד. מקם את מיכלי הדגימה עם מדיה הידרוג'ל במחזיקים על פלטפורמת הבנייה.
- פתח את תוכנת ההדפסה בתלת-ממד. טען קוד G מתוכנת מראש לתוך התוכנה. לקבלת התוצאות המייצגות, שלב 3.1 משמש לטעינת המתלה החיידקי למדפסת התלת-ממד.
הערה: דוגמה לקוד g להדפסת גאומטריות אנכיות ליניאריות מוצגת בטבלה 1. - באמצעות תוכנת ההדפסה התלת-ממדית, הזז את מישורי x-y-z כדי למרכז את ראש ההדפסה במישור x-y כדי להיות הגורם המכיל הראשון ולאחר מכן הביתה את ציר z. ציר ה-z הביתי ירים את ראש ההדפסה. סובב ידנית את הבורג לאט כדי ללחוץ על בוכנה מזרק עד כמות קטנה של תרחיף חיידקי ניתן לראות בקצה המחט.
- נגבו קלות את עודפי התרחיף החיידקי בעזרת מגבון חד פעמי סטרילי. בהתבסס על גובה מחזיק הדגימה, המחט והמזרק, באמצעות תוכנת ההדפסה התלת-ממדית, הנמיכו את ראש ההדפסה למרחק קבוע לתוך מדיית ההידרוג'ל במיכל הדגימה שבחרתם. התחל את תהליך ההדפסה על ידי לחיצה על הדפס.
- לאחר השלמת ההדפסה, סגור את הגורמים המכילים לדוגמה. נגבו את המדפסת עם 70% אתנול. כראוי להיפטר מזרק ומחט.
9. גידול והדמיה של V. cholerae
- להדמיה בשדה ראייה גדול, השתמש במצלמה עם עדשת זום המחוברת לצמיחת תאי תמונה באמצעות תיבת אור. דמיינו את הדגימות מיד לאחר ההדפסה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן העבירו אותן לאינקובטור. שמור דגימות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור נייח בין מפגשי הדמיה במהלך הניסוי.
- צלם תמונות במשך פרק זמן רצוי כדי לצפות בהתנהגות הצמיחה בפרקי זמן ארוכים במטריצת ההידרוג'ל הגרגירית.
Representative Results
שימוש במדפסת ביולוגית תלת-ממדית עם מטריצת הידרוג'ל גרעינית מרחיב את היכולות של מדפסות ביולוגיות להדפיס מושבות חיידקים לצורות שכאשר הן מודפסות על מצע שטוח במקום זאת, היו צונחות בגלל הצמיגות הנמוכה של תרחיף החיידקים. הרזולוציה של הגישה המוצגת כאן תלויה במהירות האקסטרוזיה, גודל המחט, מהירות ראש ההדפסה, האוויר במחט וצמיגות המתלה החיידקי. בשל הנפח הנמוך של תרחיף חיידקי, בועות אוויר עלולות להיות מוכנסות בשוגג במהלך העמסת התרחיף החיידקי לתוך המזרק והמחט. זה יכול להוביל לשקיעה של בועת אוויר במבנה המודפס הסופי (איור 4). דרך נוספת להכניס בועות אוויר להדפס היא אם לא לוחצים על הבוכנה כדי ליצור טיפה קטנה של תרחיף חיידקי בקצה המחט לפני ההדפסה וקיים מרווח אוויר בקצה המחט. לא ללחוץ על בוכנה מזרק לפני הדפסה יכול גם להוביל נפחים שונים של תאים להיות מודפסים באותה אצווה. אולם ככל שהזמן מתקדם, בועת האוויר מתמוססת בתווך שמסביב, כפי שניתן לראות באיור 4.
לצורך כיול שלב האקסטרוזיה, נפח ההפקדה תלוי באופן שבו המפעיל הליניארי של ראש ההדפסה מתרגם את בוכנה מזרק, הקוטר הפנימי של המזרק ישפיע ישירות על נפח. יתר על כן, התכונות הריאולוגיות של תרחיף חיידקים ישפיעו על הקלות שבה הם חותכים דרך כיווץ המחט כדי להדפיס בצורה חלקה. לכן, יש לבצע מחדש הליך כיול זה עבור כל מערך מזרק/מחט/מתלה חיידקי. באופן עקרוני, כיול מזרקים יכול להיות אוטומטי. עם זאת, בפועל, כתיבת קוד כזה שחל באופן נרחב על מקרי שימוש רבים תהיה מאתגרת. לדוגמה, משתמש השואף לכייל את האקסטרוזיה של כ-300 מיקרוליטר ממזרק של 1 מ"ל יצטרך לטעון מחדש את המזרק בתדירות גבוהה בהרבה מאשר משתמש המכייל סביב נפח יעד של 30 מיקרוליטר. מאחר שקבוע כיול E-step לעוצמת קול אינו ידוע כאשר תהליך הכיול מתחיל, ייתכן שהמשתמש לא יוכל לחזות בדיוק באיזו תדירות נדרשת טעינה מחדש. יתר על כן, כדי להפוך את תהליך הכיול לאוטומטי, יהיה צורך לציין את המיקומים המדויקים של כל צינור 1.5 מ"ל שנשקל מראש. כדי להבטיח שכל הדיו הביולוגי יושקע מהמחט לתוך הצינור לצורך כיול מדויק, יש ליצור מגע מדויק בין המחט לבין תחתית / דופן הצינור. ללא מגע טוב, טיפות קטנות עלולות להישאר רטובות ומחוברות למחט. לכן, כל שינוי מיקום בין צינורות עשוי לתרום רבות לטעויות בתהליך הכיול. מסיבות אלה, המחברים ממליצים לכל משתמש לבנות תוכנית כיול המתאימה לצרכיו הייחודיים.
מאפיין מרכזי של הגישה המוצגת כאן הוא היכולת לדמיין חיידקים מתפשטים בסביבתם ישירות באמצעות תנועתיות וגדילה באמצעות הדמיה. בגרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול ההדמיה, לוחות 6 בארות מולאו ב -19 מ"ל של מטריצת הידרוג'ל גרגירית. אולם אפילו עם הדפסה תלת-ממדית מוצלחת של קו אופקי של תאים שניתן לצפות בו במיקרוסקופ הפוך, מושבה צפופה תגדל גם על פני השטח העליונים של התווך, ותגביל את ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 5). המושבה על המשטח העליון נגרמה ככל הנראה מזיהום כאשר מחט המזרק הוכנסה או הוסרה ממנו במהלך ההדפסה. כדי לעקוף את הבעיה הזו, קווים אנכיים של תאים מודפסים בבקבוקוני נצנוץ (איור 6A). עם זאת, העקמומיות של הבקבוקונים הגליליים גרמה לעיוות במהלך ההדמיה. זה הוביל לבחירה של קוביות בעלות דפנות שטוחות וצלוחיות תרבית רקמה כמכלי הדגימה להדפסה, מה שמאפשר הדמיה לא מעוותת (איור 6B-D). מגבלה אחת של צלוחיות תרבית רקמה היא הצוואר המוטה הקטן המגביל את הגיאומטריות שניתן להדפיס.
יחד, פרוטוקול זה מאפשר תצפית על תנועתיות חיידקים וגדילה בסביבות נקבוביות מורכבות על פני טווחי זמן ארוכים. כמה דוגמאות מוצגות באיור 6B-G עבור V. cholerae היוצר ביופילם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, כמו גם תאים פלנקטוניים של E. coli באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית סורקת לייזר – מה שמדגים את הרבגוניות של גישה זו. ואכן, בעיה פוטנציאלית של מטריצות הידרוג'ל היא האוטופלואורסצנטיות האפשרית שלהן כאשר הן מצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; עם זאת, התמונות המוצגות באיור 6F,G מראות כי אוטופלואורסצנטיות כזו היא מינימלית בפלטפורמת הניסוי המוצגת כאן. מגבלה נוספת של גישות מיקרוסקופיה אופטית כזו היא הרזולוציה המרחבית שלהן, שנקבעת על ידי מגבלת העקיפה ב~100 ננומטר; אולם סקאלת האורך הזו קטנה בהרבה מגודלו של תא חיידק בודד, ולכן, שיטות אופטיות מספקות את היכולת לצלם תאי חיידקים מקנה המידה של תאים בודדים (איור 6G) ועד לקנה המידה של מושבות רב-תאיות גדולות יותר 30,31,32,33. דוגמאות נוספות מתוארות להלן.
כפי שצוין לעיל, הגישה המוצגת כאן יכולה לשמש להדפסה תלת-ממדית ולתמונה של מושבות חיידקים בנפחי מטריצה קטנים (1 מ"ל) וגדולים (20 מ"ל). לפיכך, ההבדלים בתוצאות המתקבלות באמצעות כרכים שונים מתוארים להלן, תוך שימוש במושבות מודפסות בתלת-ממד של V. cholerae תנועתי ולא תנועתי כדוגמאות מייצגות. הרזולוציה המרחבית (רוחב הקו) של ההדפסה נקבעת על ידי הקוטר הפנימי של הזרבובית. בדוגמאות המתוארות להלן, מחט בקוטר פנימי של 0.6 מ"מ גורמת למושבה גלילית התחלתית של 0.6 מ"מ. עבודות קודמות הוכיחו כי ניתן להפחית את רזולוציית ההדפסה עוד יותר באמצעות נימי זכוכית משוכים בקוטר פנימי של ~100-200 מיקרומטר33.
עבור הכרכים הקטנים, נעשה שימוש בשתי מטריצות הידרוג'ל גרגיריות שונות עם שתי התפלגות גודל נקבוביות שונות: אחת עם גודל נקבוביות ממוצע גדול מהקוטר הממוצע של תא V. cholerae, 0.2-0.4 מיקרומטר36, והשנייה עם גודל נקבוביות ממוצע קטן מקוטר זה. הדגימות במשך שנים-עשר ימים מצולמות ונמדדות באמצעות ניתוח תמונות של ההתפשטות האריאלית של המושבות לאורך זמן (איור 7 ואיור 8). עבור תאים שאינם נעים, אשר יכולים להתפשט בסביבתם רק באמצעות גדילת תאים, קצב ההתפשטות האריאלית היה דומה בין המטריצות השונות שנחקרו (איור 7), מה שמצביע על כך שהבדלים בגודל נקבוביות המטריקס אינם משפיעים על התפשטות התא באמצעות גדילה – כצפוי. לעומת זאת, עבור התאים התנועתיים המתפשטים בסביבתם באמצעות תנועתיות פעילה, קצב ההתפשטות האראלית של V. cholerae היה גבוה יותר עבור מטריצת ההידרוג'ל עם הנקבוביות הגדולות יותר - שעבורן הכליאה על ידי גרגרי ההידרוג'ל מעכבת פחות את תנועתיות התאים. הבדלים אלה בהתפשטות חיידקים ניכרו גם במורפולוגיות המושבה (איור 8). המושבה של V. cholerae במטריצות הידרוג'ל עם נקבוביות גדולות יותר מתפשטת דרך פלומות חלקות ומפוזרות (איור 8A), ומשקפת התפשטות באמצעות תנועתיות פעילה כפי שנצפה קודם לכן32. ואכן, בהתאם לפרשנות זו, פלומות מפוזרות אלה אינן נצפות במקרה של תאים שאינם נעים (איור 8C). בנוסף, הנקבוביות גדולות מספיק כדי שהתאים לא ידחפו את החרוזים בזמן שהם שוחים דרך הנקבוביות. יתר על כן, הלחץ הצמיגי המופעל על ידי שחייה הוא פחות מ 1 Pa, אשר אינו מספיק כדי לעוות את מטריצת הידרוג'ל שמסביב במידה ניכרת. לעומת זאת, המושבה במטריצות הידרוג'ל עם נקבוביות קטנות יותר מתפשטת רק דרך פלומות גסות דמויות פרקטל עבור תאים תנועתיים ולא תנועתיים (איור 8B,D), מה שמשקף התפשטות אך ורק באמצעות גדילת תאים, בעוד שהתאים גדלים הם מעוותים באופן זמני ומניבים את המטריצה שמסביב. למעשה, בהתחשב בכך שלחץ התשואה של מטריצות ההידרוג'ל קטן בהרבה מלחץ הטורגור של התאים, בגבול זה של גודל נקבוביות קטנות, המטריצה מספקת רק התנגדות חלשה לצמיחת תאים ולא נראה שהיא משפיעה מאוד על המבנה המודפס בתלת-ממד, גם כפי שאומת בעבודתנו הקודמת37.
תוצאות דומות נצפות עבור ניסויים שבוצעו בדגימות בנפח גדול; עם זאת, בהתחשב בשפע הגדול יותר של חומרים מזינים בדגימות אלה, הניסויים יכולים לשמור על צמיחת תאים על פני טווחי זמן ארוכים יותר. לדוגמה, מוצגות תוצאות באמצעות מטריצות הידרוג'ל גרגיריות שבהן גודל הנקבוביות הממוצע היה קטן מגודל התא - ולכן, התפשטות התאים נבעה בעיקר מגדילה. הדגימות מצולמות במשך ~30 יום במטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות ונצפו התרחבות אריאלית דומה הן עבור תאים שאינם נעים והן עבור תאים תנועתיים במשך 150 השעות הראשונות; אולם בזמנים ארוכים אף יותר נצפית שונות חזקה בין דגימות, כאשר חלק מהדגימות מציגות קצב התפשטות מהיר יותר (איור 9 ואיור 10). באופן מעניין, בדגימה מחדש של מטריצת ההידרוג'ל לאחר הניסוי – יתרון של הנפח הגדול של מטריצת ההידרוג'ל – נמדדת ירידה בלחץ היבול, מודולי האחסון ומודולי האובדן (איור 11), מה שמצביע על כך שהמטריצות התרככו. שינוי זה יכול לנבוע מכך שה-V. cholerae מייצר מולקולה שמשנה את תכונות מטריצת ההידרוג'ל ומקדמת התפשטות תאית בזמנים ארוכים, דבר שיהיה מעניין לבחון במחקר עתידי. דוגמאות למורפולוגיה הגסה דמוית המושבה הפרקטלית שגורמת לניסויים האלה מוצגות באיור 10.
איור 1: תמונות של המדפסת הביולוגית התלת-ממדית שנבנתה בהתאמה אישית. (A) מדפסת ביולוגית עם ראש מכבש משאבת מזרק שונה עם מזרק ומחט חד-פעמיים מסוג Luer lock. מדפסת ביולוגית היא ~ 46 ס"מ רוחב. (B) תמונה של הדפסה תלת-ממדית של תאים בצלוחיות מלאות במטריצת הידרוג'ל תקועה. רוחב התמונה הוא 87 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון התכונות הריאולוגיות של מטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות. (A) לחץ גזירה כפונקציה של קצב הגזירה המופעל. (B) מודולי אחסון ואיבוד, G' ו-G'' בהתאמה, כפונקציה של תדירות התנודה. המקרא מציין את חלק מסת ההידרוג'ל המשמש להכנת כל מטריצת הידרוג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידות גודל נקבוביות של שתי מטריצות הידרוג'ל גרגיריות מייצגות. על ידי מעקב אחר עוקבים, התפלגות ממדי הנקבוביות האופייניים נקבעת עבור כל מטריצת הידרוג'ל. הנתונים מיוצגים על-ידי 1-CDF, כאשר CDF היא פונקציית ההתפלגות המצטברת. המקרא מציין את חלק מסת ההידרוג'ל המשמש להכנת כל מטריצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמאות לבועות שנוצרו במהלך הדפסה תלת-ממדית של חיידקים. (A) סכמה של מערך ההדמיה. (B) תמונות של צמיחת V. cholerae עם בועה בתחתית ההדפסה (קופסה אדומה) במטריצת הידרוג'ל 1.2% נפוחה ב-LB. לאחר 59 שעות של גידול ב 37 מעלות צלזיוס, בועת האוויר מומסת לחלוטין, והמושבה קורסת בחזרה בגלל האלסטיות של מטריצת הידרוג'ל. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות של הקו האופקי של V. cholerae המודפס בלוח בן שש בארות מלא במטריצת הידרוג'ל 1.2% נפוחה ב-LB והביופילם שנוצר על פני השטח העליונים לאחר 48 שעות דגירה ב-37°C. (A) סכמה של מערך ההדמיה. (B) היווצרות הביופילם על פני השטח העליונים עקב זיהום במהלך הדפסה תלת-ממדית מפחיתה את האטימות ואינה מאפשרת הדמיה ברורה של הקו האופקי. פני השטח העליונים יוצרים קמטים, ככל הנראה בשל צמיחה דיפרנציאלית. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמאות למכלים שונים לדוגמה שניתן להשתמש בהם בשיטה זו. (A) V. cholerae מודפס בבקבוקון זכוכית ממולא במטריצת הידרוג'ל גרעינית 1.2% לאחר 470 שעות. העקמומיות של הבקבוקון מקשה על הדמיה של הצמיחה. מוטות קנה מידה = 5 מ"מ. (B) V. cholerae מודפס במיקרו-קובטה מלאה במטריצת הידרוג'ל גרעינית 1.2%. הצדדים השטוחים מאפשרים הדמיה ברורה, עם זאת, הנפחים הקטנים מגבילים את אורך הניסויים לפני שנגמרים לתאים מצעי הצמיחה. (C) מערך הדמיה עם עדשת זום לתמונה V. cholerae מודפס בבקבוק תרבית רקמה מלא במטריצת הידרוג'ל גרעינית 1.2%. בדומה למארז המיקרו-קובטה, הצדדים השטוחים מאפשרים הדמיה ברורה. ניתן למלא את צלוחיות תרבית הרקמה בנפחים גדולים יותר של מטריצת הידרוג'ל גרגירית, ובכך להאריך את טווח הזמן של הניסוי. (D) תמונה מעדשת הזום של V. cholerae המודפסת בתוך מטריצת הידרוג'ל גרעינית של 1.2% לאחר 100 שעות דגירה ב-37°C. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (E) מערך הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה של תאים פלואורסצנטיים. (F) הקרנה תלת-ממדית של מיקרוגרפים קונפוקליים של E. coli פלואורסצנטי בתוך מטריצת הידרוג'ל גרעינית 1.2% לאחר 10 ימי דגירה ב-37°C. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (G) מיקרוגרף קונפוקלי ברזולוציה של תא בודד של E. coli פלואורסצנטי בתוך מטריצת ההידרוג'ל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: התרחבות השטח כפונקציה של זמן מושבות של V. cholerae המודפסות ב-1 מ"ל של מטריצות תמיכה בהידרוג'ל גרגירי. הנתונים על העלילה לקוחים מניתוח התמונה של איור 8. נצפה כי תאים תנועתיים (עיגול אדום סגור וריבוע) מתפשטים בקצב מהיר יותר מאשר תאים שאינם נעים, המשקפים התפשטות הן על ידי צמיחה והן על ידי תנועתיות. בנוסף, התאים הנעים במטריצת ההידרוג'ל בעלי גודל נקבוביות גדול (ריבועים אדומים) מתפשטים בקצב מהיר יותר מהתאים במטריצת ההידרוג'ל בעלי נקבוביות של 0.3 מיקרומטר (עיגולים אדומים). תאים שאינם נעים אינם מראים הבדל בקצב ההתפשטות בין שני גדלי הנקבוביות, מכיוון שהם רק גדלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מושבות של V. cholerae מודפסות ב-1 מ"ל של מטריצות תמיכה בהידרוג'ל גרגירי. (A) תמונות של הצמיחה והתנועתיות של V. cholerae תנועתי במטריצת הידרוג'ל גרגירית 0.9% שבה גודל הנקבוביות גדול מקוטר התא הממוצע. החיצים מצביעים על פלומה מפוזרת הנוצרת עקב תאים הנעים דרך מטריצת ההידרוג'ל. (B) תמונות של הצמיחה והתנועתיות של V . cholerae תנועתי במטריצת הידרוג'ל גרגירית של 1.2% שבה גודל הנקבוביות קטן מקוטר התא הממוצע. החיצים מצביעים על פלומה גסה דמוית פרקטל הנוצרת עקב גדילת תאים. (C) תמונות של התפתחות הזמן של V. cholerae שאינו נע במטריצת הידרוג'ל גרגירית 0.9% שבה גודל הנקבוביות גדול מקוטר התא הממוצע. במקרה זה, פלומות מפוזרות המשקפות תנועתיות אינן ניתנות לצפייה. (D) תמונות של הצמיחה של V. cholerae שאינו נע במטריצת תמיכה הידרוג'ל גרגירית של 1.2% שבה גודל הנקבוביות קטן מקוטר התא הממוצע. במקרה זה, שוב ניתן להבחין בפלומות גסות, דמויות פרקטל המשקפות צמיחה. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: התרחבות השטח כפונקציה של זמן מושבות של V. cholerae המודפסות ב-20 מ"ל של 1.2% מטריצות תמיכה בהידרוג'ל גרעיני. תאים שאינם תנועתיים (מעגלים פתוחים) ותאים תנועתיים (מעגלים סגורים) נצפים להתפשט בקצב דומה במשך 100 השעות הראשונות. לאחר 100 שעות, נצפים הבדלים בקצב ההתפשטות האריאלי, אולי בגלל התפתחות השונות בזמנים ארוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: מושבות של V. cholerae מודפסות ב-22 מ"ל של 1.2% מטריצות הידרוג'ל גרגיריות שגדלו ב-37°C. (למעלה) תמונות של צמיחה של תנועה V. cholerae. (למטה) תמונות של הצמיחה של לא תנועה V. cholerae. בשני המקרים ניתן להבחין בפלומות גסות, דמויות פרקטל המשקפות צמיחה. פסי קנה מידה = 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: אפיון התכונות הריאולוגיות של מטריצת הידרוג'ל גרעינית 1.2% לפני (0 שעות) ואחרי הניסוי (397 שעות). (A) לחץ גזירה כפונקציה של קצב הגזירה המופעל. (B) מודולי אחסון ואיבוד, G' ו-G'' בהתאמה, כפונקציה של תדירות תנודה מופעלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פקודות Gcode | פעילויות | |||
| M82 | מצב אקסטרוזיה מוחלט | |||
| M302 S0 | אפשר אקסטרוזיה קרה | |||
| M92 E14575 | הגדר את שלבי האקסטרוזיה למ"מ | |||
| G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 | הגדר את ציר z ואת מיקום האקסטרוזיה לאפס, ואת מיקום x-,y ל- 35.71 מ"מ ו- y 88 מ"מ כאשר ראש ההדפסה נמצא כאשר ה- g-code מתחיל | |||
| M221 S100 T0 | מגדיר את קצב הזרימה ל- 100% | |||
| M107 | כבו את המאוורר | |||
| G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 | הוציאו את 20 μL של ביו-דיו לתוך המטריצה בקצב הזנה של 50 μL/min במקום שבו נקבע המיקום הנוכחי | |||
| G0 F200 Z60 | משוך את המחט מהמטריצה ודגום קונטיאנר במהירות של 200 מ"מ/דקה | |||
| G0 F500 X65.81 Y81.0 | הזיזו את המחט לקונטינר הדגימה הבא במהירות של 500 מ"מ/דקה | |||
| G0 F100 Z0 | יש להנמיך את המחט לתוך הרציף הבא של הדגימה לאותו מיקום z שבו ההדפסה החלה במהירות של 100 מ"מ/דקה | |||
| G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 | הוציאו את 20 μL של ביו-דיו לתוך המטריצה בקצב הזנה של 50 μL/min במקום שבו נקבע המיקום הנוכחי | |||
| G0 F200 Z60 | משוך את המחט מהמטריצה ודגום קונטיאנר במהירות של 200 מ"מ/דקה | |||
| G0 F500 X96.01 Y81.0 | הזיזו את המחט לקונטינר הדגימה הבא במהירות של 500 מ"מ/דקה | |||
| G0 F100 Z0 | מחט תחתונה לתוך רציף הדגימה לאותו מיקום z שבו ההדפסה החלה במהירות של 100 מ"מ/דקה | |||
| G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 | הוציאו את 20 μL של ביו-דיו לתוך המטריצה בקצב הזנה של 50 μL/min במקום שבו נקבע המיקום הנוכחי | |||
| G0 F200 Z60 | משוך את המחט מהמטריצה ודגום קונטיאנר במהירות של 200 מ"מ/דקה | |||
| G0 F500 X126.21 Y81.0 | הזיזו את המחט לקונטינר הדגימה הבא במהירות של 500 מ"מ/דקה | |||
| G0 F100 Z0 | יש להנמיך את המחט לתוך הרציף הבא של הדגימה לאותו מיקום z שבו ההדפסה החלה במהירות של 100 מ"מ/דקה | |||
| G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 | הוציאו את 20 μL של ביו-דיו לתוך המטריצה בקצב הזנה של 50 μL/min במקום שבו נקבע המיקום הנוכחי | |||
| G0 F200 Z80 | משוך את המחט מהמטריצה ודגום קונטיאנר במהירות של 200 מ"מ/דקה | |||
טבלה 1: תכנות G-code להדפסת קווים אנכיים של תרחיף החיידקים.
קובץ משלים 1: קובץ STL למהדק התחתון 1 מ"ל מזרקי נעילת Luer חד פעמיים למכבש המזרק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ STL עבור המהדק העליון עבור מזרקי Luer נעילה חד פעמיים של 1 מ"ל עבור מכבש המזרק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: קובץ STL למתאם המזרקים למזרק 1 מ"ל מזרקי נעילת Luer חד פעמיים למכבש המזרק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: קובץ STL עבור מחזיק דוגמת הקובט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 5: קובץ STL למחזיק דגימת בקבוק הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 6: קובץ STL לצלחת 6 בארות ומיטת הדפס צלחת פטרי 35 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 7: סקריפט מותאם אישית למעקב אחר חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
חשוב לוודא כי בעת הכנת כל מטריצת הידרוג'ל, המטריצה נעשית בסביבה סטרילית. אם לא, זיהום יכול להתרחש, אשר מתבטא, למשל, microcolonies (ספרואידים קטנים) במטריצה לאחר מספר ימים. במהלך תהליך הערבוב, חשוב שכל חלקיקי ההידרוג'ל הגרגיריים היבשים יומסו. בנוסף, בעת התאמת ה- pH של כל מטריצת הידרוג'ל עם NaOH, הגרגירים יתחילו להתנפח, מה שמגדיל את צמיגות מטריצת ההידרוג'ל, מה שמוביל לערבוב קשה יותר. שימוש במיקסר המעמד יעזור להבטיח שה-NaOH מעורבב היטב במטריצת ההידרוג'ל. במהלך ההעמסה של כל מתלה חיידקי, כיסי אוויר יכולים להיווצר במחט. כדי להימנע מבעיה זו, ודא שקצה המחט יושב תמיד בתרחיף החיידקי בצינור הצנטריפוגה ולא בתחתית הצינור או ליד המשטח העליון. דרך נוספת להתגבר על בעיה זו היא לגדל כמויות גדולות של תאים ובכך יש נפחים גדולים יותר של תרחיף חיידקים להדפסה.
מגבלות
כיום, במהלך ההדפסה, הצמיגות הנמוכה של תרחיף החיידקים מגבילה את הגיאומטריות שניתן להדפיס ולעתים קרובות מובילה להיווצרות ביופילם ולגידול על גבי משטח מטריצת ההידרוג'ל עקב תאי קורט. ישנן מספר שיטות אפשריות להתגבר על מגבלה זו, כולל הגדלת צמיגות המתלה החיידקי או מיטוב נוסף של הגדרות מדפסת התלת-ממד. כדי להגביר את צמיגות התרחיף החיידקי, ניתן לערבב את התרחיף החיידקי עם פולימר אחר - לדוגמה, אלגינט, ששימש בעבר להדפסה תלת-ממדית של חיידקים על משטחים שטוחים38. ניתן למטב עוד יותר את הגדרות המדפסת כדי לאפשר נסיגה של בוכנת המזרק במהלך משיכת המחט ממטריצת ההידרוג'ל הגרגירית, דבר שיהיה בעל פוטנציאל לעצור את שקיעת התאים במהלך הסרת המחט ממטריצת ההידרוג'ל.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדפסה של מושבות חיידקים למטריצות הידרוג'ל גרגיריות. מטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות מאפשרות לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים חיצוניים (למשל, גודל נקבוביות, עיוות מטריצה) על תנועתיות וגדילה של חיידקים. בנוסף, בעוד בעבודה זו, LB משמש כמדיום הגידול הנוזלי כדי לנפח את מטריצת הידרוג'ל, מטריצת הידרוג'ל יכול להיות נפוח עם מדיה צמיחה נוזלית אחרת, כולל מדיה עם אנטיביוטיקה. שיטות קודמות לחקר חיידקים בסביבות סגורות הוגבלו על ידי משך זמן הניסוי, גודל רשת הפולימר וקשיחות מטריצת ההידרוג'ל שמסביב37,38. פרוטוקולים כבר קיימים לייצור מטריצות הידרוג'ל גרגיריות מפולימרים שונים, כך שהפוטנציאל לחקר ההשפעות של תנאי סביבה שונים על תנועתיות וגדילה של חיידקים הוא עצום. שיטה זו מאפשרת לחקור חיידקים בסביבות בקרה שמחזירות בקלות רבה יותר את הסביבות שבהן חיידקים חיים בעולם האמיתי, כגון ריר פונדקאי או אדמה. מגבלה נוספת של שיטות רבות אחרות היא האטימות של המטריצה הסובבת; עם זאת, גישה זו באמצעות חומרים שקופים אופטית מספקת את היכולת לחקור, למשל, בקרה אופטוגנטית ודפוסים של חיידקים בתלת-ממד.
מעבר לחקר תנועתיות וצמיחה, שיטת ההדפסה התלת-ממדית המתוארת כאן מתגברת על מגבלותיהן של שיטות ביו-הדפסה רבות אחרות הדורשות שיקוע של ביו-דיו על מצע ולכן הן מוגבלות בגובה החומר החי המהונדס שהן יכולות לייצר. בעתיד, פרוטוקול הדפסה ביולוגית זה יכול להיות מורחב עוד יותר לייצור חומרים ביו-היברידיים על ידי ערבוב פולימרים עם תאים יוצרי ביופילם. מטריצות ההידרוג'ל הגרגיריות מספקות תמיכה בהדפסה תלת-ממדית של חומרים חיים מהונדסים עבים יותר בקנה מידה גדול יותר וגיאומטריות מורכבות יותר מאשר שיטות רבות אחרות להדפסה ביולוגית של חיידקים כיום. בעוד שעבודה זו השתמשה רק ב - V. cholerae ו - E. coli, מינים אחרים, כגון Pseudomonas aeruginosa, הודפסו בהצלחה גם הם בתלת-ממד37. מעבר להדפסה, ניתן להתאים את המדפסת לביצוע דגימה מבוקרת של חיידקים לאחר הגדילה כדי לראות אם חלו שינויים גנטיים, למשל.
Disclosures
הפלטפורמה הניסיונית המשמשת להדפסה תלת-ממדית ולהדמיה של קהילות חיידקים בפרסום זה היא הנושא של בקשת פטנט שהוגשה על ידי אוניברסיטת פרינסטון בשם Tapomoy Bhattacharjee ו- S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).
Acknowledgments
ר.ק.ב. מודה על תמיכתה של תוכנית עמיתי המחקר הנשיאותית לפוסט-דוקטורט. חומר זה מבוסס גם על עבודה הנתמכת על ידי מענק תוכנית מלגות מחקר לתארים מתקדמים של NSF DGE-2039656 (ל- A.M.H). א.ס.ד.-מ. ו-H.N.L. מודים על תמיכתה של Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund באוניברסיטת פרינסטון. אנו מודים גם למעבדה של בוני באסלר על אספקת זנים של V. cholerae. SSD מודה על תמיכתם של מענקי NSF CBET-1941716, DMR-2011750 ו- EF-2124863, כמו גם קרן אריק וונדי שמידט לטכנולוגיה טרנספורמטיבית, קרן הבריאות של ניו ג'רזי, תוכנית המלגות הביו-רפואיות של פיו ותוכנית המורים-חוקרים של קמיל דרייפוס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| 1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| 100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
| 15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
| 20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
| 25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
| 3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
| 50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
| Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
| Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
| Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
| Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
| M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
| Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
| Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
| Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
References
- Persat, A., et al.
- Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
- Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
- Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
- Grice, E. A., Segre, J. A.
- Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
- Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
- Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
- Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
- Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
- O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
- Gill, C. O., Penney, N.
- Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
- Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
- Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
- Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
- de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
- Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
- Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
- Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
- Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
- Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
- Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
- Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
- Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
- Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S.
- Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
- Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).
