Summary
Protokollen gir en detaljert standardiseringsprosess av avkoksformel og gavageteknikk med Yiqi Jiedu-avkok i osteosarkommusemodellen som et eksempel. Den beskriver dyrevern og forbedrer påliteligheten av forskningsdata, og gir effektive strategier for å undersøke terapeutisk effekt og molekylære mekanismer for avkokformler in vivo.
Abstract
Avkoksformel er den mest brukte doseringsformen i tradisjonell kinesisk medisin og anvendt i klinisk praksis i tusenvis av år ved transoral administrering, som er preget av rask effekt, enkel absorpsjon og individualisert behandling basert på pasientens spesifikke syndromer. Kvaliteten på avkokformelen er direkte ansvarlig for den kliniske effekten av tradisjonell kinesisk medisin; Derfor er standardiseringsprosessen av avkokformelen viktig for å unngå forskjeller i avkokkvalitet forårsaket av subjektive faktorer. I mellomtiden, på grunn av begrensningene ved å utføre kliniske eksperimenter, brukes små dyr som bærer menneskelige sykdommer, som mus, ofte i medisinsk forskning for å utforske terapeutisk effekt og omfattende mekanismer for ulike inngrep, inkludert avkokformelen for tradisjonell kinesisk medisin. Følgelig, som en viktig transoral administrasjonsmetode, er den dyktige gavage-teknikken spesielt viktig for å unngå potensiell spiserørskade og legemiddelsøl, noe som vil sikre at like mye medisin administreres til hvert modelldyr, noe som fører til nøyaktige eksperimentelle resultater. Videre er den standardiserte metoden for avkoksformelforberedelse og dyktig gavage-strategi nødvendig for å beskytte dyrevelferden og minimere antall dyr som brukes. Her rapporterte vi en detaljert standardiseringsprosess av avkokformelen og gavageteknikken med Yiqi Jiedu-avkok i osteosarkommusemodell som et eksempel. Effekten ble evaluert av tumorvolumet. Denne protokollen vil maksimere dyrevern og forbedre påliteligheten av forskningsdata, og gir derfor effektive strategier for fremtidig undersøkelse av terapeutisk effekt og molekylære mekanismer for avkoksformel for tradisjonell kinesisk medisin in vivo.
Introduction
Dekoksjonsformel er den mest brukte doseringsformen av tradisjonell kinesisk medisin og flytende legemidler 1,2. Avkokformelen for tradisjonell kinesisk medisin behandles ved å avkok urter i vann etter å ha blitt gjennomvåt, etterfulgt av filtrering for å kaste bort dregs.
Fordi avkokformelen kan individualiseres basert på kliniske nødvendigheter, spesielt i tråd med egenskapene til evidensbasert behandling i tradisjonell kinesisk medisin, har denne doseringsformen via transoral administrasjon blitt brukt i klinisk praksis i tusenvis av år med spesifikke og uerstattelige fordeler 3,4. Kvaliteten på avkokformelen er direkte relatert til den kliniske effekten. Derfor må avkokformelen fremstilles basert på prinsippene for de standardiserte avkokningsmetodene for å sikre at de aktive ingrediensene maksimalt ekstraheres og beskyttes3. I mellomtiden er avkok-klare medisiner den viktigste formen for rå kinesiske urter som brukes i klinisk praksis; kvalitetsstandardene og produksjonsmetodene for foreskrevne avkokingsklare medisiner må overholde bestemmelsene i den kinesiske farmakopéen2. Videre må de foreskrevne avkokklare medisinene bløtlegges i kaldt drikkevann i minst 30 minutter før de avkokes i en spesiell farmasøytisk gryte ved oppvarming5. Studier har vist at de fleste av de aktive ingrediensene kan ekstraheres ved avkok i to ganger, og anbefalingen for administrasjon av avkok av tradisjonelle kinesiske medisiner i medisinske institusjoner foreskriver også avkok som skal gjøres to ganger 4,6,7. Hvis spesielle kinesiske urter, som en med hard tekstur eller tonics, foreskrives, anbefales avkokningstiden å forlenges. Avkokredskapene og oppbevaringsbeholderne som direkte kommer i kontakt med avkokformelen, fra beholderen der de foreskrevne avkok-klare medisinene er gjennomvåt, skal være kjemisk stabile og ha lokk, for eksempel gryteretter, keramikk, glass og rustfritt stål. Imidlertid bør aluminium og vanlige plastprodukter ikke brukes, mens jern og andre etsende redskaper bør forbys for å unngå mulige kjemiske reaksjoner, noe som vil redusere terapeutisk effekt og til og med gi skadelige effekter 4,6,7.
På grunn av begrensningene ved å utføre kliniske eksperimenter, brukes små dyr som bærer menneskelige sykdommer, som mus, ofte i medisinsk forskning for å utforske terapeutisk effekt og omfattende mekanismer for forskjellige inngrep, inkludert avkokformelen for tradisjonell kinesisk medisin 8,9; Imidlertid, i motsetning til mennesker, bør avkokformlene tilberedes hver dag, blandes sammen og nyadministreres 2x om dagen i klinisk praksis. Dyr er ikke i stand til frivillig å ta medisinene sine i tide med den nødvendige doseringen, og de fleste dyreforsøk relatert til tradisjonell kinesisk medisin er gavage-basert oral administrering av avkokformlene for tiden. Avkokformlene som brukes til in vivo dyreforsøk skal tilberedes på forhånd, alisiteres, oppbevares ved -20 °C og tines rett før bruk 3,4,10. Videre øker substandard dyr immobilisering og gavage nål manipulasjon risikoen for unødvendige skader og negative følelser. Derfor, som en viktig metode for transoral legemiddellevering, er den dyktige gavage-teknikken spesielt viktig for å unngå mulig esophageal skade og narkotikaspill, og dermed sikre at hvert modelldyr får like mye foreskrevet urtemedisin for å oppnå nøyaktige eksperimentelle resultater. Her gir vi en gavage-protokoll for avkokformelen for tradisjonell kinesisk medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen beskriver den detaljerte gavageteknikken i osteosarkommodellmus ved å bruke Yiqi Jiedu-avkok som en prøve. Fire uker gamle, mannlige atymiske mus (BALB / c naken) ble brukt i dette eksperimentet og holdt i SPF-klasse avlsrom av Laboratory Animal Center i Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Alle dyreforsøk ble godkjent av dyreforvaltningen og komiteen ved Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, i samsvar med de etiske retningslinjene for forsøksdyr (godkjenningsnummer for dyreetikk: PZSHUTCM2304060007), og utført i strengt samsvar med de internasjonale kravene knyttet til forsøksdyr.
1. Materialer
- Få tak i følgende materialer: Kinesiske urter (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, piggskallehette urt 31,5 g), 1 ml sprøyte og 12G/55 mm albuenål (figur 1).
2. Bestemmelse av dosering
- Beregn den daglige dosen som følger: Den daglige dosen for voksne med en standard kroppsvekt på 60 kg er Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g og Barbed skullcap urt 9 g, med totalt 36 g avkok-klar medisin, det vil si 0,6 g avkok-klare medisiner / kg kroppsvekt. Med henvisning til 12 ganger for ekvivalent dose, 6 ganger for lav dose og 24 ganger for høy dose mellom voksne med standard kroppsvekt på 60 kg og musene med standard kroppsvekt på 25 g i henhold til kroppsoverflaten11, samt våre foreløpige data, bruk et 20 ganger doseforhold mellom Yiqi Jiedu-avkok for musene i den nåværende studien, Doseringen for mus var derfor 12 g avkokklare legemidler/kg kroppsvekt.
- Beregn doseringen for hver mus ved hjelp av ligningen:
Dosering til mus (stående kroppsvekt) = dosering for voksen (stående kroppsvekt) x 20 (angitt ekvivalent doseforhold).
Den daglige dosen av hver mus er 0,3 g [(12 g avkokingsklare legemidler/1000 g kroppsvekt) x 25 g kroppsvekt] i 200 μL med en endelig konsentrasjon på 1,5 g/ml. - Beregn total avkok-klar medisin for mus (n = 7) i Yiqi Jiedu avkok gruppen med gavage administrasjon i 28 dager til å være 58,8 g. Konsentrer dette til 39,2 ml for å nå en endelig konsentrasjon på 1,5 g/ml.
- Med tanke på mulig legemiddeltap under avkok og gavage-stadiene, og for enkel beregning, utarbeide totalt 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Barbed skullcap urt 31,5 g) avkok-klar medisin, konsentrere seg til et endelig volum på 84 ml.
3. Cellekilde og kultur
- Kjøp menneskeavledede 143B osteosarkomceller fra ATCC cellebank.
- Frø 1 x 106 143B celler i 10 ml MEM medium inneholdende 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin i en 10 cm cellekulturskål.
- Dyrkning 143B celler ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator til cellene er 80% -90% konfluerende.
4. Modelleringsmetoder
- Samle de 80% konfluente dyrkede 143B-cellene, resuspender i 6 ml 10% serumholdig MEM-medium og bland med kjellermembranmatriksgel i et volumforhold på 1: 1 for å lage en cellesuspensjon med en endelig konsentrasjon på 1 x 107 celler / ml.
- Injiser 10 μL av cellesuspensjonen i venstre tibia hos hver atymmus for å etablere en in situ xenograft osteosarkom musemodell, som beskrevet i vår tidligere publikasjon12. Trinnene i korte trekk er som følger.
- Vask cellene 2x med PBS. Trypsiniser cellene med 1,5 ml 0,25% trypsin i 3 minutter. Tilsett 6 ml 10 % serumholdige MEM-medier. Samle cellene i et 15 ml sentrifugerør.
- Aspirer 20 μL cellesuspensjon inn i kammeret på celletellingsplaten og beregne cellekonsentrasjon ved hjelp av en automatisk celleteller. Sentrifuger cellene ved 800 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten med en pipette, resuspender cellepelleten i 8,5 mg/ml membranmatriks og legg dem på is.
- Bedøv musene ved å utsette dem for 2 % isofluran og 98 % oksygen (oksygenstrømningshastighet, 2 l/min). Påfør en liten mengde veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
- Utfør hele prosedyren i et godt ventilert område. Før osteosarkom celle injeksjon, sørg for at hver mus er under dyp anestesi ved forsiktig å berøre foten; Hvis musen fortsatt har svar, for eksempel rykk eller rykk. Vent lenger hvis musen fortsatt har svar, for eksempel rykk eller rykk, til disse svarene forsvinner.
- Plasser musen i liggende stilling. Hold musens ankel med tommelen og pekefingeren og desinfiser injeksjonsstedet til tibia med tre alternerende runder betadin og 70% etanolpinne.
- Fest kanylen til en 1 ml sprøyte og pek nålespissen mot injeksjonsstedet parallelt med tibiaaksen. Sett kanylen perkutant inn for å bore et hull gjennom tibiaplattformen mot den distale enden av tibia.
- Legg osteosarkomcellesuspensjonen som tidligere ble lagt på is i en mikrovolumsprøyte og erstatt 1 ml sprøyten i tibia med den osteosarkomcellelastede mikrovolumsprøyten. Injiser sakte ca. 10 μL (1 x 107 celler/ml) osteosarkomcellesuspensjon i tibia til hver atymmus.
- Fjern sprøyten med mikrovolum fra injeksjonsstedet, og trykk på injeksjonsstedet med bomullsservietten i ca. 30 dager. Sett musen tilbake i et rent bur og observer utvinningen i 10 minutter.
5. Fremstilling av tradisjonell kinesisk medisin avkok formel for gavage ( Figur 2)
- Beregn doseringen i henhold til trinn 2.
- Soak alle medisinske urter for avkok, bortsett fra den dyre urt Ginseng, i drikkevann med et nivå 3 cm høyere enn medisinoverflaten, i 30 minutter, og utfør deretter avkoket 2x som beskrevet nedenfor.
- Utfør det første avkoket ved å varme opp til koking over sterk ild, og deretter varme opp i 15-25 min over en mild brann. Mild brann refererer til en laveffektsvarme med temperaturer som vanligvis varierer fra 80 ° C til 100 ° C, mens sterk brann refererer til en høyeffektsvarme som vanligvis varierer fra 200 ° C til 300 ° C.
- Hell avkokevæsken i en beholder.
- Utfør den andre avkoket ved å varme opp medisinske urter i drikkevann, med et volum akkurat nok til å nedsenke medisinoverflaten, til koking over sterk brann, og deretter oppvarming i 15-25 minutter over en mild brann.
- Hell avkokvæsken i samme beholder som i trinn 5.4.
- Soak og decoct 42 g Ginseng separat, med drikkevann 3 cm høyere enn medisinoverflaten, siden det er dyrt.
- Utfør det første avkoket av gjennomvåt ginseng ved å varme den over en sterk brann i 60 minutter.
Hell avkokvæsken i samme beholder som i trinn 5.4. - Utfør den andre avkok av Ginseng i drikkevann med et volum akkurat nok til å senke medisinoverflaten, ved oppvarming over en mild brann i 40 minutter. Hell avkokvæsken i samme beholder som i trinn 5.4.
MERK: Beholderne som brukes til avkok skal være kjemisk stabile, for eksempel gryteretter (den mest brukte i klinisk praksis), keramikk, glass og rustfritt stål for å unngå mulige kjemiske reaksjoner med de medisinske stoffene. All avkoksvæske oppnådd fra forskjellige trinn må settes i samme beholder. - Bland og filtrer avkokevæsken ved hjelp av tre lag gasbind festet ved munningen av en målekopp med gummibånd.
- Kok det filtrerte avkoket på en sterk brann i en gryte, bytt deretter til mild ild og hold den milde brannen til den når målkonsentrasjonen (et endelig volum på 84 ml med en endelig konsentrasjon på 1,5 g / ml).
- Tilbered 21 ml aliquots av konsentrert avkok i henhold til dosen som kreves for intragastrisk administrering i 1 uke, og oppbevar alikotene i kjøleskap ved -20 °C.
6. Gavage administrasjon i mus ved hjelp av en gavage enhet
- Plasser musen på overflaten av museburet eller en annen grovere overflate.
- Ta tak i musens hale med tommelen og pekefingeren på høyre hånd. Ta deretter tak i musens nakke med tommelen, pekefingeren og langfingeren på venstre hånd.
- Hold musehalen med de to andre fingrene på venstre hånd for å gjøre hodet, nakken og musens kropp i en rett linje.
MERK: Sørg for å holde musen avslappet under hele gripeprosessen. Hvis musen fortsetter å slite med å bevege seg, bør gripeprosessen utføres til musen er avslappet. - Hold gavage-enheten i høyre hånd og legg 200 μL avkoksformel for en mus med 20 g kroppsvekt (100 μL avkokformel / 10 g kroppsvekt på musen).
- Sett gavage nålen inn i munnen fra hjørnet og skyv tungen mot overkjeven av musen.
- Hold musekroppen i samme retning og skyv forsiktig nålen mot magen langs spiserøret til ca. 10 mm av nålen er igjen utenfor.
MERK: Det er en hul følelse når gavage nålen kommer inn i spiserøret. Lengden på gavage nålen inn i musen skal måles til toppen av brystbenet. Den totale lengden på gavage nålen er 60 mm (figur 3), derfor bør ca 50 mm av gavage nålen settes inn i kroppen av mus før avkok formelen injiseres i magen på musen. - Injiser avkokformelen i musens mage. Møte motstand eller væske som kommer ut av munnviken betyr feilplassering av gavage nålen, som må unngås. I tillegg må injeksjonshastigheten reduseres hvis avkokformelen er tykk.
- Slipp musen og observer dem i 10 minutter. Gavage er vellykket hvis ingen pusteavvik observeres og returnerer musen inn i buret (figur 4).
7. Behandlingsforløp
- For å utforske den terapeutiske effekten av Yiqi Jiedu-avkok, sett opp en kontrollgruppe og en Yiqi Jiedu-avkokgruppe. For mus i kontrollgruppen, administrer fysiologisk saltvann, en gang daglig i 28 dager. For mus i Yiqi Jiedu-avkokgruppen, administrer Yiqi Jiedu-avkoket en gang daglig i 28 dager.
8. Bivirkninger
- Følg nøye statusen til musene etter å ha blitt plassert tilbake i buret, inkludert vekttap og redusert mental status på grunn av manglende evne til mat å komme inn i magen.
- Mus vil oppleve pustevansker og kortpustethet på grunn av matforårsaket trakeal obstruksjon og vil hoste i et forsøk på å fjerne luftrøret. Hvis noen av disse symptomene blir observert under gavage, må du umiddelbart stoppe gavage og avlive musene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hemmende effekten av Yiqi Jiedu-avkok på veksten av osteosarkom in vivo ble bestemt i en intra-tibial xenograft osteosarkom musemodell, som ble fremstilt ved å injisere 143B osteosarkomcellene i tibia hos atymiske mus. Yiqi Jiedu-avkoket ble administrert til musene i Yiqi Jiedu-avkokgruppen ved avkok i 28 dager fra den andre dagen av 143B-injeksjonen. Fysiologisk saltvann ble gitt til musene i kontrollgruppen. Alle musene ble avlivet etter 28 dager. Resultatene viste at tumorvolumet i Yiqi Jiedu-avkokgruppen var signifikant redusert sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5).
Figur 1: Forbruksvarer for avkok. Den avkok-klare medisinen består av (A) Ginseng, (B) Hedyotis diffusa, (C) Barbed skullcap urt, (D) Gradert målebeger, (E) Gummibånd, (F) Gasbind, (G) Feste tre lag gasbind ved munningen av målebeger med gummibånd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fremstilling av avkokformel for tradisjonell kinesisk medisin. (A) De avkokklare medisinene, bortsett fra at ginseng blir bløtlagt i 30 minutter. (B) Ginseng blir gjennomvåt separat i 30 minutter. (C) Ginseng blir avkoket separat. (D) Filtrering avkok formel av tradisjonell kinesisk medisin. (E) Lagring av konsentrert avkok formel av tradisjonell kinesisk medisin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gavage forbruksvarer. Vanlig 1 ml sprøyte med original kanyle (venstre panel) og 1 ml sprøyte med original kanyle erstattet av en 12/55 mm albue gastrisk perfusjonskanyle for å stille inn et gastrisk kanyle (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prosedyre for administrering av gavage hos mus. (A) Mus på buroverflaten. (B) Musehale som gripes med en hånd. (VG Nett) Musen blir festet med en hånd. (E) Nålen som stikkes inn fra musemunnen. (F) Slutt på administrering av gavage. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hemmende effekt av avkok i osteosarkommusemodellen. (A) Osteosarkomprøver som samles inn fra kontrollgruppen og Yiqi Jiedu-avkokintervensjonsgruppen. Feilfelt står for standardavvik (n = 7) (B) Unpaired t test av tumorvolum mellom kontroll (Ctrl) gruppe og Yiqi Jiedu decoction intervensjonsgruppe. Yiqi Jiedu decoction intervensjon i 28 dager hemmer signifikant tumorvolumet (p<0.05). Feilfelt står for standardavvik (n = 7). (C) Kroppsvekt av mus i Yiqi Jiedu avkok gavage gruppen og kontrollgruppen gjennom hele eksperimentelle perioden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kliniske effekten av de foreskrevne urter i tradisjonell kinesisk medisin er i stor grad forbundet med administrert dose og doseringsform; Derfor er etablering av en standardisert avkokstrategi og en dyktig administrasjonsprosess nødvendig i klinisk praksis, samt for å forbedre påliteligheten av eksperimentelle resultater.
I denne studien ga vi først en detaljert strategi for standardisert avkok av kinesiske urter som brukes i klinisk praksis av tradisjonell kinesisk medisin, noe som letter veiledningen av mennesker til vitenskapelig avkok medisiner, forbedrer også praktisk talt kvaliteten på avkoksformelen og klinisk effekt av urtemedisiner; Derfor, når standardiseringen er oppnådd, vil den forbedre nøyaktigheten og konsistensen av urtemedisinsk effekt i klinisk praksis.
Gave-strategien har blitt mye brukt som en oral inntaksmetode i prekliniske studier og gjelder for ulike forsøksdyr, inkludert mus, rotter og kaniner, noe som gir noen fordeler, for eksempel enkel administrasjon, nøyaktig doseringskontroll og evne til å etterligne den kliniske ruten for legemiddeladministrasjon13. Dyrene vil imidlertid slite hvis de er immobilisert i feil stilling uten anestesi, noe som kan true forskernes helse og redusere påliteligheten av forsøkene. Derfor er etableringen av en standardisert gavage-metode viktig for å redusere disse mulighetene og for å unngå avkok som kommer inn i spiserøret ved en feil eller forårsaker spiserørskader, noe som igjen forårsaker dyredød og eksperimentell svikt.
Her valgte vi gavage-ruten for å levere avkokformelen til osteosarkom-modellmusene, da det tillot oss å måle doseringen nøyaktig og garantere konsekvent legemiddellevering gjennom hele forsøket. For å forberede avkokformelen beregnet vi først mengden avkok-klare medisiner til musen basert på et forhold på 20 ganger mengden som brukes til voksne med en kroppsvekt på 60 kg; gjennomvåt og avkokt 2x ved oppvarming til koking; filter konsentrert, og lagret avkoket i alikoter ved -20 °C. For å utføre gavage-administrasjonen, legg 200 μL av den konsentrerte avkoksformelen inn i en gavage-enhet, sett inn gavage-nålen i munnen, skyv forsiktig gavage-nålen mot magen og injiser avkokformelen i musens mage. Et av funnene våre er den signifikante hemmingen av tumorvekst observert i gruppen som mottar avkokformelen for Yiqi Jiedu-avkok via gavage. Vi observerte en åpenbar reduksjon i tumorvolum i Yiqi Jiedu-avkokgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Disse resultatene indikerer at gavage-strategien effektivt leverer de aktive komponentene i avkokformelen til målstedet, noe som resulterer i sterke antitumoreffekter. Videre evaluerte vi sikkerhetsprofilen til gavage-strategien ved å overvåke musens generelle tilstand og kroppsvekt gjennom hele eksperimentperioden. Vi fant ingen signifikante forskjeller i kroppsvektendringer eller tegn på toksisitet mellom Yiqi Jiedu decoction gavage gruppen og kontrollgruppen, noe som indikerer at gavage administrasjon av avkok formelen er godt tolerert og ikke forårsaker åpenbare bivirkninger.
Selv om gavage-strategien viste seg å være effektiv i å levere avkokformelen til forsøksdyrene, er det viktig å innse potensielle bivirkninger og visse begrensninger knyttet til denne administrasjonsmetoden. For å unngå mat-forårsaket luftrøret obstruksjon, nøye observere musen status under og etter gavage, for eksempel pustevansker, kortpustethet, og hoste. Når noen av dem vises, stopp umiddelbart gavage og utfør brystkompresjoner på et horisontalt hardt skrivebord; Videre er øyeblikkelig veterinærhjelp nødvendig for enhver alvorlig tilstand. Videre må vi være nøye med følgende begrensninger. For det første kan gavage indusere stress hos dyrene, noe som potensielt påvirker deres generelle fysiologi og respons på behandlingen. Vi tok imidlertid grep for å minimere stress ved å bruke en liten fôringsnål og håndtere musene forsiktig under gavage-prosedyren. Videre kan gavage bare utføres av en person som er spesielt opplært og kvalifisert for å sikre at en standardisert teknikk brukes for å unngå mulig skade på dyrene14. For det andre er den nøyaktige mekanismen ved hvilken de aktive komponentene i avkokformelen utøver sine antitumoreffekter, fortsatt uklar. Det er mulig at gavage-strategien kan endre farmakokinetikken og farmakodynamikken til urteforbindelsene, potensielt påvirke deres biotilgjengelighet og terapeutiske effekt. Fremtidige studier bør fokusere på å belyse de nøyaktige mekanismene som ligger til grunn for antitumoreffektene av avkokformelen levert gjennom gavage. Videre har studier rapportert at bruk av isoflurananestesi under langtidsgavage reduserer ufullstendig inntak av avkok og dyredød på grunn av ufaglært gavageteknikk15. I mellomtiden reduserer tilsetning av matolje i avkoket det gavage assosierte dyrestresset16.
Avslutningsvis ga vi den standardiserte avkoksprosessen av kinesiske urter og den dyktige gavage-strategien for mus. Disse anstrengelsene unngår ikke bare mulige esophageal skader og død av eksperimentelle mus, men unngår også overløp av narkotika, slik at hvert eksperimentelt dyr administrerer like mengde urtemedisiner, og forbedrer derfor nøyaktigheten og konsistensen av eksperimentelle resultater, også de terapeutiske effektene. Vår studie demonstrerer effekten og sikkerheten til gavage-strategien for administrasjon av den tradisjonelle kinesiske medisinavkokformelen i en osteosarkommusemodell. Disse resultatene fremhever potensialet for denne leveringsmetoden i behandlingen av osteosarkom og legger grunnlaget for videre forskning for å optimalisere gavage-strategien for tradisjonell kinesisk medisinadministrasjon. I tillegg bør fremtidige studier undersøke de nøyaktige virkningsmekanismene til de aktive komponentene i avkokformelen og utforske potensielle synergistiske effekter med andre behandlingsmodaliteter for å forbedre de terapeutiske resultatene hos osteosarkompasienter. Derfor kaster disse funnene lys over de potensielle fordelene og begrensningene ved denne administrasjonsmetoden og gir verdifull innsikt i anvendelsen i osteosarkombehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Det nåværende arbeidet støttes av tilskudd fra (1) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408), (2) National Key R &D Program of China (2020YFE0201600), (3) Shanghai Top Priority Research Center byggeprosjekt (2022ZZ01009), (4) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation, og (5) Forskningsprosjekter innenfor budsjettet til Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | Animal |
| Barbed skullcap herb | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 20230606 | Decoction-ready medicines |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) | RWD Life Science Co., Ltd. | C21014-12 | Component of gastric perfusion device |
| Gauze | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | LC45 | Decoction filter |
| Ginseng | Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 20220704-2 | Decoction-ready medicines |
| Hedyotis diffusa | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 2023071107 | Decoction-ready medicines |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| Rubber bands | Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. | XPJ | Fixing gauze on the measuring cup |
| Syringe (1 mL ) | Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. | SBM0040 | Component of gastric perfusion device |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
References
- Gao, S. Discussion on advantages and improvement of traditional Chinese medicine decoction. Chinese Community Physicians (Comprehensive Edition). (21), 12 (2005).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. , (2015).
- An, Y., et al. Interpretation on specification of traditional Chinese medicine decoction. Herald Med. 42 (11), 1648-1652 (2023).
- Chen, S., et al. Research strategies in standard decoction of medicinal slices. China J Chinese Materia Medica. 41 (8), 1367-1375 (2016).
- Luo, F. Effect of soaking traditional Chinese medicine before decoction on active components. Shanghai Yiyao. 40 (9), 63-64 (2019).
- Liu, F., Chen, M. On the standardization of decocting methods of modern decoction. Global Trad Chinese Med. 7 (5), 377-378 (2014).
- Li, X., et al. Influence of decocting times and instrument on the quality of decoction. J Trad Chinese Med. 50 (6), 550-552 (2009).
- Li, X., et al. Herbal decoctosome is a novel form of medicine. Sci China. Life Sci. 62 (3), 333-348 (2019).
- Lan, Y., Hu, Y., Huang, W., Tang, S. Reflections on PK - PD model based on animal experiments for study of Chinese medicine. Lishizen Med Materia Medica Res. 34 (2), 395-397 (2023).
- Li, Y., Bai, M., Song, Y., Guo, H., Miao, M. Research and reflection on standard decoction of Chinese materia medica. Chinese Trad Herbal Drugs. 49 (17), 3977-3980 (2018).
- Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/estimating-maximum-safe-starting-dose-initial-clinical-trials-therapeutics-adult-healthy-volunteers (2005).
- Chang, J., et al. Intratibial osteosarcoma cell injection to generate orthotopic osteosarcoma and lung metastasis mouse models. J Vis Exp. (176), 63072 (2021).
- He, C.
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Fronti Pedia. 2, 93 (2014).
- Jones, C. P., Boyd, K. L., Wallace, J. M. Evaluation of mice undergoing serial oral gavage while awake or anesthetized. J Am Assoc Lab Animal Sci. 55 (6), 805-810 (2016).
- Recena Aydos, L., et al. Nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in C57bl/6 models. Nutrients. 11 (12), 3067 (2019).
