Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.
Abstract
Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.
Introduction
Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist1. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen2. Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie3. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentriert 4,5,6. Die menschliche Netzhaut ist jedoch ein komplexes, vielschichtiges Gewebe, das aus verschiedenen Zelltypen besteht. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultur- und Tiermodellsysteme sind in der Regel nicht in der Lage, die normale räumlich-zeitliche Entwicklung und den Arzneimittelstoffwechsel der nativen menschlichen Netzhaut originalgetreu zu rekapitulieren 7,8.
In jüngster Zeit haben sich 3D-Kulturtechniken entwickelt, um gewebeähnliche Organe aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu erzeugen9,10. Retinale Organoide (ROs), die aus menschlichen PSCs in einem 3D-Suspensionskultursystem erzeugt werden, enthalten nicht nur sieben retinale Zelltypen, sondern weisen auch eine ausgeprägte geschichtete Struktur auf, die der menschlichen Netzhaut in vivo ähnelt 11,12,13. Humane PSC-abgeleitete ROs haben an Popularität und weit verbreiteter Verfügbarkeit gewonnen und sind derzeit die besten In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Netzhaut14,15. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forscher gezeigt, dass sich menschliche PSCs, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), mithilfe verschiedener Induktionsprotokolle in ROs differenzieren können. Diese Fortschritte bergen ein enormes Potenzial in der Retinopathie für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien 16,17,18.
Die Erzeugung von neuronaler Netzhaut (NR) aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) ist jedoch ein komplexer, umständlicher und zeitaufwändiger Prozess. Darüber hinaus können Variationen von Charge zu Charge bei Gewebeorganoiden zu einer geringeren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen 19,20. Zahlreiche intrinsische und extrinsische Faktoren können die Ausbeute an retinalen Organoiden (ROs) beeinflussen, wie z. B. die Anzahl oder Spezies der Ausgangszellen und die Verwendung von Transkriptionsfaktoren und niedermolekularen Verbindungen 21,22,23. Seit der Erzeugung der ersten menschlichen RO durch das Sasai-Labor11 wurden im Laufe der Jahre mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Einfachheit und Wirksamkeit des Induktionsprozesses zu verbessern 13,21,24,25. Leider wurde bis heute kein Goldstandardprotokoll für die Erzeugung von ROs in allen Labors festgelegt. In der Tat gibt es ein gewisses Maß an Diskrepanz bei ROs, das sich aus verschiedenen Induktionsmethoden ergibt, sowie große Unterschiede in der Expression von Netzhautmarkern und der Robustheit ihrer Struktur22,26. Diese Probleme können die Probenentnahme und die Interpretation der Studienergebnisse erheblich erschweren. Daher ist ein konsolidierteres und robusteres Differenzierungsprotokoll erforderlich, um die Effizienz bei minimaler Heterogenität der RO-Erzeugung zu maximieren.
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll, das auf einer Kombination von Kuwahara et al.12 und Döpper et al.27 mit detaillierten Anweisungen basiert. Die neue Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit der Organoidvesikulation und -fusion signifikant und erhöht die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NR. Diese Entwicklung ist vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und Zelltherapieanwendungen für Netzhauterkrankungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf15. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
Riferimenti
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