Summary
Vi presenterer en ny tilnærming for to-foton mikroskopi av tumortilførselen av fluorescerende merkede jernoksid nanopartikler til glioblastom i en musemodell.
Abstract
Levering av intravenøst administrert kreftbehandling til hjernesvulster er begrenset av blod-hjernebarrieren. En metode for å direkte avbilde akkumulering og distribusjon av makromolekyler i hjernesvulster in vivo vil i stor grad forbedre vår evne til å forstå og optimalisere legemiddellevering i prekliniske modeller. Denne protokollen beskriver en metode for sanntids in vivo-sporing av intravenøst administrerte fluorescerende merkede nanopartikler med to-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) i en musemodell av glioblastom (GBM).
Protokollen inneholder en flertrinnsbeskrivelse av prosedyren, inkludert anestesi og analgesi av forsøksdyr, skape et kranialvindu, GBM-celleimplantasjon, plassere en hodestang, gjennomføre 2P-IVM-studier og postkirurgisk behandling for langsiktige oppfølgingsstudier. Vi viser representative 2P-IVM-bildebehandlingsøkter og bildeanalyse, undersøker fordelene og ulempene ved denne teknologien, og diskuterer potensielle applikasjoner.
Denne metoden kan enkelt modifiseres og tilpasses ulike forskningsspørsmål innen in vivo preklinisk hjerneavbildning.
Introduction
To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) er en fluorescensavbildningsteknikk som tillater visualisering av levende vev1.
Først utviklet på 1990-tallet, har 2P-IVM blitt brukt til in vivo-analyse av retina2, nyre3, tynntarm4, cochlea5, hjerte6, luftrør7 og hjernen i forskjellige prekliniske modeller 8,9. Innen nevrovitenskap har 2P-IVM fått betydning som en teknikk for sanntidsavbildning av den sunne hjernen i våkne dyr10, samt å studere sykdommer i nervesystemet som Alzheimers11, Parkinsons12 og glioblastom (GBM) 13,14,15,16.
2P-IVM tilbyr en elegant løsning for å studere tumormikromiljøet under utviklingen av GBM. Mens noen tidligere studier fokuserte på in vitro17 og ex vivo modeller18, implementerte andre ortotopisk19 og xenotropisk20 in vivo modeller for å undersøke GBM. Madden et al. utførte innfødt avbildning av CNS-1 rotte glioma cellelinje i en musemodell13. Ved hjelp av en ortotopisk GL261-DsRed murinmodell utførte Ricard et al. en intravenøs administrering av en fluorofor for å forbedre blodkarene i tumorområdet i 2P-IVM14.
Her bruker vi 2P-IVM for sporing av tumortilførsel av fluorescerende merkede jernoksidnanopartikler (NP) i en ortotopisk musemodell av GBM. Ved hjelp av et kranialvindu tillater denne metoden oss å studere sanntids spatiotemporal fordeling av NP i hjernen i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyren beskrevet i denne protokollen er i samsvar med kravene fra Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Cellekultur
- Forberedelse av hette
- Vask hendene, bruk hansker og labfrakk. Slå på det biologiske sikkerhetsskapet og sett rammenivået til en passende åpningshøyde. La hetten rense i 3-5 min. Spray hetteområdet med 70% etanol og tørk det ned med silkepapir.
- Spray alle reagenser med 70% etanol og tørk av med silkepapir. Flytt reagensene inn i hetten. Ikke legg noen gjenstander på grillen. Hvis det oppstår søl i hetten, dekk den med kluter, spray den med 70% etanol og tørk igjen.
- Etter eksperimentet, lukk lokkene på hvert element forsiktig, tørk av alle materialer, fjern eventuelle gjenstander fra hetten og overfør dem til deres opprinnelige plassering. Spray 70% etanol i hetten og tørk den ned. Lukk rammen og slå av det biologiske sikkerhetsskapet.
- Forberedelse av et vekstmedium
- Tilsett 50 ml 100% føtal bovint serum (FBS) til 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Tilsett 5 ml av antibiotika-antimykotisk løsning (100x).
- Før alle reagensene gjennom en steril 500 ml filtreringsflaske (0,22 μm filter).
- Tining av kryopreserverte celler
- I en laminær avtrekkshette tilsettes 20 ml av vekstmediet til en T75-kolbe. Merk kolben med navn på celler, dato og passasjenummer på kolben. I denne studien ble adherente C6 gliomceller brukt.
- Tine cellene raskt i et vannbad på 37 °C. Ikke virvel cellene. Tine og bruk cellene umiddelbart.
- Overfør de tinte cellene til T75-kolben ved hjelp av en 1 ml pipettespiss. Vær forsiktig så du ikke introduserer bobler under overføringsprosessen, og unngå middels rester i kolbens hals. Dette kan øke risikoen for mulig forurensning.
- Endre mediet
- Bytt medium dagen etter tining for å fjerne gjenværende trypsin eller dimetylsulfoksid (DMSO) (trinn 1.6). Etterpå bytter du mediet minst to ganger per uke eller mer, avhengig av cellekonfluensnivå. Mediet må endres en dag etter passasje for å eliminere trypsin.
- For å bytte medium, slå på aspirasjonsapparatet, fest aspirasjonsglasspipetten og aspirer alt mediet.
- Tilsett 20 ml av vekstmediet (trinn 1,2).
- Passerer cellene
- Legg hetten med elementene som trengs i løpet av eksperimentet.
- Bruk en aspirasjonsglasspipett og aspirer bort alle medier, og sørg for at glasspipetten er på den ikke-cellulære siden av kolben. For dette trinnet, plasser T75-kolben vertikalt.
- Tilsett ~ 10 ml romtemperatur (RT) fosfatbufret saltvann (PBS, Ca ++ og Mg ++ gratis ) eller Hanks 'balansert saltløsning (HBSS, Ca ++ og Mg ++ gratis) på ikke-cellesiden. Vask cellene kort med PBS ved å plassere T75-kolben horisontalt med cellesiden vendt nedover.
- Plasser kolben umiddelbart vertikalt og aspirer PBS/HBSS. Gjenta denne vaskingen og aspirasjonen 3 ganger.
- Tilsett 2 ml trypsin (rekombinant eller animalsk-avledet) på cellesiden (T75 kolbe horisontalt, cellesiden vendt ned). Inkuber i en standard vevskulturinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 4 minutter. Triturer den én gang etter 2 minutter med en 5 ml pipette.
- Etter 4 min total inkubasjon, overfør løsningen til et 15 ml konisk rør. Tilsett 8 ml av vekstløsningen til konisk rør (2 ml trypsiniserte celler + 8 ml medium = 10 ml totalt).
- Bruk et annet tomt 15 ml konisk rør med et filter og overfør cellene via en 25 ml pipette for å oppnå individuelle celler.
- Overfør 1/10 (1 ml) av oppløsningen (celle + media + Tryp-LE) til en T75-kolbe med 20 ml medier. Alternativt kan du telle cellene (trinn 1.7). Endre mediet neste dag for å ha en medieløsning som ikke er trypsin.
- Fryser mediet og cellene
- Tine 100 % FBS i et kjøleskap på 4 °C. Ikke bruk vannbad eller varme, da dette kan skade proteinene i FBS.
- For å klargjøre 50 ml frysemedier, bland 45 ml DMEM, 5 ml FBS og 5 ml DMSO. Aliquot det til 1-2 ml beholdere for å forhindre intermitterende tining og proteinskade. Oppbevar dem i -20 ° eller -80 ° C fryser.
- For de resterende 9 ml oppløsning (trinn 1,5), tilsett 1 ml medium for å nå 10 ml totalt. Sentrifuge ved 300 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml frysemedium (se ovenfor). Legg cellene i en frysebeholder i -80 °C fryser. Flytt cellene til væske N2 for langvarig lagring etter 1 eller 2 dager.
- Telle cellene
- For de resterende 9 ml (trinn 1,5) tilsettes 1 ml medier for å nå 10 ml totalt. Sentrifuge ved 300 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspender i 4 ml HBSS. Resuspender 10 μL celler i 80 μL HBSS + 10 μL på 0,4% Trypan Blue, fortynningsfaktor = 10.
- Ta 17 μL av løsningen og telle fire 4 x 4 firkanter i et hemocytometer. Gjennomsnitt teller for de fire 4 x 4 kvadratene og multipliser med 104x fortynningsfaktor for å få celler/ml.
2. Kirurgi
MERK: Det anbefales å utføre operasjonen av to forskere, hvor en person er ansvarlig for å forberede cellene, blande dental sement, og generelt bistå i prosedyren, mens den andre personen fokuserer på gjenværende steril. Å ha en annen manipulator for å bistå med den kirurgiske prosedyren reduserer sannsynligheten for forurensning betydelig. Å følge beste kirurgiske praksis vil redusere sjansene for postoperative komplikasjoner. Figur 1A gir en oversikt over komponentene i kranialvinduet.
- Generelle forberedelser
- Bekreft at prosedyren er godkjent av de lokale dyrevelferdsinstitusjonens retningslinjer før du starter.
MERK: Denne studien brukte 5 måneder gamle kvinnelige NSG-mus (NOD. Cg-prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - Før operasjonen, autoklav alle kirurgiske instrumenter og sørg for at alle nødvendige forsyninger er tilgjengelige. Skriv ut anestesi og kirurgi poster.
- Sørg for at dyrene ved ankomst har minst 1 ukes akklimatisering til dyreholdsrommet for å redusere ytterligere postoperative plager.
- På operasjonsdagen må du sørge for at alle enheter (mikroskop, varmepute, sterilisator, bor, vakuum, etc.) er klare til bruk. Bekreft at anestesimaskinen inneholder nok isofluran og fyll på om nødvendig. For nye brukere kan kranialvinduprosedyren ta opptil 2 timer per dyr; Derfor er det viktig å ha nok isofluran .
- Plasser glassvinduene og hodestengene i alkohol og lag en beholder med saltvann. Dette vil sikre en jevn arbeidsflyt uten store brudd på steriliteten og holde tiden under anestesi for hvert dyr så kort som mulig.
- Åpne alt kirurgisk materiale på en steril overflate på arbeidsstasjonen. For eksempel kan innsiden av en steril gasbindemballasje brukes til dette formålet. Bruk bare tips-teknikken. Når du ikke bruker kirurgiske instrumenter, plasser spissene på en steril overflate, for eksempel innsiden av emballasjen av sterilt gasbind.
- Når du utfører flere operasjoner, plasser alle kirurgiske instrumenter i sterilisatoren mellom operasjoner for å desinfisere dem. Når du utfører operasjoner på mer enn 5 dyr, bruk et nytt sett med autoklaverte instrumenter. Bytt ut borespissen når den blir sløv for en ny for å unngå vevstraumer.
- Bekreft at prosedyren er godkjent av de lokale dyrevelferdsinstitusjonens retningslinjer før du starter.
- Anestesi og forberedelser til kirurgi
MERK: Anestesioppsettet er identisk for operasjonen, så vel som for avbildning.- Bedøv musen ved hjelp av isofluran (3%-5% for induksjon) i et bedøvelseskammer. Etter å ha sikret tilstrekkelig bedøvelsesdybde ved å teste pedaluttaksrefleksen (fotputeklemme på begge bakføttene), overfør dyret til en forberedelsesarbeidsstasjon. Opprettholde anestesi over en nesekegle (1% -2%). Her bruker du en øyesalve for å forhindre hornhinneskader. Kontroller regelmessig tap av reflekser under operasjonen ved å sjekke poterefleksen.
- Hvis det kreves identifikasjon av dyret, bruk et ørestanseverktøy eller saks for å markere ørene eller bruk en markør for å markere halen.
- Fjern pelsen som dekker skallen mellom ørene og øynene med en hårfjerningskrem. La kremen stå så lenge som angitt (30-60 s) av produsenten for å unngå hudirritasjon. Pass på at kremen kommer i kontakt med hårrøttene ved å påføre den mot retningen av hårvekst. Unngå at hårfjerningskremen kommer i kontakt med øynene. Fjern krem og hårrester ved å rengjøre området med saltvann. Alternativt kan du bruke klippere.
- For å unngå intra- og postoperativ smerte, infeksjon eller hevelse, administrer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs), opioider, antiinflammatoriske midler og antibiotika. Administrer karprofen (5-20 mg/kg, subkutan [SQ]), buprenorfin - vedvarende frisetting (1 mg/kg SQ), cefazolin (20 mg/kg SQ) og deksametason (0,2 mg/kg SQ) før kirurgi. Administrer ca. 0,3 ml 0,9% saltvann SQ for å unngå dehydrering.
- Følgende skrubbe området ved vekselvis swabbing povidon-jod og isopropylalkohol tre ganger i sirkulære bevegelser fra midten av skallen til periferien.
- Prosedyre for kraniotomi
- Overfør dyret til operasjonsbordet og legg det i ventral liggetid på en varmepute (~37 °C) for å sikre isotermiske forhold under prosedyren. Hypotermi hos gnagere reduserer overlevelsesraten betydelig og forlenger den postoperative gjenopprettingsfasen.
- Plasser hodet i den stereotaktiske rammen ved å plassere ørestengene og fortennstengene. For ørestengene, finn den zygomatiske buen og sett stolpene bak buene. Start med å sikre den kontralaterale stangen med den dominerende hånden (f.eks. fest venstre stang med høyre hånd hvis du er høyrehendt) og fest deretter motsatt side. Juster posisjonene til øre- og fortennstengene ved å vri skruene om nødvendig.
- Påfør øyesalve om nødvendig, og bruk et stykke aluminiumsfolie for å dekke øynene. Dette vil forhindre skade forårsaket av det sterke mikroskoplyset og UV-lyset som brukes til å kurere cyanoakrylat limet senere (trinn 2.5).
- Før snitt, sjekk igjen for tåklemmerefleks; Juster om nødvendig anestesi tilsvarende. Koble dyret til anestesiovervåkingsenheten ved å plassere sensoren på bakpoten. Måling av hjertefrekvens og oksygenkonsentrasjon i blodet vil bidra til å redusere dødeligheten og forbedre postoperativ restitusjon. I tillegg får du respirasjonsfrekvensen ved å visuelt inspisere brystbevegelsen.
- Dekk dyrets kropp med et drap for å unngå hypotermi og forurensning. Utfør en siste povidon-jodpinne før du starter operasjonen.
- Ta på hansker og en ren laboratoriefrakk.
MERK: Bruk av sterile hansker oppfordres på grunn av prosedyrens invasivitet og for å redusere risikoen for postoperativ infeksjon og betennelse som resulterer i sykelighet og tap av bildekvalitet i 2P-IVM (avsnitt 5). - Løft huden på skallen og lag et snitt ved å holde saksen mellom høyre øye og øre og kutte mot venstre side av skallen etter snittmerkene. Fjern den resulterende runde hudklaffen.
MERK: Avhengig av regionen av interesse i hjernen og vindusstørrelsen, kan snittstedet og diameteren variere. Størrelsen på snittet må være større enn diameteren på hodet for å imøtekomme plass til montering (trinn 2.5). Om nødvendig kan huden rundt snittet forsiktig dissekeres for å skape mer plass. - Fjern periosteum ved å skrape forsiktig på skalleoverflaten med et skalpellblad eller en mikrocurrette. Vær forsiktig når du fjerner periosteum rundt kranialsuturene, siden disse områdene er skjøre og mer utsatt for blødning. Bruk saltvann og vakuum for å holde operasjonsområdet rent for rusk. Skrap periosteum for å sikre bedre overholdelse av cyanoakrylat lim og dental sement (trinn 2.5)
- Identifiser regionen i hjernen for å utføre celleinjeksjonen. For dette, bruk et atlas over de stereotaktiske koordinatene til musehjernen. I henhold til hjernekoordinatene, merk posisjonen til kranialvinduet ved å bruke en biopsistans i samme diameter som vinduet, en kirurgisk penn eller en autoklavblyant.
- Hold boret i den dominerende hånden og ethvert annet instrument (sprøyte, tang) i den ikke-dominerende hånden. Unngå langvarig boring på samme sted. Boret bør brukes i utbrudd for å unngå overoppheting. Under disse pausene, påfør kald saltvann på calvarium for å holde den kirurgiske visningen ren og for å forhindre overoppheting. Bruk sensorisk tilbakemelding fra borespissen for å oppdage når skallen har blitt perforert helt.
- Bruk kaldt saltvann, i kombinasjon med vakuum, for å rengjøre skalleoverflaten. Ikke bruk gasbind eller en applikator med bomullstupp etter åpning av calvarium, siden rester av bomullstråder kan føre til en reaksjon på fremmedlegemer når hjernevinduet er forseglet.
- Under boring må du sørge for at banen og diameteren har samme størrelse som glassdekselet. Gjør dette ved å plassere glassdekselet på toppen av skallen og bekrefte at glassdekselet passer nøyaktig inn i kranialvinduet.
- Når det er mulig å trykke ned skalleklaffen ved å trykke forsiktig på den, bruk tang for å fjerne fragmentet forsiktig fra operasjonsfeltet (figur 1B, venstre). Hvis det ennå ikke er mulig å trykke ned skallen, fortsett å bore i områdene i kranialvinduet som fortsatt er koblet til resten av skallen og revurdere.
- Hvis mindre blødning oppstår, bruk en hemostatisk svamp kombinert med lett trykk eller alternativt, iskald saltvann, for å redusere blodtap.
- Celleimplantasjon
- Forbered og tell cellene som skal implanteres som beskrevet i (trinn 1.7). Forsikre deg om at cellenummeret er 200 000 celler / μL.
MERK: Det anbefales å suspendere cellene i en membranmatrise som størkner ved RT. Dette vil forbedre suksessraten for implanterte celler i hjerneparenkymet. - Overfør cellene i en beholder med is til operasjonsrommet. Bruk en gasstett mikroliter sprøyte. Før aspirasjon, hold sprøyten på is for å unngå temperaturforskjeller.
- Etter å ha aspirert 1 μL, plasser sprøyten inne i den stereotaktiske rammen.
MERK: En automatisert stereotaktisk koordinatenhet som viser posisjonene i X-, Y- og Z-aksene, kan brukes til å spare tid. Det er også mulig å manuelt beregne posisjonene basert på lambda. Det anbefales ikke å injisere mer enn 1,5 μl. Dette vil sikre at det injiserte området ikke overfylles, forårsaker mislykket implantasjon, vekst utenfor hjerneparenkymet eller metastaser. - Utfør implantasjon i V2MM-regionen (visuell cortex 2, mediomedial del) av hjernen, som tilsvarer omtrent mediale til laterale (M-L): -1,2 til -1,6 mm, og dorsale til ventrale (D-V): -2,6 til -3,5 mm koordinater.
- For to-foton avbildning (trinn 4.6), implanter cellene i de overfladiske hjerneområdene slik at tumormassen kan visualiseres gjennom kranialvinduet senere. Injiser 0,5 μL (100 000 celler) foran til bakre (A-P): 0,8 mm dybde. Beveg nålen sakte, trinnvis, når du kommer inn i hjernen, og vent i 30 sekunder etter injeksjonen (figur 1B, midtre kolonne).
- Bruk samme tilnærming når du trekker nålen tilbake og går ut av hjernevevet. Unngå å injisere nær ventriklene siden cerebrospinalvæsken kan oppmuntre metastase i sentrale og perifere nervesystemet.
- Forbered og tell cellene som skal implanteres som beskrevet i (trinn 1.7). Forsikre deg om at cellenummeret er 200 000 celler / μL.
- Lukking av kranialvinduet
- Flytt hodestangen og glassdekselet fra alkohol til en saltoppløsning. Bruk en vakuumspiss eller tang for å navigere disse komponentene til operasjonsstedet.
- Plasser glassdekselet inne i kranialvinduet og plasser en liten mengde cyanoakrylat lim mellom skallen og glassdekselet. UV-aktivert cyanoakrylat lim reduserer herdetiden og unngår utilsiktet forskyvning. Hvis noe lim søler på glassdekselet, fjern det med en bomullsspissapplikator eller ved å skrape det forsiktig av med den stumpe siden av en skalpell før det herdes helt.
FORSIKTIG: UV-lys er skadelig for øyne og hud. Unngå øye- og hudkontakt mens du herder limet. - Etter å ha festet glassdekselet i kranialvinduet, bruk hodestangen. Bland to-komponent dental sement, plasser hodestangen, og påfør sementen til det omkringliggende området, og sørg for kontakt mellom skallen og hodestangen. Rengjør forsiktig overflødig sement med spissen av en sprøyte, en skalpell eller en borespiss.
MERK: Dental sement stivner veldig raskt, så det anbefales å bruke det i tide. - Etter å ha forseglet kranialvinduet, identifiser om noen hodeskalleområder mellom tannsement og hud fortsatt er utsatt. Hvis det er tilfelle, bruk kirurgisk lim for å dekke opp skallen ved å lukke huden. Alternativt kan du utføre en enkelt sutur med et absorberbart suturmateriale.
3. Postoperativ gjenoppretting og tumorvekst
- Bedring
- Overvåk dyret på en oppvarmet pute i et gjenopprettingsbur til det gjenvinner full bevissthet. Hus dyrene separat etter operasjonen for å redusere risikoen for skade.
- Administrer en restitusjonsdiett, for eksempel kommersielt tilgjengelige vanngeler med elektrolytter eller sukkerarter. Alternativt kan du levere fuktet standard lab chow for å sikre enkel ernæring og unngå dehydrering og hypoglykemi.
- Overvåking
- Ved utvinning, overvåke dyret daglig for tegn på smerte, nød eller infeksjon. Administrer om nødvendig smertestillende midler, antiinflammatoriske legemidler eller antibiotika. Hvis et dyr når studiesluttpunktet, avlive det humant. Etter den siste bildebehandlingen, avlive musen ved karbondioksidkvelning, etterfulgt av cervikal dislokasjon.
MERK: Eksempler på tidlig eutanasikriterier inkluderer, men er ikke begrenset til, signifikant vekttap (>20%), nevrologiske lidelser, dyspné, overdreven blødning under operasjonen eller uttalt stereotyp oppførsel. Inspiser kranialvinduet og rengjør det med saltvann eller alkohol når det er nødvendig. - For å spore tumorvekst og planlegge avbildningstidspunktene, utfør helkroppsbioluminescensavbildning (BLI). For dette, injiser 150 mg/kg D-luciferin intraperitonealt og avbilde dyret etter 5-15 minutter.
- Ved utvinning, overvåke dyret daglig for tegn på smerte, nød eller infeksjon. Administrer om nødvendig smertestillende midler, antiinflammatoriske legemidler eller antibiotika. Hvis et dyr når studiesluttpunktet, avlive det humant. Etter den siste bildebehandlingen, avlive musen ved karbondioksidkvelning, etterfulgt av cervikal dislokasjon.
4. Nanopartikkel syntese
- Partikkel forberedelse
- Tilsett 11,17 ml ferumoksytol (6 mmol Fe totalt) til en oppløsning inneholdende 50 ml 5 M NaOH, 20 ml avionisert vann (DI-vann) og 20 ml epiklorhydrin. Observer fasesegregering på dette stadiet. Inkuber blandingen ved RT under forsiktig risting i 24 timer.
- Etter 24 timer blir løsningen jevn. Fjern overflødig epiklorhydrin ved hjelp av dialyseslange (12.000-14.000 Da cutoff) mot vann i 3 dager.
- Etter dialyse, overfør den gjenværende oppløsningen i slangen til en glassflaske (totalvolum ~110 ml). Tilsett 30 ml ammoniakkhydroksid, og rør blandingen ved 37 °C i 18-20 timer.
- Etter omrøring, gjenta dialyse mot vann i 3 dager. Overfør oppløsningen som er igjen i dialyseslangen til en ny glassflaske med et totalvolum ~110 ml.
- Fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugering
- Ta ut 27,5 ml aminfunksjonaliserte partikler for FITC-konjugering. Konsentrer partiklene med et 10 kDa ultrasentrifugeringsfilter og vask med en pH 9 (Na2CO3 / NaHCO3) buffer ved 5752 x g ved 25 ° C i 10 minutter.
- Tilsett 4 ml av oppløsningen i filteret og ultrasentrifuge røret ved 5752 x g ved 25 °C i 10 minutter. Kast filtratet og fyll filteret på nytt med buffer for en andre vaskerunde med samme protokoll.
- Kast filtratet og samle oppløsningen i filteret ved hjelp av en pipette. Estimere molarkonsentrasjonen av partikkelen ved massekonsentrasjonen av Ferumoxytol, forutsatt at diameteren av hver partikkel er 5 nm.
- Oppløs FITC i vannfritt dimetylsulfoksid (DMSO) ved 10 mg/ml. Tilsett sakte 1,4 ml DMSO-oppløst FITC i den konsentrerte aminfunksjonaliserte partikkelen. Molforholdet mellom FITC: partikkel er 20: 1. Deretter inkuberes oppløsningen ved 4 °C i 8 timer i mørket.
- Slukk reaksjonen ved å legge til overflødig NH3. H2O (den endelige konsentrasjonen av NH3. H2O er 50 mM), og la deretter oppløsningen holde seg ved 4 °C i mørket i 2 timer. Vask bort overflødig FITC med Na2CO3 / NaHCO3 (pH 9) buffer gjennom et 10 kDa filter ved 5752 x g ved 25 ° C i 10 minutter. Den endelige pH i oppløsningen justeres til 7,4 ved bruk av HCl vandig løsning.
5. 2P-IVM
MERK: For 2P-IVM-øktene ble det brukt et Prairie Ultima IV-mikroskop med et tilpasset stadium (figur 2 og tilleggskodingsfil 1) som gjør det mulig å justere kranialvinduets posisjon horisontalt og vertikalt. Fiji-programvaren ble brukt til etterbehandling og bildeanalyse. På denne måten kan laserstrålen justeres for å treffe glasset i en 90 ° vinkel, noe som reduserer artefakter og forbedrer bildekvaliteten.
- Avbildningsøkt
- Slå på Ti-Sapphire-laseren. Slå på hovedsystembryteren og Prairie View-programvaren.
- Bedøv dyret, som beskrevet ovenfor (trinn 2.2). Utfør bildebehandlingsøkter i opptil 2 timer per dyr. Hold bildetiden til et minimum for å redusere risikoen for anestesikomplikasjoner og tilhørende sykelighet eller dødelighet.
- Immobiliser musen under to-foton mikroskopet ved hjelp av et tilpasset stadium (figur 1B, høyre kolonne). Plasser dyret i utsatt stilling på en oppvarmet pute designet for gnagerkirurgi og fest den lett med tape mens du tar hensyn til ikke å begrense thoraxen. Plasser en dråpe vann på kranialvinduet og juster fokuset.
- Oppnå hjertefrekvens og oksygenering i blodet for å overvåke dyrenes vitale parametere. Plasser sensoren på bakpoten og hold overvåkingsenheten utenfor to-foton bildekammeret.
- Når dyret er på mikroskopstadiet, juster hodeposisjonen. Bruk kikkerten og bredfeltfluorescerende belysning til å stille inn det røde fluorescerende proteinfilteret (RFP) og finne ønsket synsfelt (figur 1B, høyre kolonne).
- Når prøveorientering og synsfelt er bestemt, bytter du mikroskopet fra bredfeltmodus til lysskanningsmikroskopimodus (LSM).
- Forsikre deg om at Ti-Safir-laseren er moduslåst ved 920 nm, og at alle skodder er åpne. Ta GaAsP fotomultiplikatorrørdetektorer (PMT) spenninger opp til 500-600 V. Bruk to PMT-er med filtersett med båndpass ved 595/50 (RFP) og 525/50.
- Trykk på Live Image og modifiser pockelcellen sakte for å øke lasereffekten ved prøven til et bilde er synlig.
- Når et klart bilde er oppnådd, bruk programvaren og det motoriserte trinnet for å angi toppen og bunnen av en bildestabel innenfor ønsket prøveområde. Vær oppmerksom på trinnstørrelsen og ta hensyn til at Z-aksen justerer objektivets dybde.
- Med økende dybde blir bildene mørkere. Øk pockels / PMT-gevinsten sakte for å holde bildet lyst. Vær forsiktig så du ikke bruker for mye strøm, da det kan føre til fototoksisitet og vevskader.
- Angi en lagringsbane og start Z-serien. Den vil automatisk krysse til start- og sluttposisjonene ved hjelp av de angitte pockel/PMT-innstillingene. Når stabelen er fullført, kan du bruke avspillingen til å se over stabelen for kvalitet. Når anskaffelsen av de nødvendige bildene er fullført, slår du av Ti-Safir-laseren.
- Flytt dyret til et oppvåkningsbur, som beskrevet ovenfor (trinn 3.1).
- Avslutt Prairie-visningen og sørg for at alle dataene er lagret / overført. Slå av datamaskinen og slå av all maskinvare.
- Etterbehandling med FIJI
MERK: Fiji er en åpen kildekode-programvare fokusert på biologisk bildeanalyse21.- Last ned FIJI med hensyn til operativsystemet. Pakk ut mappeinnholdet og kjør .exe filen.
- Dra konkurransefilen som er samlet inn, fra tofotonavbildningen til dialogboksen. Del kanalene i forskjellige bildebokser. Dette vil skape to forskjellige bilder med forskjellige kanaler, ett som inneholder cellesignalet og det andre partikkelsignalet.
- Kopier et av bildene og klikk på Fil > New > Internal Clipboard for å lage et annet bilde. Gi nytt navn til ett av bildene som Kilde og det andre som Kopier.
- Bruk kopieringsbildet og klikk på Prosess > Forbedre kontrasten i dialogboksen. Klikk Normaliser og OK og deretter Behandle > jevn. Dette bildet brukes til å lage en maske og ikke til analyse. Klikk på Bilde > Juster terskelen > i dialogboksen. Bruk glideskalaen og metoden som passer for å trekke ut, og klikk deretter Bruk.
- Bruk Process > Binary > Erode til å erodere enkeltpiksler i bakgrunnen, og klikk på Process > Binary > Dilate for å legge til bildepunkter i bildet igjen.
- Klikk på Prosess > bildekalkulator i dialogboksen, velg kildebildet som det første og velg det andre bildet som Kopier. Bruk AND til å opprette skjæringspunktet mellom begge bildene. Gjenta det samme trinnet for det andre kanalbildet.
- For signalanalyse utenfor det vaskulære området, åpne et uendret kopiert bilde og slett det vaskulære området av signalet med Freehand ROI-verktøyet.
- Angi ønskede parametere ved å gå til Analyser > Angi målinger. Kontroller at det er merket av for Areal, Integrert tetthet og Gjennomsnittlig grå verdi .
- Analyser nå ved å analysere > måle. Et vindu med målingene vil dukke opp. Kopier dataene til et regneark.
- Velg nå et lite område av bildet som ikke har fluorescens. Dette vil være bakgrunnen.
- Klikk Analyser > mål for den regionen. Kopier data til et regneark.
- Lagre resultatbildet som Fil > Lagre som > Analyser filtype for nye målinger eller publiseringsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her utførte vi kranialvinduskirurgi og enpoderte C6-celler i en NSG-musemodell av GBM (n = 5). En riktig forsegling mellom alle komponentene som er involvert i opprettelsen av vinduet (figur 1A) vil sikre vinduenes holdbarhet for langtidsavbildning og i tillegg redusere sykelighet. Ved å bruke scenen tilpasset in vivo 2P-IVM (figur 2), kunne vi avbilde dyr under anestesi i opptil 2 timer uten store bevegelsesartefakter. Omtrent 10 minutter etter intravenøs påføring av nanopartiklene i GBM-bærende mus, viser 2P-IVM det grønne, fluorescerende signalet fra kar i tumorområdet, i samsvar med intravaskulær lokalisering av FITC-merkede nanopartikler. Bare en liten mengde grøntfluorescerende signal er notert utenfor blodkarene, noe som indikerer begynnelsen ekstravasasjon av NP (figur 3A). Det ses en økning i FITC-signalet fra det ekstravaskulære rommet, noe som er i tråd med avansert ekstravasasjon (figur 3B).
Figur 1. Plassering av kraniale vinduer, kraniotomi, implantasjon og avbildning. (A) Tverrsnitt av den anatomiske plasseringen av et kranialvindu. Siden hodestangen er metallfri, er det mulig å utføre magnetisk resonansavbildning eller magnetisk partikkelavbildning i tillegg til to-foton intravital mikroskopi. (B) Oversikt (øvre rad) og en detaljert visning (nedre rad) av kraniotomi (venstre), celleimplantasjon (midten) og 2-foton intravital mikroskopi (høyre). Ved åpning av skallen oppstår overfladisk blødning (venstre) og reabsorberes raskt (midten). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Dataassistert design (CAD) av scenen. CAD av scenen som brukes til in vivo 2-foton intravital mikroskopi, inkludert en bitestang, hodestangstabilisering og skruer for høyde- og vinkeljusteringer. 3D CAD-filen finner du i Supplemental Coding File 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. In vivo 2-foton intravital mikroskopi bilder. Bilder oppnådd (A) 10 min og (B) 24 timer etter intravenøs nanopartikkeladministrasjon. Mens GBM-cellene sender ut fluorescerende signaler i det røde spekteret (venstre), visualiseres nanopartiklene i hjernevevet i grønt (høyre). # indikerer ekstravaserte NP, * indikerer et blodkar. Kun et begrenset antall partikler har gjennomgått ekstravasasjon og er synlige i tumorcellenes nærhet 10 min etter NP-administrasjon. En overflod av partikler er synlig i området av GBM-celler, noe som tyder på ekstravasasjon 24 timer etter NP-administrasjon. Nanopartiklene består av fluoresceinisotiocyanat (FITC) og jernoksid nanopartikler (Ferumoxytol). Skalastengene representerer 100 μm. Forkortelser: 2P-IVM: 2-foton intravital mikroskopi, RFP: rødt fluorescerende protein, GBM: glioblastom, FITC: fluoresceinisotiocyanat, NP: nanopartikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende kodefil 1: 3D CAD-fil av trinnet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en metode for sanntids in vivo NP-sporing ved bruk av 2P-IVM gjennom et kranialvindu for å evaluere tumortilførselen av fluorescerende merket jernoksid-NP. Den kirurgiske teknikken for denne prosedyren krever en stødig hånd og avanserte eksperimentelle kirurgiske ferdigheter. Det anbefales å øve på å bruke eller fantomer før du går videre til levende dyreopplevelse. Som et alternativ implementerte Hoeferlin et al. en robotbor for å redusere termisk skade, minimere kirurgisk teknikkvariabilitet og standardisere kirurgi22.
Størrelsen på vinduet representerer en annen kritisk parameter. Et større vindu vil muliggjøre avbildning av en større del av svulsten med 2P-IVM. I litteraturen er størrelser mellom 3-7 mm beskrevet23. Imidlertid kan større vinduer ikke imøtekomme hjernens krumning, noe som kan føre til økt regionalt trykk24. For å overvinne denne tilbakeholdenheten kan en såkalt "glasshodeskalle" brukes i stedet25. I forhold til tradisjonelle glassvinduer bruker denne metoden buet glass, imøtekomme hjernekurvaturen og dermed muliggjøre opprettelse av større vinduer samtidig som brenntrykket på cortex reduseres. Denne typen buet glass er ikke kommersielt tilgjengelig, og det har bare begrensede applikasjoner i 2P-IVM, siden den buede overflaten forårsaker refleksjonsartefakter, og begrenser området av vinduet som kan avbildes. Et annet alternativ er et silisiumbasert vindu24. På den ene siden gir denne metoden mer fleksibilitet med hensyn til størrelsen og formen på vinduet som skal opprettes. I tillegg er det rapportert sammenlignbare resultater når det gjelder vindussvikt og betennelsesrater til klassiske glassvinduer. På den annen side har 2-foton bildebehandlingskvalitet i polymerbaserte vinduer vist seg å avta raskere enn i glassvinduer, noe som gjør det ikke mulig for langsiktige applikasjoner26. Et tynnet kranievindu representerer et annet alternativ. Selv om det er mindre invasivt enn det klassiske glassvinduet, tillater det ikke GBM-celleimplantasjon ved bruk av samme teknikk som beskrevet her. I tillegg er det vanskelig å oppnå en konsistent skalletykkelse, og som et resultat kan dette forårsake betydelige gjenstander i 2P-IVM27.
Cellelinjen og mengden GBM-celler som implanteres er andre viktige hensyn når du planlegger studietidslinjen. C6 rotte glioma cellelinje er en av de mest brukte cellelinjene i GBM-forskning. Hos rotter og mus er celletall mellom 5 x 104 og 5 x 106 rapportert for intrakranielle implantasjoner 27,28,29,30,31. Som en generell regel, når implantere et høyere antall celler, raskere tumorvekst kan forventes. I denne protokollen ble 1 x 105 celler implantert og avbildning ble utført på dag 11 og 12 etter implantasjon. Xin et al. implanterte 1 x 105 C6-celler i BALB/c nakenmus og rapporterte påvisning av avansert GBM i MR dag 7 etter implantasjon og økt mortalitet etter 15 dager30. Til sammenligning brukte Jia et al. et høyere antall celler (1 x 106) og samme musestamme og oppdaget en liten tumormasse på dag 7 i MR med en litt forstyrret blod-hjernebarriere (BBB), som demonstrert av en blek Evans blå flekk i GBM-vevet32. På dag 14 var Evans blå flekk sterkere enn på dag 7, noe som indikerer at BBB var svært forstyrret. I sin tur påvirker tumorveksten også hvor lenge dyrene kan holdes i forsøket. Dette er et viktig hensyn til dyrevelferd for longitudinelle bildestudier. Kroniske kraniale vinduer er rapportert å være egnet for avbildning i opptil 6 måneder etter implantasjon26.
Nanopartiklene som brukes i denne protokollen består av jernoksid og fluoroforkomponenter. Mulige anvendelser inkluderer undersøkelse av tumorlevering av nye terapeutiske legemidler, cellulær terapi og inngrep på tumorvaskulaturen og tumormikromiljøet. Ulike legemiddelkandidater og kombinasjonsbehandlinger kan evalueres på cellulært og molekylært nivå. Jernoksidkomponenten i NPene muliggjør multimodal avbildning med MR eller magnetisk partikkelavbildning i tillegg til 2P-IVM. Mens MR representerer en klinisk relevant bildemodalitet, er dens anatomiske oppløsning dårligere enn intravital mikroskopi33.
Denne metoden har også visse begrensninger. Hjernekoordinatene i henhold til et musehjerneatlas er standardisert for C57BL/6J-mus og må justeres avhengig av musestamme, kjønn og alder. Dessuten, med to-foton avbildning, kan bare en begrenset dybde på ca. 450 μm nås9. Derfor er bare delvis karakterisering av svulsten mulig med 2P-IVM, og regionale forskjeller i tumoregenskapene kan bli savnet. I tillegg ble bare to tidspunkter etter NP-administrasjon inkludert. Fremtidige studier, inkludert flere tidspunkter etter intravenøs administrering, vil tillate en mer detaljert analyse av den spatiotemporale oppførselen til NP i tumormikromiljøet.
For å konkludere, evaluerte vi tumorleveransen av fluorescerende merkede jernoksid nanopartikler ved bruk av 2P-IVM i en musemodell av GBM. Denne metoden kan enkelt modifiseres for å passe til ulike forskningsområder og representerer et viktig verktøy for in vivo hjerneavbildning innen nevrovitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, Stanford Center for Innovations in Vivo Imaging (SCi3) - small animal imaging center, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.), og Stanford Preclinical Imaging Facility på Porter Drive for å levere utstyr og infrastruktur for dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institute for Child Health and Human Development, tilskuddsnummer R01HD103638. Vi vil gjerne takke Schnitzer Group, Stanford University; Zuo-laboratoriet, Universitetet i Santa Cruz; og Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, for pedagogiske diskusjoner om to-foton bildebehandling og kraniale vindusmodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).
