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Cancer Research

एक murine मॉडल में ग्लियोब्लास्टोमा के दो फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/66304
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 3, 1, 2, 4, 1
1Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley, 3Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 4Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University, Wu Tsai Neuroscience Institute, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

हम एक माउस मॉडल में ग्लियोब्लास्टोमा के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल वाले लौह ऑक्साइड नैनोकणों के ट्यूमर वितरण के दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क ट्यूमर के लिए अंतःशिरा प्रशासित कैंसर चिकित्सा विज्ञान की डिलीवरी रक्त-मस्तिष्क बाधा द्वारा सीमित है। विवो में मस्तिष्क ट्यूमर में मैक्रोमोलेक्यूल्स के संचय और वितरण को सीधे छवि बनाने की एक विधि प्रीक्लिनिकल मॉडल में दवा वितरण को समझने और अनुकूलित करने की हमारी क्षमता को बहुत बढ़ाएगी। यह प्रोटोकॉल ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) के माउस मॉडल में दो-फोटॉन इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी (2 पी-आईवीएम) के साथ अंतःशिरा प्रशासित फ्लोरोसेंट-लेबल वाले नैनोकणों के विवो ट्रैकिंग में वास्तविक समय के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

प्रोटोकॉल में प्रक्रिया का एक बहु-चरणीय विवरण होता है, जिसमें संज्ञाहरण और प्रयोगात्मक जानवरों के एनाल्जेसिया, एक कपाल खिड़की बनाना, जीबीएम सेल प्रत्यारोपण, एक हेड बार रखना, 2 पी-आईवीएम अध्ययन आयोजित करना और दीर्घकालिक अनुवर्ती अध्ययन के लिए शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल शामिल है। हम प्रतिनिधि 2 पी-आईवीएम इमेजिंग सत्र और छवि विश्लेषण दिखाते हैं, इस तकनीक के फायदे और नुकसान की जांच करते हैं, और संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करते हैं।

इस विधि को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और विवो प्रीक्लिनिकल मस्तिष्क इमेजिंग के क्षेत्र में विभिन्न शोध प्रश्नों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

दो-फोटॉन इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी (2 पी-आईवीएम) एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक है जो जीवित ऊतक1 के दृश्य की अनुमति देती है।

पहली बार 1990 के दशक में विकसित, 2P-आईवीएम रेटिना2, गुर्दे3, छोटी आंत4, कोक्लीअ5, दिल6, श्वासनली7, और विभिन्न पूर्व नैदानिक मॉडल 8,9 में मस्तिष्क के विवो विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया है. तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में, 2 पी-आईवीएम जागृत जानवरों10 में स्वस्थ मस्तिष्क की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए एक तकनीक के रूप में महत्व प्राप्त किया है, साथ ही अल्जाइमर11, पार्किंसंसके 12 और ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) 13,14,15,16के रूप में तंत्रिका तंत्र के रोगों का अध्ययन.

2P-IVM GBM के विकास के दौरान ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण समाधान प्रदान करता है। जबकि कुछ पिछले अध्ययनों ने इन विट्रो17 और पूर्व विवो मॉडल18 पर ध्यान केंद्रित किया, अन्य ने जीबीएम की जांच के लिए विवो मॉडल में ऑर्थोटोपिक19 और ज़ेनोट्रोपिक20 को लागू किया। झुंझलाना एट अल एक माउस मॉडल13 में सीएनएस -1 चूहा ग्लियोमा सेल लाइन की देशी इमेजिंग का प्रदर्शन किया। ऑर्थोटोपिक GL261-DsRed murine मॉडल का उपयोग करते हुए, रिकार्ड एट अल ने 2P-IVM14 में ट्यूमर क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं को बढ़ाने के लिए फ्लोरोफोर का अंतःशिरा प्रशासन किया। 

यहां, हम जीबीएम के ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में फ्लोरोसेंट-लेबल वाले आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (एनपी) के ट्यूमर वितरण पर नज़र रखने के लिए 2 पी-आईवीएम लागू करते हैं। एक कपाल खिड़की का उपयोग करते हुए, यह विधि हमें मस्तिष्क में एनपी के वास्तविक समय के स्थानिक वितरण का विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देती है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित पशु प्रक्रिया प्रयोगशाला पशु देखभाल (APLAC) पर प्रशासनिक पैनल की आवश्यकताओं के अनुसार है.

1. सेल संस्कृति

  1. हुड की तैयारी
    1. हाथ धोएं, दस्ताने और एक लैब कोट पहनें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट चालू करें और सैश स्तर को उचित उद्घाटन ऊंचाई पर सेट करें। हुड 3-5 मिनट के लिए शुद्ध करते हैं. हुड क्षेत्र को 70% इथेनॉल से स्प्रे करें और टिशू पेपर से पोंछ लें।
    2. 70% इथेनॉल के साथ सभी अभिकर्मकों स्प्रे और टिशू पेपर के साथ नीचे पोंछ. हुड में अभिकर्मकों ले जाएँ. ग्रिल पर कोई सामान न रखें। यदि हुड में एक स्पिल होता है, तो इसे पोंछे के साथ कवर करें, इसे 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और फिर से पोंछ लें।
    3. प्रयोग के बाद, प्रत्येक आइटम के ढक्कन को ध्यान से बंद करें, सभी सामग्रियों को मिटा दें, हुड से किसी भी आइटम को हटा दें, और उन्हें अपने मूल स्थान पर स्थानांतरित करें। हुड में 70% इथेनॉल स्प्रे और इसे नीचे पोंछ. सैश बंद करें और जैविक सुरक्षा कैबिनेट बंद करें।
  2. विकास माध्यम की तैयारी
    1. 500 एमएल Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के लिए 100% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 50 एमएल जोड़ें. एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक समाधान (100x) के 5 एमएल जोड़ें।
    2. एक बाँझ 500 एमएल फ़िल्टरिंग बोतल (0.22 माइक्रोन फिल्टर) के माध्यम से सभी अभिकर्मकों को पास करें।
  3. क्रायोप्रेज़र्व्ड कोशिकाओं का विगलन
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड में, एक T75 फ्लास्क के लिए विकास माध्यम के 20 एमएल जोड़ें. फ्लास्क पर कोशिकाओं के नाम, दिनांक और पैसेज नंबर के साथ फ्लास्क को लेबल करें। इस अध्ययन में, पक्षपाती C6 ग्लियोमा कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघलना कोशिकाओं. कोशिकाओं भंवर मत करो. पिघलना और तुरंत कोशिकाओं का उपयोग करें।
    3. पिघले हुए कोशिकाओं को 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग करके टी 75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान किसी भी बुलबुले को पेश नहीं करने के लिए सावधान रहें, और फ्लास्क की गर्दन में किसी भी मध्यम अवशेष से बचें। इससे संभावित संदूषण का खतरा बढ़ सकता है।
  4. माध्यम बदलना
    1. किसी भी अवशिष्ट ट्रिप्सिन या डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) (चरण 1.6) को हटाने के लिए विगलन के बाद के दिन माध्यम बदलें। बाद में, सेल संगम स्तर के आधार पर, प्रति सप्ताह या उससे अधिक कम से कम दो बार माध्यम बदलें। ट्रिप्सिन को खत्म करने के लिए पारित होने के एक दिन बाद माध्यम को बदलना होगा।
    2. माध्यम को बदलने के लिए, आकांक्षा तंत्र को चालू करें, आकांक्षा ग्लास पिपेट संलग्न करें, और सभी माध्यम को महाप्राण करें।
    3. विकास माध्यम (चरण 1.2) के 20 एमएल जोड़ें।
  5. कोशिकाओं को पास करना
    1. प्रयोग के दौरान आवश्यक वस्तुओं के साथ हुड लोड करें।
    2. एक आकांक्षा ग्लास पिपेट का उपयोग करें और सभी मीडिया को दूर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ग्लास विंदुक फ्लास्क के गैर-सेल पक्ष पर है। इस चरण के लिए, T75 फ्लास्क को लंबवत रखें।
    3. गैर-सेल पक्ष पर कमरे के तापमान (आरटी) फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, सीए ++ और मिलीग्राम ++ मुक्त) या हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस, सीए ++, और मिलीग्राम ++ मुक्त) के ~ 10 एमएल जोड़ें। नीचे का सामना करना पड़ सेल पक्ष के साथ क्षैतिज T75 फ्लास्क की स्थिति द्वारा पीबीएस के साथ संक्षेप में कोशिकाओं को धो लें.
    4. तुरंत फ्लास्क को लंबवत रखें और पीबीएस/एचबीएसएस को एस्पिरेट करें। इस धुलाई और महाप्राण को 3 बार दोहराएं।
    5. सेल साइड पर ट्रिप्सिन (पुनः संयोजक या पशु-व्युत्पन्न) के 2 एमएल जोड़ें (टी 75 फ्लास्क क्षैतिज, सेल साइड नीचे का सामना करना पड़ रहा है)। 4 मिनट के लिए एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में इनक्यूबेट करें। एक 5 एमएल विंदुक का उपयोग कर 2 मिनट के बाद एक बार यह triturate.
    6. कुल इनक्यूबेशन के 4 मिनट के बाद, समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। शंक्वाकार ट्यूब में विकास समाधान के 8 एमएल जोड़ें (2 एमएल ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाएं + 8 एमएल मध्यम = कुल 10 एमएल)।
    7. एक फिल्टर के साथ एक और खाली 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें और व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 25 एमएल विंदुक के माध्यम से कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    8. समाधान के 1/10 (1 एमएल) (सेल + मीडिया + ट्रिप-एलई) को 20 एमएल मीडिया के साथ एक टी 75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं (1.7 कदम) की गणना. गैर-ट्रिप्सिन मीडिया समाधान के लिए अगले दिन मीडिया बदलें।
  6. माध्यम और कोशिकाओं को फ्रीज करना
    1. पिघलना 100% एफबीएस एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में. पानी के स्नान या गर्मी का उपयोग न करें क्योंकि इससे एफबीएस में प्रोटीन को नुकसान हो सकता है।
    2. ठंड मीडिया के 50 एमएल तैयार करने के लिए, डीएमईएम के 45 एमएल, एफबीएस के 5 एमएल और डीएमएसओ के 5 एमएल मिलाएं। आंतरायिक विगलन और प्रोटीन क्षति को रोकने के लिए इसे 1-2 एमएल कंटेनरों में विभाजित। उन्हें -20 डिग्री या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    3. समाधान (चरण 1.5) के शेष 9 एमएल के लिए, कुल 10 एमएल तक पहुंचने के लिए माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ठंड माध्यम (ऊपर देखें) के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक ठंड कंटेनर में रखें। 1 या 2 दिनों के बाद लंबी अवधि के भंडारण के लिए कोशिकाओं को तरल एन2 में ले जाएं।
  7. कक्षों की गिनती
    1. शेष 9 एमएल (चरण 1.5) के लिए, कुल 10 एमएल तक पहुंचने के लिए मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और HBSS के 4 एमएल में पुन: निलंबित करें। एचबीएसएस के 80 माइक्रोन में कोशिकाओं के 10 माइक्रोन + 0.4% ट्रिपैन ब्लू के 10 माइक्रोन, कमजोर पड़ने का कारक = 10 को फिर से निलंबित करें।
    3. समाधान के 17 माइक्रोन लें और हेमोसाइटोमीटर में चार 4 x 4 वर्गों की गणना करें। चार 4 x 4 वर्गों के लिए औसत मायने रखता है और कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए 104एक्स कमजोर पड़ने कारक से गुणा करें।

2. सर्जरी

नोट: यह दो शोधकर्ताओं द्वारा सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है, जहां एक व्यक्ति कोशिकाओं को तैयार करने, दंत सीमेंट मिश्रण, और आम तौर पर प्रक्रिया में सहायता के लिए जिम्मेदार है, जबकि दूसरा व्यक्ति शेष बाँझ पर केंद्रित है. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया में सहायता करने के लिए एक दूसरा मैनिपुलेटर होने से संदूषण होने की संभावना काफी कम हो जाती है। सर्वोत्तम सर्जिकल प्रथाओं का पालन करने से पोस्ट-ऑपरेटिव जटिलताओं की संभावना कम हो जाएगी। चित्रा 1 ए कपाल खिड़की के घटकों का अवलोकन प्रदान करता है।

  1. सामान्य तैयारी
    1. पुष्टि करें कि प्रक्रिया शुरू करने से पहले स्थानीय पशु कल्याण संस्थागत दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित है।
      नोट: इस अध्ययन में 5 महीने की महिला एनएसजी चूहों (एनओडी। Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5)।
    2. सर्जरी से पहले, सभी सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव करें और सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक आपूर्ति उपलब्ध हैं। संज्ञाहरण और सर्जरी रिकॉर्ड प्रिंट करें।
    3. सुनिश्चित करें कि आगमन पर, जानवरों को अतिरिक्त पोस्ट-ऑपरेटिव संकट को कम करने के लिए पशुपालन कक्ष में कम से कम 1 सप्ताह का अनुकूलन हो।
    4. सर्जरी के दिन, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण (माइक्रोस्कोप, हीटिंग पैड, स्टेरलाइज़र, ड्रिल, वैक्यूम, आदि) उपयोग के लिए तैयार हैं। पुष्टि करें कि संज्ञाहरण मशीन में पर्याप्त आइसोफ्लुरेन है और यदि आवश्यक हो तो फिर से भरना। नए उपयोगकर्ताओं के लिए, कपाल खिड़की प्रक्रिया प्रति जानवर 2 घंटे तक ले जा सकती है; इसलिए, पर्याप्त आइसोफ्लुरेन होना महत्वपूर्ण है।
    5. शराब में कांच की खिड़कियां और सिर सलाखों को रखें और खारा के साथ एक कंटेनर तैयार करें। यह बाँझपन में किसी भी बड़े उल्लंघन के बिना एक चिकनी कार्यप्रवाह सुनिश्चित करेगा और प्रत्येक जानवर के लिए संज्ञाहरण के तहत समय को यथासंभव कम रखेगा।
    6. कार्य स्टेशन पर एक बाँझ सतह पर सभी सर्जिकल सामग्री खोलें। उदाहरण के लिए, इस उद्देश्य के लिए एक बाँझ धुंध पैकेजिंग के अंदर का उपयोग किया जा सकता है। केवल-युक्तियों की तकनीक का उपयोग करें। सर्जिकल उपकरणों का उपयोग नहीं करते समय, युक्तियों को बाँझ सतह पर रखें, जैसे कि बाँझ धुंध की पैकेजिंग के अंदर।
    7. कई सर्जरी करते समय, उन्हें कीटाणुरहित करने के लिए सर्जरी के बीच में स्टरलाइज़र में सभी सर्जिकल उपकरणों को रखें। 5 से अधिक जानवरों पर सर्जरी करते समय, आटोक्लेव उपकरणों के एक नए सेट का उपयोग करें। ड्रिल टिप को स्विच करें जब यह ऊतक आघात से बचने के लिए एक नए के लिए कुंद हो जाता है।
  2. एनेस्थीसिया और सर्जरी की तैयारी
    नोट: संज्ञाहरण सेटअप सर्जरी के लिए समान है, साथ ही इमेजिंग के लिए भी।
    1. एक संवेदनाहारी कक्ष में आइसोफ्लुरेन (प्रेरण के लिए 3% -5%) का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। पेडल वापसी पलटा (दोनों हिंद पैरों पर पैर पैड चुटकी) का परीक्षण करके पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई सुनिश्चित करने के बाद, पशु को एक तैयारी कार्य स्टेशन में स्थानांतरित करें। नाक शंकु (1% -2%) पर संज्ञाहरण बनाए रखें। यहां, कॉर्नियल क्षति को रोकने के लिए एक आंख मरहम लागू करें। नियमित रूप से पंजा पलटा की जाँच करके सर्जरी के दौरान सजगता के नुकसान को नियंत्रित करें।
    2. यदि जानवर की किसी भी पहचान की आवश्यकता है, तो कानों को चिह्नित करने के लिए एक कान पंच उपकरण या कैंची का उपयोग करें या पूंछ को चिह्नित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें।
    3. एक डिपिलिटरी क्रीम के साथ कान और आंखों के बीच खोपड़ी को कवर करने वाले फर को हटा दें। त्वचा की जलन से बचने के लिए निर्माता द्वारा संकेत (30-60 एस) तक क्रीम को छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि क्रीम बालों के विकास की दिशा के खिलाफ लगाने से बालों की जड़ों के संपर्क में आती है। इससे बचें कि डिपिलिटरी क्रीम आंखों के संपर्क में आती है। खारा के साथ क्षेत्र को साफ करके किसी भी क्रीम और बालों के अवशेष निकालें। वैकल्पिक रूप से, क्लिपर्स का उपयोग करें।
    4. किसी भी इंट्रा- और पोस्ट-ऑपरेटिव दर्द, संक्रमण या सूजन से बचने के लिए, गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं (एनएसएआईडी), ओपिओइड, विरोधी भड़काऊ एजेंटों और एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन करें। सर्जरी से पहले कारप्रोफेन (5-20 मिलीग्राम/किग्रा, चमड़े के नीचे [वर्ग]), ब्यूप्रेनोर्फिन - निरंतर रिलीज (1 मिलीग्राम/किग्रा वर्ग), सेफ़ाज़ोलिन (20 मिलीग्राम/किग्रा वर्ग), और डेक्सामेथासोन (0.2 मिलीग्राम/किग्रा वर्ग) का प्रशासन करें। निर्जलीकरण से बचने के लिए 0.9% खारा वर्ग के लगभग 0.3 एमएल प्रशासन.
    5. इसके बाद, खोपड़ी के बीच से परिधि तक गोलाकार गति में तीन बार वैकल्पिक रूप से पोविडोन-आयोडीन और आइसोप्रोपिल अल्कोहल को घुमाकर क्षेत्र को साफ़ करें।
  3. क्रैनियोटॉमी प्रक्रिया
    1. पशु को सर्जिकल टेबल पर स्थानांतरित करें और प्रक्रिया के दौरान इज़ोटेर्मल स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए इसे हीटिंग पैड (~ 37 डिग्री सेल्सियस) पर उदर पुनरावृत्ति में रखें। कृन्तकों में हाइपोथर्मिया जीवित रहने की दर को काफी कम कर देता है और पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी चरण को बढ़ाता है।
    2. कान सलाखों और incisor सलाखों की स्थिति से stereotactic फ्रेम में सिर रखें. कान की सलाखों के लिए, जाइगोमैटिक आर्क ढूंढें और मेहराब के पीछे सलाखों को डालें। प्रमुख हाथ से विपरीत पट्टी को सुरक्षित करके शुरू करें (उदाहरण के लिए, यदि आप दाएं हाथ के हैं तो बाएं हाथ को अपने दाहिने हाथ से सुरक्षित करें) और फिर विपरीत दिशा को सुरक्षित करें। यदि आवश्यक हो तो शिकंजा मोड़ द्वारा कान और incisor सलाखों की स्थिति को समायोजित करें.
    3. यदि आवश्यक हो तो आंखों के मरहम को फिर से लागू करें, और आंखों को ढंकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े का उपयोग करें। यह बाद में साइनोएक्रिलेट गोंद को ठीक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उज्ज्वल माइक्रोस्कोप प्रकाश और यूवी प्रकाश के कारण होने वाले किसी भी नुकसान को रोक देगा (चरण 2.5)।
    4. चीरा से पहले, पैर की अंगुली चुटकी पलटा के लिए फिर से जांचें; यदि आवश्यक हो, तो तदनुसार संज्ञाहरण समायोजित करें। हिंद पंजा पर सेंसर की स्थिति से संज्ञाहरण निगरानी उपकरण के लिए पशु कनेक्ट. हृदय गति और रक्त ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने से मृत्यु दर को कम करने और पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी में सुधार करने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, छाती की गति का नेत्रहीन निरीक्षण करके श्वसन दर प्राप्त करें।
    5. हाइपोथर्मिया और संदूषण से बचने के लिए जानवर के शरीर को एक पर्दे से ढक दें। सर्जरी शुरू करने से पहले एक अंतिम पोविडोन-आयोडीन झाड़ू करें।
    6. दस्ताने और एक साफ लैब कोट पर रखो।
      नोट: प्रक्रिया की आक्रामकता के कारण बाँझ दस्ताने का उपयोग करने और किसी भी पोस्ट-ऑपरेटिव संक्रमण और सूजन के जोखिम को कम करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप रुग्णता और 2 पी-आईवीएम (धारा 5) में छवि गुणवत्ता का नुकसान होता है।
    7. खोपड़ी पर त्वचा लिफ्ट और सही आंख और कान के बीच कैंची पकड़ और चीरा निशान के बाद खोपड़ी के बाईं ओर की ओर काटने से एक चीरा बनाने. परिणामस्वरूप गोल त्वचा फ्लैप निकालें।
      नोट: मस्तिष्क और खिड़की के आकार में रुचि के क्षेत्र के आधार पर, चीरा साइट और व्यास भिन्न हो सकते हैं. चीरा का आकार बढ़ते (चरण 2.5) के लिए कमरे को समायोजित करने के लिए सिर के व्यास से बड़ा होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो चीरा के आसपास की त्वचा को अधिक स्थान बनाने के लिए धीरे से विच्छेदित किया जा सकता है।
    8. धीरे एक स्केलपेल ब्लेड या एक microcurrette के साथ खोपड़ी की सतह खरोंच द्वारा periosteum निकालें. कपाल टांके के चारों ओर पेरीओस्टेम को हटाते समय सावधानी बरतें क्योंकि वे क्षेत्र नाजुक होते हैं और रक्तस्राव के लिए अधिक प्रवण होते हैं। मलबे से शल्य चिकित्सा क्षेत्र को साफ रखने के लिए खारा और एक वैक्यूम का प्रयोग करें। साइनोएक्रिलेट गोंद और दंत सीमेंट (चरण 2.5) के बेहतर पालन को सुनिश्चित करने के लिए पेरीओस्टेम को खरोंच करें
    9. सेल इंजेक्शन करने के लिए मस्तिष्क के क्षेत्र की पहचान करें। इसके लिए, माउस मस्तिष्क के स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक के एटलस का उपयोग करें। मस्तिष्क निर्देशांक के अनुसार, खिड़की, एक शल्य कलम, या एक autoclaved पेंसिल के रूप में एक ही व्यास में एक बायोप्सी पंच का उपयोग करके कपाल खिड़की की स्थिति को चिह्नित करें।
    10. प्रमुख हाथ में ड्रिल और गैर प्रमुख हाथ में किसी भी अन्य साधन (सिरिंज, संदंश) पकड़ो. एक ही स्थान पर लंबे समय तक ड्रिलिंग से बचें। ओवरहीटिंग से बचने के लिए ड्रिल का उपयोग फटने में किया जाना चाहिए। इन ब्रेक के दौरान, शल्य दृश्य साफ रखने के लिए और overheating को रोकने के लिए कैल्वेरियम के लिए ठंड खारा लागू होते हैं. ड्रिल टिप से संवेदी प्रतिक्रिया का उपयोग पता लगाने के लिए जब खोपड़ी पूरी तरह से छिद्रित किया गया है.
    11. खोपड़ी की सतह को साफ करने के लिए, एक वैक्यूम के साथ संयोजन में, ठंड खारा का प्रयोग करें। कैल्वेरियम खोलने के बाद धुंध या कपास टिप आवेदक का उपयोग न करें क्योंकि सूती धागे के अवशेष मस्तिष्क की खिड़की को सील करने पर एक विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया का कारण बन सकते हैं।
    12. ड्रिलिंग करते समय, सुनिश्चित करें कि प्रक्षेपवक्र और व्यास ग्लास कवरस्लिप के समान आकार के हैं। खोपड़ी के शीर्ष पर कांच coverslip स्थिति और कांच coverslip कपाल खिड़की के अंदर बिल्कुल फिट होगा कि पुष्टि करके ऐसा करो.
    13. एक बार जब यह धीरे उस पर दबाने से खोपड़ी प्रालंब को दबाने के लिए संभव है, ध्यान से शल्य चिकित्सा क्षेत्र (चित्रा 1 बी, बाएं) से टुकड़ा को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें. यदि खोपड़ी को दबाना अभी तक संभव नहीं है, तो कपाल खिड़की के क्षेत्रों में ड्रिलिंग जारी रखें जो अभी भी खोपड़ी के बाकी हिस्सों से जुड़े हुए हैं और पुनर्मूल्यांकन करते हैं।
    14. यदि मामूली रक्तस्राव होता है, तो रक्त की हानि को कम करने में मदद करने के लिए हल्के दबाव या वैकल्पिक रूप से, बर्फ की ठंडी खारा के साथ संयुक्त हेमोस्टैटिक स्पंज का उपयोग करें।
  4. सेल आरोपण
    1. तैयार करें और कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए गणना के रूप में (चरण 1.7) में वर्णित है. सुनिश्चित करें कि सेल नंबर 200,000 कोशिकाओं/μL है।
      नोट: आरटी पर जमने वाले झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं को निलंबित करने की सिफारिश की जाती है। यह मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की सफलता दर में सुधार करेगा।
    2. शल्य चिकित्सा कमरे में बर्फ के साथ एक कंटेनर में कोशिकाओं को स्थानांतरण. एक गैसटाइट माइक्रोलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। आकांक्षा से पहले, तापमान के अंतर से बचने के लिए बर्फ पर सिरिंज रखें।
    3. 1 माइक्रोन को एस्पिरेट करने के बाद, सिरिंज को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के अंदर रखें।
      नोट: एक्स, वाई और जेड अक्षों में पदों को दिखाने वाला एक स्वचालित स्टीरियोटैक्टिक समन्वय उपकरण समय बचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लैम्ब्डा के आधार पर पदों की मैन्युअल रूप से गणना करना भी संभव है। 1.5 माइक्रोन से अधिक इंजेक्शन लगाने की सिफारिश नहीं की जाती है। यह सुनिश्चित करेगा कि इंजेक्शन क्षेत्र ओवरफिल नहीं करता है, जिससे असफल आरोपण, मस्तिष्क पैरेन्काइमा के बाहर वृद्धि, या मेटास्टेस होते हैं।
    4. मस्तिष्क के V2MM क्षेत्र (दृश्य प्रांतस्था 2, औसत दर्जे का हिस्सा) में आरोपण करें, जो लगभग औसत दर्जे का पार्श्व (M-L) से मेल खाता है: -1.2 से -1.6 मिमी, और पृष्ठीय से उदर (D-V): -2.6 से -3.5 मिमी निर्देशांक।
      1. दो-फोटॉन इमेजिंग (चरण 4.6) के लिए, सतही मस्तिष्क क्षेत्रों में कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करें ताकि ट्यूमर द्रव्यमान को बाद में कपाल खिड़की के माध्यम से देखा जा सके। पूर्वकाल से पीछे (एपी) पर 0.5 माइक्रोन (100,000 कोशिकाओं) इंजेक्ट करें: 0.8 मिमी गहराई। मस्तिष्क में प्रवेश करते समय, सुई को धीरे-धीरे चरणबद्ध तरीके से ले जाएं और इंजेक्शन के बाद 30 एस की प्रतीक्षा करें (चित्र 1बी, मध्य स्तंभ)।
      2. सुई को वापस लेने और मस्तिष्क के ऊतकों से बाहर निकलने पर एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करें। वेंट्रिकल्स के करीब इंजेक्शन लगाने से बचें क्योंकि मस्तिष्कमेरु द्रव केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में मेटास्टेसिस को प्रोत्साहित कर सकता है।
  5. कपाल खिड़की का बंद होना
    1. शराब से सिर बार और कांच coverslip एक खारा समाधान करने के लिए ले जाएँ. सर्जिकल साइट पर उन घटकों को नेविगेट करने के लिए एक वैक्यूम टिप या संदंश का उपयोग करें।
    2. कपाल खिड़की के अंदर कांच coverslip स्थिति और खोपड़ी और कांच coverslip के बीच cyanoacrylate गोंद की एक छोटी राशि जगह है. यूवी-सक्रिय साइनोएक्रिलेट गोंद इलाज के समय को कम करता है और आकस्मिक विस्थापन से बचाता है। यदि कोई गोंद ग्लास कवरस्लिप पर फैलता है, तो इसे एक कपास टिप आवेदक के साथ हटा दें या पूरी तरह से ठीक होने से पहले इसे स्केलपेल के कुंद पक्ष के साथ धीरे से खरोंच दें।
      सावधानी: यूवी प्रकाश आंखों और त्वचा के लिए हानिकारक है। गोंद को ठीक करते समय आंखों और त्वचा के संपर्क से बचें।
    3. कपाल खिड़की में ग्लास कवरस्लिप को सुरक्षित करने के बाद, हेड बार लागू करें। दो-घटक दंत सीमेंट मिलाएं, हेड बार की स्थिति बनाएं, और खोपड़ी और हेड बार के बीच संपर्क सुनिश्चित करते हुए, सीमेंट को आसपास के क्षेत्र में लागू करें। ध्यान से एक सिरिंज, एक स्केलपेल, या एक ड्रिल टिप की नोक के साथ किसी भी ज़रूरत से ज़्यादा सीमेंट साफ.
      नोट: डेंटल सीमेंट बहुत जल्दी जम जाता है, इसलिए इसे समय पर लगाने की सलाह दी जाती है।
    4. कपाल खिड़की सील करने के बाद, दंत सीमेंट और त्वचा के बीच किसी भी खोपड़ी क्षेत्रों अभी भी उजागर कर रहे हैं की पहचान करें. यदि ऐसा है, तो त्वचा को बंद करके खोपड़ी को कवर करने के लिए सर्जिकल गोंद लागू करें। वैकल्पिक रूप से, एक शोषक सिवनी सामग्री के साथ एक एकल सिवनी प्रदर्शन.

3. शल्य चिकित्सा के बाद वसूली और ट्यूमर के विकास

  1. वसूली
    1. एक वसूली पिंजरे में एक गर्म पैड पर जानवर की निगरानी जब तक यह पूर्ण चेतना पुनः प्राप्त. चोट के जोखिम को कम करने के लिए सर्जरी के बाद जानवरों को अलग से रखें।
    2. एक रिकवरी आहार का प्रशासन करें, जैसे इलेक्ट्रोलाइट्स या शर्करा के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पानी जैल। वैकल्पिक रूप से, आसान पोषण सुनिश्चित करने और निर्जलीकरण और हाइपोग्लाइसीमिया से बचने के लिए सिक्त मानक प्रयोगशाला चाउ की आपूर्ति करें।
  2. निगरानी
    1. ठीक होने पर, दर्द, संकट या संक्रमण के संकेतों के लिए दैनिक पशु की निगरानी करें। यदि आवश्यक हो, तो एनाल्जेसिक, विरोधी भड़काऊ दवाओं या एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन करें। यदि कोई जानवर अध्ययन समापन बिंदु तक पहुंचता है, तो उसे मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें। अंतिम इमेजिंग सत्र के बाद, कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हो।
      नोट: प्रारंभिक इच्छामृत्यु मानदंड के उदाहरणों में शामिल हैं, लेकिन महत्वपूर्ण वजन घटाने (>20%), तंत्रिका संबंधी विकार, डिस्पेनिया, सर्जरी के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव, या स्पष्ट रूढ़िवादी व्यवहार तक सीमित नहीं हैं। कपाल खिड़की का निरीक्षण करें और आवश्यक होने पर इसे खारा या शराब से साफ करें।
    2. ट्यूमर के विकास को ट्रैक करने और इमेजिंग समय बिंदुओं की योजना बनाने के लिए, पूरे शरीर के बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) करें। इसके लिए, 150 मिलीग्राम/किग्रा डी-लूसिफेरिन इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें और 5-15 मिनट के बाद जानवर की छवि बनाएं।

4. नैनोपार्टिकल संश्लेषण

  1. कण तैयारी
    1. 5 एम एनएओएच के 50 एमएल, विआयनीकृत पानी (डीआई पानी) के 20 एमएल और एपिक्लोरोहाइड्रिन के 20 एमएल युक्त समाधान में फेरुमोक्सिटोल (कुल 6 एमएल एफई) के 11.17 एमएल जोड़ें। इस स्तर पर चरण अलगाव का निरीक्षण करें। 24 घंटे के लिए कोमल मिलाते हुए के तहत आरटी पर मिश्रण सेते हैं.
    2. 24 घंटे के बाद, समाधान एक समान हो जाता है। 3 दिनों के लिए पानी के खिलाफ डायलिसिस टयूबिंग (12,000-14,000 दा कटऑफ) का उपयोग कर अतिरिक्त epichlorohydrin निकालें.
    3. डायलिसिस के बाद, ट्यूब में शेष समाधान को कांच की बोतल (कुल मात्रा ~ 110 एमएल) में स्थानांतरित करें। अमोनिया हाइड्रॉक्साइड के 30 एमएल जोड़ें, और 18-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हलचल।
    4. सरगर्मी के बाद, 3 दिनों के लिए पानी के खिलाफ डायलिसिस दोहराएं। डायलिसिस टयूबिंग में शेष समाधान को कुल मात्रा ~ 110 एमएल के साथ एक नई कांच की बोतल में स्थानांतरित करें।
  2. फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) संयुग्मन
    1. FITC संयुग्मन के लिए अमाइन-कार्यात्मक कणों के 27.5 एमएल निकालें। 10 केडीए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन फिल्टर का उपयोग करके कणों को ध्यान केंद्रित करें और पीएच 9 (ना2सीओ3/एनएएचसीओ3) बफर के साथ 5752 x ग्राम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए धोएं।
    2. फिल्टर में समाधान के 4 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 5752 x ग्राम पर ट्यूब को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें। छानना त्यागें और एक ही प्रोटोकॉल के साथ धोने के एक दूसरे दौर के लिए बफर के साथ फिल्टर फिर से भरना.
    3. छानना त्यागें और एक पिपेट का उपयोग कर फिल्टर में समाधान इकट्ठा. फेरुमोक्सिटोल की द्रव्यमान सांद्रता द्वारा कण की दाढ़ सांद्रता का अनुमान लगाएं, यह मानते हुए कि प्रत्येक कण का व्यास 5 एनएम है।
    4. FITC को निर्जल डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) में 10 mg/mL पर घोलें। धीरे-धीरे केंद्रित अमाइन-कार्यात्मक कण में डीएमएसओ-भंग एफआईटीसी के 1.4 एमएल जोड़ें। FITC: कण का दाढ़ अनुपात 20:1 है। उसके बाद, अंधेरे में 8 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं।
    5. अतिरिक्त एनएच3 जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाएं। एच2ओ (एनएच3 की अंतिम एकाग्रता। एच2ओ 50 एमएम है), फिर समाधान को 2 घंटे के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रहने दें। Na2CO3/NaHCO3 (पीएच 9) बफर का उपयोग करके अतिरिक्त FITC को 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 5752 x ग्राम पर 10 kDa फिल्टर के माध्यम से धो लें। समाधान के अंतिम पीएच को एचसीएल जलीय घोल का उपयोग करके 7.4 पर समायोजित किया जाता है।

5. 2पी-आईवीएम

नोट: 2P-IVM सत्रों के लिए, एक कस्टम स्टेज (चित्र 2 और पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) के साथ एक प्रेयरी अल्टिमा IV माइक्रोस्कोप जो कपाल खिड़की की स्थिति को क्षैतिज और लंबवत रूप से समायोजित करने की अनुमति देता है, का उपयोग किया गया था। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग पोस्ट-प्रोसेसिंग और छवि विश्लेषण के लिए किया गया था। इस तरह, लेजर बीम को 90 ° कोण पर कांच को हिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, कलाकृतियों को कम किया जा सकता है और इमेजिंग गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है।

  1. इमेजिंग सत्र
    1. टीआई-नीलम लेजर चालू करें। मुख्य सिस्टम स्विच और प्रेयरी व्यू सॉफ्टवेयर चालू करें।
    2. जानवर को संवेदनाहारी करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 2.2)। प्रति जानवर 2 घंटे तक के लिए इमेजिंग सत्र करें। संज्ञाहरण जटिलताओं और संबंधित रुग्णता या मृत्यु दर के जोखिम को कम करने के लिए इमेजिंग समय को कम से कम रखें।
    3. एक कस्टम चरण (चित्रा 1 बी, सही कॉलम) का उपयोग कर दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत माउस को स्थिर करें। कृंतक सर्जरी के लिए डिज़ाइन किए गए गर्म पैड पर जानवर को प्रवण स्थिति में रखें और वक्ष को संकुचित न करने पर ध्यान देते हुए टेप का उपयोग करके इसे हल्के से सुरक्षित करें। कपाल खिड़की पर पानी की एक बूंद रखें और फोकस समायोजित करें।
    4. जानवरों के महत्वपूर्ण मापदंडों की निगरानी के लिए हृदय गति और रक्त ऑक्सीकरण प्राप्त करें। हिंद पंजा पर सेंसर की स्थिति और दो फोटॉन इमेजिंग कक्ष के बाहर निगरानी डिवाइस रखें.
    5. एक बार जानवर खुर्दबीन मंच पर है, सिर की स्थिति को समायोजित. दूरबीन और वाइडफील्ड फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग करके, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) फ़िल्टर सेट करें और देखने के वांछित इमेजिंग क्षेत्र (चित्रा 1 बी, दाएं कॉलम) ढूंढें।
    6. एक बार नमूना अभिविन्यास और देखने के क्षेत्र निर्धारित कर रहे हैं, प्रकाश स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी मोड (LSM) के लिए widefield मोड से खुर्दबीन स्विच.
    7. सुनिश्चित करें कि टीआई-नीलम लेजर 920 एनएम पर मोड-लॉक है, और सभी शटर खुले हैं। GaAsP फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब डिटेक्टरों (PMT) वोल्टेज को 500-600 V तक लाएं 595/50 (RFP) और 525/50 पर बैंड पास के साथ फिल्टर सेट के साथ दो PMTs का उपयोग करें।
    8. लाइव छवि दबाएँ और धीरे-धीरे pockel सेल संशोधित करने के लिए नमूना पर लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए जब तक एक छवि दिखाई दे रहा है.
    9. एक बार एक स्पष्ट छवि प्राप्त हो जाने के बाद, वांछित नमूना क्षेत्र के भीतर एक छवि स्टैक के ऊपर और नीचे सेट करने के लिए सॉफ़्टवेयर और मोटर चालित चरण का उपयोग करें। चरण आकार से सावधान रहें और ध्यान रखें कि Z-अक्ष लेंस की गहराई को समायोजित करता है।
    10. बढ़ती गहराई के साथ, छवियां गहरी हो जाएंगी। छवि को उज्ज्वल रखने के लिए धीरे-धीरे pockels/PMT लाभ बढ़ाएँ। सावधान रहें कि बहुत अधिक शक्ति का उपयोग न करें क्योंकि इससे फोटोटॉक्सिसिटी और ऊतक क्षति हो सकती है।
    11. एक सेव पाथ सेट करें और Z सीरीज शुरू करें। यह स्वचालित रूप से सेट pockel/PMT सेटिंग्स का उपयोग करके शुरुआती और समाप्ति की स्थिति को पार कर जाएगा। एक बार स्टैक पूरा हो जाने के बाद, गुणवत्ता के लिए स्टैक को देखने के लिए प्लेबैक का उपयोग करें। एक बार आवश्यक छवियों को प्राप्त करने के बाद, टीआई-नीलम लेजर बंद कर दें।
    12. पशु को एक वसूली पिंजरे में ले जाएं, जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 3.1)।
    13. प्रेयरी दृश्य से बाहर निकलें और सुनिश्चित करें कि सभी डेटा सहेजे गए/स्थानांतरित किए गए हैं। कंप्यूटर को शट डाउन करें और सभी हार्डवेयर को शट डाउन करें।
  2. फिजी के साथ प्रसंस्करण के बाद
    नोट: फिजी जैविक छवि विश्लेषण21 पर केंद्रित एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है.
    1. ऑपरेटिंग सिस्टम के संबंध में FIJI डाउनलोड करें। फ़ोल्डर सामग्री को अनज़िप करें और .exe फ़ाइल चलाएँ।
    2. दो-फोटॉन इमेजिंग से एकत्रित .env फ़ाइल को संवाद बॉक्स में खींचें। चैनलों को अलग-अलग छवि बॉक्स में विभाजित करें। यह अलग-अलग चैनलों के साथ दो अलग-अलग छवियां बनाएगा, एक सेल सिग्नल और दूसरा कण सिग्नल युक्त।
    3. छवियों में से एक को कॉपी करें और दूसरी छवि बनाने के लिए फ़ाइल > नई > आंतरिक क्लिपबोर्ड पर क्लिक करें। छवियों में से एक को स्रोत और दूसरे को कॉपी के रूप में नाम दें।
    4. कॉपी इमेज का उपयोग करें और डायलॉग बॉक्स में प्रोसेस > एन्हांस कंट्रास्ट पर क्लिक करें। सामान्यीकृत करें और ठीक क्लिक करें और फिर प्रक्रिया > चिकना करें। इस छवि का उपयोग मुखौटा बनाने के लिए किया जाता है न कि विश्लेषण के लिए। डायलॉग बॉक्स में इमेज > एडजस्ट > थ्रेशोल्ड पर क्लिक करें। स्लाइडिंग स्केल और विधि का उपयोग करें जो निकालने के लिए उपयुक्त है, फिर लागू करें पर क्लिक करें।
    5. पृष्ठभूमि में एकल पिक्सेल को मिटाने के लिए प्रक्रिया > बाइनरी > इरोड का उपयोग करें और छवि में पिक्सेल वापस जोड़ने के लिए बाइनरी > पतला > प्रक्रिया पर क्लिक करें।
    6. संवाद बॉक्स में प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटर पर क्लिक करें, स्रोत छवि को पहले के रूप में चुनें और दूसरी छवि को कॉपी के रूप में चुनें। दोनों छवियों का प्रतिच्छेदन बनाने के लिए AND का उपयोग करें। अन्य चैनल छवि के लिए एक ही चरण दोहराएँ।
    7. संवहनी क्षेत्र के बाहर सिग्नल विश्लेषण के लिए, एक अनछुई कॉपी की गई छवि खोलें और फ्रीहैंड आरओआई टूल के साथ सिग्नल के संवहनी क्षेत्र को हटा दें।
    8. Analyze > Set Measurements पर जाकर वांछित पैरामीटर सेट करें। सुनिश्चित करें कि क्षेत्र, एकीकृत घनत्व और मीन ग्रे वैल्यू की जाँच की गई है।
    9. अब विश्लेषण > माप द्वारा विश्लेषण करें। माप के साथ एक विंडो पॉप अप होगी। डेटा को स्प्रेडशीट में कॉपी करें।
    10. अब छवि के एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें जिसमें कोई प्रतिदीप्ति नहीं है। यह पृष्ठभूमि होगी।
    11. उस क्षेत्र के लिए माप > विश्लेषण करें पर क्लिक करें. स्प्रेडशीट में डेटा कॉपी करें।
    12. परिणामी छवि को फ़ाइल के रूप में सहेजें > पुनर्माप या प्रकाशन उद्देश्यों के लिए फ़ाइल प्रकार का विश्लेषण करें > के रूप में सहेजें .

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Representative Results

यहां, हमने कपाल खिड़की की सर्जरी की और जीबीएम (एन = 5) के एनएसजी माउस मॉडल में सी 6 कोशिकाओं को उकेरा। खिड़की के निर्माण में शामिल सभी घटकों के बीच एक उचित सील (चित्रा 1 ए) लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए खिड़कियों के स्थायित्व को सुनिश्चित करेगा और इसके अतिरिक्त, रुग्णता को कम करेगा। विवो 2 पी-आईवीएम (चित्रा 2) में के लिए अनुकूलित मंच का उपयोग करके, हम किसी भी प्रमुख गति कलाकृतियों के बिना 2 घंटे तक संज्ञाहरण के तहत जानवरों की छवि बना सकते हैं। जीबीएम-असर चूहों में नैनोकणों के अंतःशिरा आवेदन के लगभग 10 मिनट बाद, 2 पी-आईवीएम ट्यूमर के क्षेत्र में जहाजों के हरे, फ्लोरोसेंट संकेत को दर्शाता है, जो एफआईटीसी-लेबल वाले नैनोकणों के इंट्रा-संवहनी स्थानीयकरण के अनुरूप है। रक्त वाहिकाओं के बाहर केवल थोड़ी मात्रा में हरे-फ्लोरोसेंट सिग्नल का उल्लेख किया जाता है, जो एनपी(चित्रा 3ए)की शुरुआत अपव्यय का संकेत देता है। एक्स्ट्रावास्कुलर स्पेस से उत्पन्न होने वाले FITC सिग्नल में वृद्धि देखी जाती है, जो उन्नत एक्सट्रावेशन (चित्र 3B) के अनुरूप है।

Figure 1
चित्र 1. कपाल खिड़की प्लेसमेंट, क्रैनियोटॉमी, आरोपण और इमेजिंग। (ए) एक कपाल खिड़की के शारीरिक प्लेसमेंट का क्रॉस-सेक्शन। चूंकि हेड बार धातु-मुक्त है, इसलिए दो-फोटॉन इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के अलावा चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग या चुंबकीय कण इमेजिंग करना संभव है। (बी) अवलोकन (ऊपरी पंक्ति) और क्रैनियोटॉमी (बाएं), सेल आरोपण (मध्य), और 2-फोटॉन इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (दाएं) का एक विस्तृत दृश्य (निचली पंक्ति)। खोपड़ी खोलने पर, सतही रक्तस्राव होता है (बाएं) और जल्दी से पुन: अवशोषित (मध्य) होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. मंच का कंप्यूटर-असिस्टेड डिज़ाइन (CAD)। विवो 2-फोटॉन इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी में उपयोग किए जाने वाले चरण का सीएडी, जिसमें एक बाइट बार, हेड बार स्थिरीकरण और ऊंचाई और कोण समायोजन के लिए शिकंजा शामिल हैं। 3D CAD फ़ाइल पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में पाई जा सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. विवो 2-फोटॉन इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी छवियों में। छवियों (ए) 10 मिनट और (बी) अंतःशिरा नैनोपार्टिकल प्रशासन के बाद 24 घंटे का अधिग्रहण किया. जबकि जीबीएम कोशिकाएं लाल स्पेक्ट्रम (बाएं) में फ्लोरोसेंट संकेतों का उत्सर्जन करती हैं, मस्तिष्क के ऊतकों में नैनोकणों को हरे (दाएं) में देखा जाता है। # अतिरिक्त एनपी को इंगित करता है, * एक रक्त वाहिका को इंगित करता है। केवल कणों की एक सीमित संख्या में extravasation आया है और एनपी प्रशासन के बाद 10 मिनट ट्यूमर कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में दिखाई दे रहे हैं. जीबीएम कोशिकाओं के क्षेत्र में कणों की एक बहुतायत दिखाई देती है, जो एनपी प्रशासन के बाद 24 घंटे के अपव्यय का सुझाव देती है। नैनोकणों में फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) और आयरन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल्स (Ferumoxytol) होते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षिप्ताक्षर: 2 पी-आईवीएम: 2-फोटॉन इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी, आरएफपी: लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीबीएम: ग्लियोब्लास्टोमा, एफआईटीसी: फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट, एनपी: नैनोकण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: चरण की 3 डी सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम फ्लोरोसेंट-लेबल वाले आयरन ऑक्साइड एनपी के ट्यूमर वितरण का मूल्यांकन करने के लिए एक कपाल खिड़की के माध्यम से 2 पी-आईवीएम का उपयोग करके विवो एनपी ट्रैकिंग में वास्तविक समय के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस प्रक्रिया के लिए शल्य चिकित्सा तकनीक एक स्थिर हाथ और उन्नत प्रयोगात्मक शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता है. जीवित पशु अनुभव के लिए आगे बढ़ने से पहले शवों या प्रेत का उपयोग करने का अभ्यास करना उचित है। एक विकल्प के रूप में, Hoeferlin एट अल थर्मल क्षति को कम करने, शल्य चिकित्सा तकनीक परिवर्तनशीलता को कम करने, और सर्जरी22 मानकीकरण करने के लिए एक रोबोट ड्रिल लागू किया.

खिड़की का आकार एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है। एक बड़ी खिड़की 2P-आईवीएम के साथ ट्यूमर के एक बड़े हिस्से की इमेजिंग सक्षम होगी। साहित्य में, 3-7 मिमी के बीच के आकार23 वर्णित किया गया है. हालांकि, बड़ी खिड़कियां मस्तिष्क वक्रता के लिए समायोजित नहीं कर सकती हैं, जिससे क्षेत्रीय दबाव24 बढ़ सकता है। इस संयम को दूर करने के लिए,25 के बजाय एक तथाकथित "ग्लास खोपड़ी" का उपयोग किया जा सकता है। पारंपरिक ग्लास खिड़कियों की तुलना में, यह विधि घुमावदार ग्लास का उपयोग करती है, मस्तिष्क वक्रता को समायोजित करती है और इस प्रकार प्रांतस्था पर फोकल दबाव को कम करते हुए बड़ी खिड़कियों के निर्माण की अनुमति देती है। इस प्रकार का घुमावदार ग्लास व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, और इसमें केवल 2P-IVM में सीमित अनुप्रयोग हैं, क्योंकि घुमावदार सतह प्रतिबिंब कलाकृतियों का कारण बनती है, खिड़की के उस क्षेत्र को सीमित करती है जिसे चित्रित किया जा सकता है। एक अन्य विकल्प एक सिलिकॉन आधारित खिड़की24 है. एक ओर, यह विधि बनाई जाने वाली खिड़की के आकार और रूप के बारे में अधिक लचीलापन प्रदान करती है। इसके अलावा, क्लासिक ग्लास खिड़कियों के लिए खिड़की की विफलता और सूजन दर के संदर्भ में तुलनीय परिणाम बताए गए हैं। दूसरी ओर, बहुलक आधारित खिड़कियों में 2 फोटॉन इमेजिंग गुणवत्ता यह लंबी अवधि के अनुप्रयोगों26 के लिए संभव नहीं बनाने, कांच खिड़कियों में की तुलना में तेजी से कम करने के लिए दिखाया गया है. एक पतली खोपड़ी कपाल खिड़की एक और विकल्प का प्रतिनिधित्व करती है। शास्त्रीय कांच की खिड़की की तुलना में कम आक्रामक होने के बावजूद, यह यहां वर्णित उसी तकनीक का उपयोग करके जीबीएम सेल आरोपण की अनुमति नहीं देता है। इसके अतिरिक्त, एक सुसंगत खोपड़ी मोटाई प्राप्त करना मुश्किल है, और इसके परिणामस्वरूप, यह 2पी-आईवीएम27 में महत्वपूर्ण कलाकृतियों का कारण बन सकता है।

सेल लाइन और जीबीएम कोशिकाओं की मात्रा प्रत्यारोपित किया जा रहा है अन्य महत्वपूर्ण विचार हैं जब अध्ययन समयरेखा की योजना बना रहे हैं. सी 6 चूहा ग्लियोमा सेल लाइन जीबीएम अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों में से एक है। चूहों और चूहों में, 5 x 104 और 5 x 106 के बीच सेल संख्या इंट्राक्रैनील आरोपण 27,28,29,30,31 के लिए सूचित किया गया है. एक सामान्य नियम के रूप में, जब कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्रत्यारोपित, तेजी से ट्यूमर के विकास की उम्मीद की जा रही है. इस प्रोटोकॉल में, 1 एक्स 105 कोशिकाओं प्रत्यारोपित किया गया था और इमेजिंग आरोपण के बाद 11 और 12 दिनों पर प्रदर्शन किया गया था. Xin एट अल BALB/c नग्न चूहों में 1 x 105 C6 कोशिकाओं प्रत्यारोपित और दिन 7 पोस्ट-आरोपण पर एमआरआई में उन्नत जीबीएम का पता लगाने और 15 दिनों के बाद मृत्यु दर में वृद्धि की सूचना दी30. इसकी तुलना में, जिया एट अल कोशिकाओं की एक उच्च संख्या (1 एक्स 106) और एक ही माउस तनाव का इस्तेमाल किया और एमआरआई में दिन 7 पर एक छोटे से ट्यूमर द्रव्यमान का पता लगाया थोड़ा बाधित रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के साथ, जैसा कि जीबीएम ऊतक32 में एक पीला इवांस नीले दाग द्वारा प्रदर्शित किया गया है। 14 वें दिन, इवांस ब्लू दाग 7 दिन की तुलना में अधिक मजबूत था, यह दर्शाता है कि बीबीबी अत्यधिक बाधित था। बदले में, ट्यूमर की वृद्धि भी प्रभावित करती है कि जानवरों को प्रयोग में कितनी देर तक रखा जा सकता है। यह अनुदैर्ध्य इमेजिंग अध्ययन के लिए पशु कल्याण का एक महत्वपूर्ण विचार है। क्रोनिक कपाल खिड़कियों आरोपण 26 के बाद अप करने के लिए 6 महीने के लिए इमेजिंग के लिए उपयुक्त होने की सूचना मिलीहै.

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नैनोकणों लौह ऑक्साइड और फ्लोरोफोरे घटकों से मिलकर बनता है. संभावित अनुप्रयोगों में उपन्यास चिकित्सीय दवाओं, सेलुलर चिकित्सा विज्ञान, और ट्यूमर वास्कुलचर और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर हस्तक्षेप के ट्यूमर वितरण की जांच शामिल है। विभिन्न दवा उम्मीदवारों और संयोजन उपचारों का मूल्यांकन सेलुलर और आणविक स्तर पर किया जा सकता है। एनपी का लौह ऑक्साइड घटक 2 पी-आईवीएम के अलावा एमआरआई या चुंबकीय कण इमेजिंग के साथ मल्टीमॉडल इमेजिंग की अनुमति देता है। एमआरआई एक चिकित्सकीय प्रासंगिक इमेजिंग साधन का प्रतिनिधित्व करता है, अपने शारीरिक संकल्प intravital माइक्रोस्कोपी33 की है कि करने के लिए नीच है.

इस पद्धति की कुछ सीमाएँ भी हैं। माउस ब्रेन एटलस के अनुसार मस्तिष्क निर्देशांक C57BL/6J चूहों के लिए मानकीकृत हैं और इसे माउस स्ट्रेन, लिंग और उम्र के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, दो फोटॉन इमेजिंग के साथ, लगभग 450 माइक्रोन की केवल एक सीमित गहराई 9 पहुँचा जा सकताहै. इसलिए, 2P-IVM के साथ ट्यूमर का केवल आंशिक लक्षण वर्णन संभव है, और ट्यूमर विशेषताओं में क्षेत्रीय अंतर को याद किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एनपी प्रशासन के बाद केवल दो समय बिंदु शामिल किए गए थे। अंतःशिरा प्रशासन के बाद अधिक समय बिंदुओं सहित भविष्य के अध्ययन, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में एनपी के स्थानिक व्यवहार के अधिक विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देंगे।

निष्कर्ष निकालने के लिए, हमने जीबीएम के माउस मॉडल में 2 पी-आईवीएम का उपयोग करके फ्लोरोसेंट-लेबल वाले लौह ऑक्साइड नैनोकणों के ट्यूमर वितरण का मूल्यांकन किया। इस विधि को अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में फिट करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में विवो मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम स्टैनफोर्ड वू त्साई न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सर्विस, स्टैनफोर्ड सेंटर फॉर इनोवेशन इन इन विवो इमेजिंग (एससीआई 3) - छोटे पशु इमेजिंग सेंटर, एनआईएच एस 10 साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट (S10RR026917-01, पीआई माइकल मोस्ले, पीएचडी), और पोर्टर ड्राइव में स्टैनफोर्ड प्रीक्लिनिकल इमेजिंग सुविधा को इस परियोजना के लिए उपकरण और बुनियादी ढांचा प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान, अनुदान संख्या R01HD103638 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम Schnitzer समूह, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं; ज़ूओ लैब, सांता क्रूज़ विश्वविद्यालय; और न्यूरोवास्कुलर इमेजिंग प्रयोगशाला, बोस्टन फोटोनिक सेंटर, बोस्टन विश्वविद्यालय, दो-फोटॉन इमेजिंग और कपाल खिड़की मॉडल पर शैक्षिक चर्चा के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride infusion solution Baxter Corp 533-JB1301P

Dulbecco's Modified Eagle Medium		 Invitrogen 11965-092
1 mL syringes BD Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS Thermo fisher Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML
2-photon microscope Prairie Technologies, Bruker Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70% Medline Industries, LP MDS093810
Alcohol, spray bottle Decon Labs Inc Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil Reynold Brands Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine Patterson Scientific SAS3
Anesthesia monitoring  Kent Scientific  MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid Invitrogen 15240-096
Betadine applicators Professional Disposables International, Inc S41125
Biopsy punch, 5 mm  Miltex Size 5
Buprenorphine sustained release Zoo Pharm Bup SR Lab, 1.0 mg/mL A generic drug can be used instead. 
C6 rat glioma cell line ATCC (American Tissue Culture Collection) CCL-107
Cannulas BD 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen Pfizer  Rimadyl, 50 mg/ml A generic drug can be used instead. 
Cefazoline Sagent Pharmaceuticals 25021-101-10, 1 g/vial A generic drug can be used instead. 
Cell strainer, 40 µm Fisher Scientific 87711
Cotton tip applicators, 6”  Dyad Medical Sourcing, LLC HCS1005
Dental cement Stoelting Co 51459 Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone Bimeda 138RX, 2 mg/mL A generic drug can be used instead. 
DietGel ClearH2O Recovery, 72-06-502
Drape  Cardinal Health Bio Shield Wrap
Drill Saeyang Microtech Escort Pro, B08350
Drill tips  Hager & Meissinger GmbH REF310104001001005 Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software National Institute of Health https://imagej.net/software/fiji/
Forceps Fisher Scientific 13-812-41
Gauze Fisher HealthCare Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam  Ethicon Inc.  Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator  Cellpoint Scientific  Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter Fisher Scientific Menzel Cover glass 
Gloves, non-sterile Fisher Scientific Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile Medline Industries, LP MDS104070
Hair removal cream Church & Dwight Nair Hair remover lotion 
Hamilton syringe Hamilton Company Inc Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg Fisher Scientific PI88284
Head bar Hongway 5 mm inner diameter O-rings
Heating pad Stoelting Co.  Rodent warmer X2
Insulin syringes Exel International Medical Products  29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles Covis Pharma GmbH Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane Dechra 26675-46-7
Mice Jackson Laboratories NSG, Strain 005557
Microscope (surgery) Seiler Medical Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles Custom Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment Major pharmaceuticals Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen Linde Gas & Equipment Inc.  High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups Georgia-Pacirif Consumer Products Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing Braintree Scientific 50-195-5494
Scale Ohaus Corp CR2200
Scalpel Integra Life Sciences Production Corp Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors Fisher Scientific 13-804-18
Sealant Henkel Corp Loctite 4014
Single use lab gown High Tech Conversions 17-444-081
Stereotactic frame Stoelting Co.  Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems Fisher Scientific S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box N/A N/A
Surgical gloves Cardinal Health 19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive 3M Animal Care Prodcuts 1469SB
Tail vein cathether Custom Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing 
TrypLE Express (1x), no phenol red Invitrogen 12604-039
Ultraviolett torch Spring sunshine technology Consciot

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References

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Nernekli, K., Mangarova, D. B., Shi, … More

Nernekli, K., Mangarova, D. B., Shi, Y., Varniab, Z. S., Chang, E., Tikenogullari, O. Z., Pisani, L., Tikhomirov, G., Wang, G., Daldrup-Link, H. E. Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model. J. Vis. Exp. (205), e66304, doi:10.3791/66304 (2024).

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