וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ”ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .
פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 1012 חלקיקים נגיפיים / מ”ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .
וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A 1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV4 מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס5. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs6, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון שהוא אינו פתוגני בבני אדם, מאפשר ביטוי של טרנסגן בסוגי תאים מתחלקים ולא מתחלקים רבים, ויש לו השפעות אימונוגניות מוגבלות7.
כחברים בסוג dependoparvovirus, הייצור של rAAVs מסתמך על ביטוי של גנים מסייעים נוכח אדנווירוס או וירוס הרפס סימפלקס8. פותחו מספר אסטרטגיות לייצור rAAV, אך ייצור בתאי HEK293 שעברו טרנספורמציה באמצעות הגנים המסייעים E1A/E1B אדנו-ויראליים הוא השיטה המבוססת ביותר המשמשת כיום9. הגישה הכללית של ייצור rAAV מתחילה עם טרנספקציה של תאי HEK293 עם שלושה פלסמידים המכילים את הטרנסגן בתוך חזרות מסוף הפוך (ITR), AAV rep ו cap גנים, וגנים מסייעים אדנו-ויראליים נוספים, בהתאמה. שבעים ושתיים שעות לאחר הטרנספקציה, תאים נקצרים ומעובדים כדי לטהר rAAV המכיל את הטרנסגן.
בפיתוח וקטורי rAAV חדשים למטרות טיפוליות, מטרה עיקרית היא לייצר וקטורים בעלי יעילות התמרה מוגברת. עלייה ביעילות ההתמרה של תאי המטרה פירושה ירידה במינון הקליני הדרוש של rAAV, ובכך להקטין את הסבירות להשפעות אימונוגניות שליליות החל מנטרול בתיווך נוגדנים ועד רעילות חריפה10,11. כדי לשפר את יעילות הטרנסדוקציה של וקטורי rAAV, ניתן לבצע שינויים בגנום הארוז או בקפסיד. שיטות מעשיות לכוונון יעילות הטרנסדוקציה באמצעות תכנון גנום ארוז כוללות שילוב של מקדמים חזקים וספציפיים לרקמות, בחירה מתחשבת של רכיבי עיבוד mRNA, ואופטימיזציה של רצף קידוד לשיפור יעילות התרגום12. שינויים בקפסיד נעשים במטרה להגדיל את הטרופיזם עבור סוגי תאים אנושיים מטרה. מאמצים לפיתוח קפסידים וקטוריים חדשים של העברת טרנסגנים rAAV מאופיינים בדרך כלל בהתמקדות בתכנון רציונלי של קפסידים AAV עם מוטציות ספציפיות המכוונות לקולטני תאים ספציפיים או באבולוציה מכוונת לזיהוי קפסידים עם טרופיזם עבור סוגי תאים ספציפיים מספריות קפסיד קומבינטוריות בעלות מורכבות גבוהה מבלי להתמקד בקולטן ספציפי אחד (אם כי קבוצות מסוימות משלבות גישות אלה)13, 14,15. בגישת האבולוציה המכוונת, ספריות קפסיד קומבינטוריות נבנות באמצעות עמוד שדרה סרוטיפי מסוים עם אזורים משתנים מוטנטים בצד החיצוני של הקפסיד16. ספריות קפסיד קומבינטוריות בנויות לעתים קרובות מסרוטיפים AAV שאינם מקורם בבני אדם, מה שמקטין את הסיכון לחסינות קיימת במהלך השימוש הקליני10. לכן, שיטות טיהור שניתן ליישם על כל סרוטיפ הן אידיאליות כדי לבטל את הצורך אופטימיזציה ספציפית לסרוטיפ עבור הסרוטיפים הפחות נפוצים המשמשים עמוד שדרה עבור ספריות אלה.
צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול משמשת לטיהור טיטרים גבוהים של rAAV עם זיהומיות גבוהה17. בפרוטוקול זה, rAAV מיוצר בתרבית תאי תרחיף כדי להפחית את כמות העבודה הדרושה לייצור טיטרים גדולים של AAV. שלב צנטריפוגה נכלל גם כדי לנקות את התא lysate כדי להפחית את נוכחותם של חלבונים מזהמים ולהפחית את הסיכון של משקעים וירוס. פרוטוקול זה הוא שיטה חסכונית לייצור תכשירים של rAAV ברמת טוהר גבוהה המתאימים לשימוש פרה-קליני.
פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז19. מאוחר יותר…
The authors have nothing to disclose.
ללא.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |