In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제
Summary
아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.
Abstract
이 프로토콜은 1999년에 처음 기술된 AAV를 정제하는 혈청형에 구애받지 않는 방법인 요오드릭사놀 밀도 구배 원심분리에 의한 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 생산 및 정제에 대해 설명합니다. rAAV 벡터는 다양한 인간 세포 유형에 전이유전자를 전달하기 위한 유전자 치료 응용 분야에서 널리 사용됩니다. 이 연구에서 재조합 바이러스는 전이유전자, 벡터 캡시드 및 아데노바이러스 도우미 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 현탁 배양에서 Expi293 세포를 transfection하여 생산됩니다. 요오딕사놀 밀도 구배 원심분리는 입자 밀도를 기반으로 전체 AAV 입자를 정제합니다. 또한, 현재 유비쿼터스가 된 이 방법론에는 총 바이러스 수율을 높이고, 단백질 오염으로 인한 침전 위험을 줄이고, 최종 바이러스 생성물을 더욱 농축하기 위한 세 가지 단계가 포함되어 있습니다: 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 염화나트륨 용액을 사용한 세포 배지에서 바이러스 입자 침전, 요오드릭산올 밀도 구배 원심분리의 두 번째 라운드 도입, 원심 필터를 통한 완충액 교환. 이 방법을 사용하면 in vivo 사용을 위한 탁월한 순도의 1012 바이러스 입자/mL 범위의 역가를 일관되게 달성할 수 있습니다.
Introduction
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터는 척수성 근위축증, 망막 이영양증 및 혈우병 A 1,2,3을 포함한 유전 질환 치료에 널리 사용되는 도구입니다. rAAV 벡터는 선형 단일 가닥 4.7kb DNA 게놈을 가진 작고 외피가 없는 이십면체 바이러스인 야생형 AAV4에 존재하는 바이러스 유전자가 없도록 조작되었습니다. AAV는 1960년대에 아데노바이러스 제제의 오염물질로 처음 발견되었다5. AAV는 ITR을 제외하고 최대 4.9 kb로 패키징할 수 있는 전이유전자의 크기를 제한하는 작은 캡시드 크기에도 불구하고6, 인간에서 비병원성이고, 많은 분열 및 비분열 세포 유형에서 전이유전자 발현을 허용하며, 면역원성 효과가 제한적이기 때문에 전이유전자 전달에 유용하다7.
레의존파보바이러스(dependoparvovirus) 속의 구성원인 rAAV의 생산은 아데노바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)에 존재하는 도우미 유전자의 발현에 의존한다8. rAAV를 생산하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었지만, 아데노바이러스 E1A/E1B 도우미 유전자로 형질전환된 HEK293 세포에서의 생산이 오늘날 가장 확립된 방법이다9. rAAV 생산의 일반적인 접근법은 HEK293 세포를 역말단 반복(ITR) 내에서 전이유전자를 포함하는 3개의 플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자, 추가 아데노바이러스 도우미 유전자로 transfection하는 것으로 시작됩니다. 형질주입 후 72시간 후, 세포를 수확하고 처리하여 전이유전자를 포함하는 rAAV를 정제합니다.
치료 목적을 위한 새로운 rAAV 벡터의 개발에서 주요 목표는 형질도입 효율이 향상된 벡터를 생산하는 것입니다. 표적 세포의 형질도입 효율의 증가는 rAAV의 필요한 임상적 투여량의 감소를 의미하며, 따라서 항체 매개 중화에서 급성 독성에 이르는 면역원성 부작용의 가능성을 감소시킨다10,11. rAAV 벡터의 형질도입 효능을 개선하기 위해, 패키징된 게놈 또는 캡시드를 변경할 수 있습니다. 패키징된 게놈 디자인을 통해 형질도입 효능을 조정하는 실행 가능한 방법에는 강력한 조직 특이적 promoter의 통합, mRNA 처리 요소의 신중한 선택, 번역 효율 향상을 위한 코딩 서열 최적화가 포함됩니다12. 캡시드에 대한 변경은 표적 인간 세포 유형에 대한 영양성을 증가시키는 것을 목표로 이루어집니다. 새로운 rAAV 전이유전자 전달 벡터 캡시드를 개발하기 위한 노력은 일반적으로 특정 세포 수용체를 표적으로 하는 특정 돌연변이를 가진 AAV 캡시드의 합리적인 설계에 초점을 맞추거나, 하나의 특정 수용체를 표적으로 하지 않고 고복잡성 조합 캡시드 라이브러리에서 특정 세포 유형에 대한 영양성을 가진 캡시드를 식별하기 위한 유도 진화에 초점을 맞추는 것이 특징입니다(일부 그룹은 이러한 접근 방식을 결합하지만)13, 14,15. 유도 진화 접근법에서, 조합 캡시드 라이브러리는 캡시드 외장(16) 상에 돌연변이된 가변 영역들을 갖는 특정 혈청형 골격을 사용하여 구성된다. 조합 캡시드 라이브러리는 종종 인간에서 유래하지 않은 AAV 혈청형으로 구성되며, 임상 사용 중 기존 면역의 위험을 감소시킨다10. 따라서 모든 혈청형에 적용할 수 있는 정제 방법은 이러한 라이브러리의 중추 역할을 하는 덜 일반적으로 사용되는 혈청형에 대한 혈청형 특이적 최적화의 필요성을 제거하는 데 이상적입니다.
요오딕사놀 밀도 구배 원심분리는 높은 감염성을 가진 rAAV의 높은 역가를 정제하는 데 이용된다17. 이 프로토콜에서 rAAV는 AAV의 큰 역가를 생산하는 데 필요한 노동력을 줄이기 위해 부유 세포 배양에서 생산됩니다. 오염 단백질의 존재를 줄이고 바이러스 침전의 위험을 줄이기 위해 세포 용해물을 청소하기 위한 원심분리 단계도 포함됩니다. 이 프로토콜은 전임상 사용에 적합한 고순도 rAAV 제제를 생산하는 비용 효율적인 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이중 요오드산올 밀도 구배 정제 프로토콜은 수용체 특이성에 관계없이 모든 AAV 돌연변이 변이체에 적용할 수 있기 때문에 보편적인 방법입니다. AAV 정제의 초기 방법은 입자 밀도에 의존하고 CsCl에서의 isopycnic 원심분리 및 연속 자당 밀도 구배 원심분리를 포함하였다19. 나중에, 혈청형 특이적 접근법이 개발되었는데, 이는 세파로스 컬럼20에 결합된 단클론 항…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
Riferimenti
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