Adenoassosiert virus produseres i suspensjonscellekultur og renses ved dobbel iodixanoltetthetsgradientsentrifugering. Trinn er inkludert for å øke det totale virusutbyttet, redusere risikoen for virusutfelling og ytterligere konsentrere det endelige virusproduktet. Forventede endelige titre når 1012 virale partikler/ml og er egnet for preklinisk in vivo bruk.
Denne protokollen beskriver rekombinant adenoassosiert virus (rAAV) produksjon og rensing ved iodixanoltetthetsgradientsentrifugering, en serotype-agnostisk metode for rensing av AAV først beskrevet i 1999. rAAV-vektorer er mye brukt i genterapiapplikasjoner for å levere transgener til forskjellige humane celletyper. I dette arbeidet produseres det rekombinante viruset ved transfeksjon av Expi293-celler i suspensjonskultur med plasmider som koder for transgenet, vektorkapsid og adenovirale hjelpergener. Sentrifugering av iodiksanolgradient renser fulle AAV-partikler basert på partikkeltetthet. I tillegg er tre trinn inkludert i denne nå allestedsnærværende metodikken for å øke det totale virusutbyttet, redusere risikoen for nedbør på grunn av forurensende proteiner, og videre konsentrere det endelige virusproduktet, henholdsvis: utfelling av virale partikler fra cellemedier ved bruk av en løsning av polyetylenglykol (PEG) og natriumklorid, innføring av en andre runde av sentrifugering av jodixanoltetthetsgradient, og bufferutveksling via et sentrifugalfilter. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å konsekvent oppnå titere i området 1012 virale partikler/ml eksepsjonell renhet for in vivo bruk.
Rekombinante adenoassosierte virale (rAAV) vektorer er mye brukte verktøy for behandling av genetiske sykdommer, inkludert spinal muskelatrofi, retinal dystrofi og hemofili A 1,2,3. rAAV-vektorer er konstruert for å mangle virusgener tilstede i villtype AAV4, et lite, ikke-konvolutt icosahedral virus med et lineært enkeltstrenget 4,7 kb DNA-genom. AAV ble først oppdaget på 1960-tallet som forurensning av adenoviruspreparater5. Til tross for den lille kapsidstørrelsen, som begrenser størrelsen på transgenet som kan pakkes til maksimalt 4,9 kb unntatt ITR6, er AAV nyttig for transgenfødsel fordi det er ikke-patogent hos mennesker, tillater ekspresjon av transgen i mange delende og ikke-delende celletyper, og har begrensede immunogene effekter7.
Som medlemmer av slekten dependoparvovirus er produksjonen av rAAVs avhengig av uttrykket av hjelpergener tilstede i adenovirus eller herpes simplex-virus8. Det er utviklet flere strategier for å produsere rAAV, men produksjon i HEK293-celler transformert med adenovirale E1A/E1B-hjelpergener er den mest etablerte metoden som brukes i dag9. Den generelle tilnærmingen til rAAV-produksjon begynner med transfeksjon av HEK293-celler med tre plasmider som inneholder transgenet i henholdsvis inverterte terminale repetisjoner (ITR), AAV-rep – og cap-gener og ytterligere adenovirale hjelpergener. Syttito timer etter transfeksjon høstes og behandles celler for å rense rAAV som inneholder transgenet.
I utviklingen av nye rAAV-vektorer for terapeutiske formål er et hovedmål å produsere vektorer med økt transduksjonseffektivitet. En økning i transduksjonseffektiviteten til målceller vil bety en reduksjon i den nødvendige kliniske dosen av rAAV, og dermed redusere sannsynligheten for uønskede immunogene effekter fra antistoffmediert nøytralisering til akutt toksisitet10,11. For å forbedre transduksjonseffektiviteten til rAAV-vektorer, kan endringer gjøres i det pakkede genomet eller til kapsiden. Levedyktige metoder for å justere transduksjonseffektiviteten via pakket genomdesign inkluderer inkorporering av sterke og vevsspesifikke promotorer, gjennomtenkt utvalg av mRNA-prosesseringselementer og kodingssekvensoptimalisering for å forbedre oversettelseseffektiviteten12. Endringer i kapsidet er gjort med sikte på å øke tropismen for målhumane celletyper. Arbeidet med å utvikle nye rAAV-transgene leveringsvektorkapsider er generelt preget av fokus på enten rasjonell design av AAV-kapsider med spesifikke mutasjoner rettet mot spesifikke cellereseptorer eller rettet evolusjon for å identifisere kapsider med tropisme for spesifikke celletyper fra kombinatoriske kapsidbiblioteker med høy kompleksitet uten å målrette mot en spesifikk reseptor (selv om noen grupper kombinerer disse tilnærmingene)13, 14,15. I den regisserte evolusjonstilnærmingen konstrueres kombinatoriske kapsidbiblioteker ved hjelp av en bestemt serotyperyggrad med muterte variable regioner på kapsidets eksteriør16. Kombinatoriske kapsidbiblioteker er ofte konstruert fra AAV-serotyper som ikke stammer fra mennesker, noe som reduserer risikoen for allerede eksisterende immunitet ved klinisk bruk10. Derfor er rensemetoder som kan brukes på enhver serotype ideelle for å eliminere behovet for serotypespesifikk optimalisering for de mindre brukte serotypene som tjener som ryggrad for disse bibliotekene.
Iodixanol tetthet gradient sentrifugering benyttes til å rense høye titere av rAAV med høy smittsomhet17. I denne protokollen produseres rAAV i suspensjonscellekultur for å redusere arbeidsmengden som trengs for å produsere store titere av AAV. Et sentrifugeringstrinn er også inkludert for å klarcellelysat for å redusere tilstedeværelsen av forurensende proteiner og redusere risikoen for virusutfelling. Denne protokollen er en kostnadseffektiv metode for å produsere preparater av rAAV med høy renhet egnet for preklinisk bruk.
Den doble renseprotokollen for jodixanolgradient er den universelle metoden fordi den kan brukes på alle AAV-muterte varianter, uavhengig av reseptorspesifisitet. Tidlige metoder for AAV-rensing baserte seg på partikkeltetthet og inkluderte isopycnic sentrifugering i CsCl og kontinuerlig sukrose tetthet gradient sentrifugering19. Senere ble serotypespesifikke tilnærminger utviklet, som benyttet monoklonale antistoffer bundet til Sepharose-kolonnene20. En ny tetthetsbaser…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |