Аденоассоциированный вирус получают в культуре суспензионных клеток и очищают центрифугированием с двойным градиентом плотности йодиксанола. Включены шаги по увеличению общего выхода вируса, снижению риска выпадения вируса в осадок и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта. Ожидаемые конечные титры достигают10-12 вирусных частиц/мл и пригодны для доклинического применения in vivo .
Этот протокол описывает получение и очистку рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) с помощью центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, серотип-независимого метода очистки AAV, впервые описанного в 1999 году. Векторы rAAV широко используются в генной терапии для доставки трансгенов к различным типам клеток человека. В данной работе рекомбинантный вирус получают путем трансфекции клеток Expi293 в суспензионной культуре с плазмидами, кодирующими трансген, векторный капсид и аденовирусные гены-хелперы. Центрифугирование с градиентом плотности йодиксанола очищает полные частицы AAV на основе плотности частиц. Кроме того, в эту повсеместную методологию включены три этапа для увеличения общего выхода вируса, снижения риска выпадения осадков из-за загрязнения белков и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта, соответственно: осаждение вирусных частиц из клеточных сред с использованием раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) и хлорида натрия, введение второго раунда центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, и замена буфера через центробежный фильтр. Используя этот метод, можно стабильно достигать титров в диапазоне10-12 вирусных частиц/мл исключительной чистоты для использования in vivo .
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) являются широко используемыми инструментами для лечения генетических заболеваний, включая спинальную мышечную атрофию, дистрофию сетчатки и гемофилию А 1,2,3. Векторы rAAV спроектированы таким образом, чтобы не иметь вирусных генов, присутствующих в AAV4 дикого типа, небольшом икосаэдрическом вирусе без оболочки с линейным одноцепочечным геномом ДНК размером 4,7 kb. AAV был впервые обнаружен в 1960-х годах в качестве контаминанта аденовирусных препаратов5. Несмотря на небольшой размер капсида, который ограничивает размер трансгена, который может быть упакован максимум до 4,9 кб, исключая РМЭ6, AAV полезен для доставки трансгенов, поскольку он непатогенен для человека, позволяет экспрессировать трансген во многих делящихся и неделящихся типах клеток и имеет ограниченные иммуногенные эффекты7.
Как представители рода dependoparvovirus, продукция rAAV зависит от экспрессии генов-хелперов, присутствующих в аденовирусе или вирусе простого герпеса8. Было разработано несколько стратегий производства rAAV, но продукция в клетках HEK293, трансформированная с помощью аденовирусных генов-хелперов E1A/E1B, является наиболее устоявшимся методом, используемымна сегодняшний день. Общий подход к получению rAAV начинается с трансфекции клеток HEK293 тремя плазмидами, содержащими трансген внутри инвертированных концевых повторов (ITR), генами AAV rep и cap , а также дополнительными аденовирусными генами-хелперами, соответственно. Через семьдесят два часа после трансфекции клетки собирают и обрабатывают для очистки rAAV, содержащего трансген.
При разработке новых векторов rAAV для терапевтических целей основной целью является получение векторов с повышенной эффективностью трансдукции. Повышение эффективности трансдукции клеток-мишеней означало бы снижение необходимой клинической дозы rAAV, тем самым снижая вероятность неблагоприятных иммуногенных эффектов в диапазоне от нейтрализации, опосредованной антителами, до острой токсичности10,11. Для повышения эффективности трансдукции векторов rAAV могут быть внесены изменения в упакованный геном или капсид. Жизнеспособные методы настройки эффективности трансдукции с помощью пакетного дизайна генома включают включение сильных и тканеспецифичных промоторов, тщательный отбор обрабатывающих элементов мРНК и оптимизацию кодирующих последовательностей для повышения эффективности трансляции12. Изменения капсида вносятся с целью увеличения тропизма для целевых типов клеток человека. Усилия по разработке новых капсидов вектора доставки трансгена rAAV, как правило, характеризуются сосредоточением внимания либо на рациональном дизайне капсидов AAV со специфическими мутациями, нацеленными на конкретные клеточные рецепторы, либо на направленной эволюции для идентификации капсидов с тропизмом для конкретных типов клеток из библиотек комбинаторных капсидов высокой сложности без нацеливания на один конкретный рецептор (хотя некоторые группы комбинируют эти подходы)13, 14,15. В подходе направленной эволюции комбинаторные библиотеки капсидов строятся с использованием определенного серотипического остова с мутировавшими вариабельными областями на внешней стороне капсида16. Комбинаторные библиотеки капсидов часто создаются из серотипов AAV, не происходящих от человека, что снижает риск ранее существовавшего иммунитета во время клинического использования10. Таким образом, методы очистки, которые могут быть применены к любому серотипу, идеально подходят для устранения необходимости в серотип-специфичной оптимизации для менее часто используемых серотипов, служащих основой для этих библиотек.
Центрифугирование с градиентом плотности йодиксанола используется для очистки высоких титров rAAV с высокой инфекционностью17. В этом протоколе rAAV производится в культуре суспензионных клеток, чтобы уменьшить количество труда, необходимого для получения больших титров AAV. Этап центрифугирования также включен для очистки клеточного лизата, чтобы уменьшить присутствие загрязняющих белков и снизить риск осаждения вируса. Данный протокол является экономически эффективным методом получения препаратов rAAV высокой чистоты, пригодных для доклинического применения.
Протокол очистки с двойным градиентом плотности йодиксанола является универсальным методом, поскольку он применим к любым мутантным вариантам AAV, независимо от их рецепторной специфичности. Ранние методы очистки AAV основывались на плотности частиц и включали изопикническое центрифу?…
The authors have nothing to disclose.
Никакой.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |