Summary
Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.
Abstract
Gentherapie is een krachtige technologie om nieuwe genen aan een patiënt af te leveren voor de behandeling van ziekten, of het nu gaat om het introduceren van een functioneel gen, het inactiveren van een toxisch gen of het leveren van een gen waarvan het product de biologie van de ziekte kan moduleren. De toedieningsmethode voor de therapeutische vector kan vele vormen aannemen, variërend van intraveneuze infusie voor systemische toediening tot directe injectie in het doelweefsel. Voor neurodegeneratieve aandoeningen is het vaak wenselijk om de transductie naar de hersenen en/of het ruggenmerg te verschuiven. De minst invasieve benadering om het hele centrale zenuwstelsel aan te pakken, is injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF), waardoor het geneesmiddel een groot deel van het centrale zenuwstelsel kan bereiken. De veiligste manier om een vector in de liquor af te leveren, is de lumbale intrathecale injectie, waarbij een naald in de lumbale stortbak van het ruggenmerg wordt ingebracht. Deze techniek, ook wel lumbaalpunctie genoemd, wordt veel gebruikt bij neonatale en volwassen knaagdieren en in grote diermodellen. Hoewel de techniek vergelijkbaar is tussen soorten en ontwikkelingsstadia, vereisen subtiele verschillen in grootte, structuur en elasticiteit van weefsels rond de intrathecale ruimte aanpassingen in de aanpak. Dit artikel beschrijft een methode voor het uitvoeren van lumbaalpunctie bij jonge ratten om een adeno-geassocieerde serotype 9-vector af te leveren. Hier werd 25-35 μL vector in de lumbale stortbak geïnjecteerd en werd een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter gebruikt om het transductieprofiel van elke injectie te evalueren. De voordelen en uitdagingen van deze aanpak worden besproken.
Introduction
De belofte van viraal-gemedieerde gentherapieën is de afgelopen jaren eindelijk gerealiseerd met de FDA-goedkeuring van behandelingen voor spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie, factor IX hemofilie, kanker en meer 1,2,3,4. Talloze andere therapieën zijn momenteel in ontwikkeling. Gentherapie heeft tot doel een therapeutisch gen af te leveren aan de cellen van een patiënt. De producten van dit nieuwe gen kunnen de ontbrekende activiteit van een gebrekkig endogeen gen vervangen, een toxisch gen remmen, kankercellen doden of een andere gunstige functie bieden.
Voor ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten, is het vaak wenselijk om de gentherapievector rechtstreeks aan het doelweefsel af te leveren. Niet-systemische benaderingen bieden twee voordelen: ze minimaliseren off-target bijwerkingen die kunnen worden veroorzaakt door perifere transductie, en ze verminderen de hoeveelheid vector die nodig is om adequate niveaus van transductie in hetdoelweefsel te bereiken aanzienlijk.
Er zijn verschillende benaderingen voor het afleveren van gentherapievectoren aan het CZS. Intraparenchymale injectie, de injectie van een vector rechtstreeks in het ruggenmerg of hersenweefsel, kan worden gebruikt voor toediening aan een bepaald gebied. Voor veel ziekten is echter een brede transductie van het CZS gewenst. Dit kan worden bereikt door een vector af te leveren aan de cerebrospinale vloeistof (CSF)5, de vloeistof die in en rond de hersenen en het ruggenmerg stroomt. Er zijn drie primaire manieren om vectoren aan de CSF te leveren. De meest invasieve benadering is intracerebroventriculaire toediening, waarbij een braamgat door de schedel wordt geboord en een naald door de hersenen in de laterale ventrikels wordt gebracht. Dit levert transductie op door de hele hersenen. De procedure kan echter intracraniële bloeding veroorzaken en de aanpak produceert over het algemeen slechts een beperkte transductie van het ruggenmerg6. Injectie in de cisterna magna aan de basis van de schedel is minder invasief, maar brengt het risico van schade aan de hersenstam met zich mee. Hoewel injectie in de cisterna magna vaak wordt gebruikt in dieronderzoek5, wordt het niet langer routinematig gebruikt in de kliniek7. Lumbaalpunctie is de minst invasieve benadering om toegang te krijgen tot de CSF. Dit omvat het plaatsen van een naald tussen twee lendenwervels en in de lumbale stortbak.
Lumbaalpunctie voor vectorafgifte wordt routinematig uitgevoerd bij volwassen ratten en muizen en bij neonatale muizen 8,9. De auteurs van deze studie hebben onlangs lumbaalpuncties uitgevoerd bij jonge ratten (28-30 dagen oud) om adeno-geassocieerde virusserotype 9 (AAV9) vectoren af te leveren. Bij volwassen ratten werd een neonatale lumbaalpunctienaald verticaal tussen de wervels L3 en L4 9geplaatst. De juiste plaatsing resulteert in een staartbeweging en CSF die omhoog stroomt in het naaldreservoir. Bij jonge ratten kon echter geen van deze uitlezingen worden bereikt. De auteurs probeerden vervolgens een procedure voor volwassen muizen aan te passen met behulp van een insulinespuit van 27 G die onder een hoek tussen L5 en L6 werd ingebracht10. Bij volwassen muizen, die doorgaans kleiner zijn dan P28-ratten, produceert dit geen staartbeweging, maar een onjuiste plaatsing van de naald is duidelijk te zien aan de terugstroming van het injectiemiddel. Bij juveniele ratten leidde deze aanpak er echter uniform toe dat het injectaat epiduraal werd toegediend, waarschijnlijk als gevolg van een verschillende elasticiteit tussen volwassen muizen en juveniele ratten van de weefsellagen rond het ruggenmerg. Vervolgens werden katheterbenaderingen geëvalueerd. In het bijzonder werd een katheter ingebracht via een incisie in de dura van de lumbale stortbak en tot aan het midden van het thoracale ruggenmerg; Deze aanpak leidde echter tot een aanzienlijke terugvloeiing van het injectaat uit de incisieplaats tijdens de bevalling. Pogingen om de katheter percutaan in de intrathecale ruimte te plaatsen met behulp van een geleidingsnaald waren ook niet succesvol. Vanwege de smalheid van de interlaminaire breedte zou de katheter waarschijnlijk de rostrale lamina raken en niet vooruitgaan.
Hier wordt een methode beschreven om een succesvolle en reproduceerbare toediening van de oplossing te bereiken via een lumbaalpunctie bij de jonge rat. Deze aanpak kan worden gebruikt voor virale vectoren, en waarschijnlijk ook voor cellen, geneesmiddelen en andere therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sprague-Dawley-ratten (28-30 dagen oud, massa in het bereik van ongeveer 90-135 g, mannetjes en vrouwtjes) werden in de huidige studie gebruikt.
1. Voorbereiding van de vector
- Ontdooi de AAV9-vector (zie Tabel met materialen) op ijs aan het begin van de procedure.
- Centrifugeer de microcentrifugebuis met de vector kort in een tafelcentrifuge om ervoor te zorgen dat alle vloeistof op de bodem van de buis zit.
- Tik voorzichtig op de microcentrifugebuis om ervoor te zorgen dat de oplossing goed gemengd is.
2. Voorbereiding van de herstelkooi
- Plaats een schone kooi op een elektrische deken (zie Materiaaltabel) zodat slechts de helft van de kooi in contact komt met de deken.
- Stel de temperatuur van de deken in op ~37 °C.
3. Voorbereiding van het chirurgisch platform
- Verwarm een isothermisch kussen (zie Materiaaltabel) tot 39 °C in een magnetron of een waterbad zodat de inhoud vloeibaar wordt.
- Plaats het isotherme kussen op het chirurgische platform en bedek het met een schoon absorberend bankkussen.
4. Voorbereiding van dieren
- Verdoof de ratten met isofluraan in een doorzichtige doos (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Begin de anesthesie-inductie met 5% isofluraan en verlaag 1% per minuut tot het 2% bereikt. Houd het dier nog 3 minuten op 2%.
- Verplaats de doos met het dier naar een zuurkast en open de doos.
OPMERKING: Dit beperkt de blootstelling van de chirurg aan de verdoving. - Verwijder het haar van de rug van het dier met behulp van een elektrische tondeuse.
OPMERKING: Als alternatief kan een ontharingscrème of handmatig scheermes en scheerschuim worden gebruikt. - Plaats het dier op het operatieplatform met zijn snuit in de neuskegel van de anesthesie.
OPMERKING: Het dier kan weer bij bewustzijn komen terwijl de vacht van de operatieplaats wordt verwijderd. Als dit gebeurt, verdoof het dan opnieuw zoals hierboven beschreven. - Breng bevochtigende oogzalf aan op elk oog om uitdroging van de hoornvliezen tijdens de procedure te voorkomen.
- Desinfecteer het operatiegebied met behulp van drie afwisselende toepassingen van povidonjodium- en isopropanoldoekjes.
- Injecteer de pijnstiller(s) subcutaan.
OPMERKING: Buprenorfine wordt over het algemeen gebruikt in een dosis van 0,01-0,05 mg/kg, elke 12 uur toegediend. Als alternatief kan een vorm met langzame afgifte van dit medicijn eenmaal worden gegeven in een dosis van 1 mg/kg om gedurende 72 uur voldoende pijnbestrijding te bieden. Raadpleeg de IACUC van de instelling voor hun richtlijnen met betrekking tot pijnbestrijding. - Injecteer 100 μL 1% lidocaïne subcutaan boven de processus spinosus L2 tot L6 om lokale anesthesie te bieden.
- Leg een rol keukenpapier of een buis met een diameter van 1,5 cm onder het dier, net rostraal tot aan de heupen. Dit helpt de wervelkolom te buigen, waardoor het gemakkelijker wordt om de naald tussen de twee laminae te steken.
- Plaats een gefenestreerd laken (zie Materiaaltabel) op het dier en centreer het venster over de lumbale wervelkolom.
5. Blootleggen van de lumbale wervelkolom
- Bevestig de diepte van de anesthesie door in elk van de poten van het dier te knijpen en te zoeken naar de afwezigheid van een ontwenningsreactie.
- Maak met een #11 scalpelmesje een incisie van ongeveer 3 cm lang in de huid langs de middellijn van L2 naar L6.
- Maak de huid los van de spier door een steriel gebogen chirurgische schaar tussen de spier en de huid te steken en vervolgens de punten te openen.
- Verwijder de fascia die de processus spinosus L2-L5 bedekt.
6. Laden van de spuit
- Pipetteer 25-35 μL van de vector (om de gewenste dosis te bereiken) in de dop van een steriele microcentrifugebuis.
- Zuig het volledige volume op in de insulinespuit.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er tijdens dit proces geen lucht wordt aangezogen.
7. Uitvoeren van de injectie
- Identificeer de processus spinosus L5 en L4.
OPMERKING: L6 bevindt zich direct tussen de twee darmbeenkammen en de processus spinosus moet gemakkelijk te identificeren zijn door te sonderen met een stomp instrument. Het instrument kan dan voorzichtig naar achteren worden geleid om de grenzen van de L5- en L4-processen te vinden. - Plaats een hand zo dat de duim zachtjes op de staart en een poot van het dier rust. Gebruik een vinger om de spuit stabiel te houden.
- Plaats de naald van de spuit zo dat deze zich links van de processus spinosus L5 bevindt en uitgelijnd is met het caudale uiteinde. Plaats de spuit zo dat deze zich ongeveer 30° ten opzichte van de middellijn en 30° boven het vlak van de tafel bevindt.
OPMERKING: Het kan nuttig zijn om een chirurgische microscoop te gebruiken om oriëntatiepunten beter te identificeren en de punt van de naald te positioneren. - Schuif de naald van de spuit ongeveer 8 mm naar voren, over de bovenkant van de L5-lamina en vervolgens onder de L4-lamina in de lumbale stortbak totdat het bot wordt geraakt. Correcte plaatsing zal resulteren in een spiertrekkingen van het been en/of de staart die kan worden gezien of gevoeld door de duim die op het been/de staart rust. Als er geen spiertrekkingen zijn, verwijder dan de naald en probeer de procedure vanaf de linkerkant. Als er nog steeds geen spiertrekkingen zijn, herhaal dan de procedure tussen L4/L3 en L3/L2 indien nodig.
- Druk de zuiger langzaam ongeveer 5 s in.
OPMERKING: Er kan een spiertrekkingen in het been of de staart optreden tijdens de injectie. - Houd de spuit ongeveer 30 s op zijn plaats nadat u de zuiger volledig hebt ingedrukt, zodat de druk in evenwicht kan komen en het terugvloeien van de injectie wordt geminimaliseerd wanneer de naald wordt teruggetrokken.
- Verwijder langzaam de naald.
8. Sluiten van de incisie
- Benader de randen van de incisie.
- Begin aan het ene uiteinde van de wond en gebruik een 4-0 hechting (zie Materiaaltabel) of chirurgische nietjes om de incisie te sluiten.
9. Herstel en monitoring
- Plaats het dier in de voorverwarmde kooi.
- Controleer het dier minstens elke 15 minuten totdat het volledig ambulant is.
OPMERKING: Dit duurt tussen de 15 minuten en 45 minuten. - Voer de komende drie dagen minstens dagelijks welzijnscontroles uit. Geef pijnstillers gedurende de eerste 2 dagen na de operatie of zoals vereist door de IACUC.
- Verwijder een week na de operatie de hechtingen of nietjes.
10. Vervolgprocedure
OPMERKING: Om de nauwkeurigheid van de injectietechniek te bepalen, injecteert u trypanblauwe kleurstof zoals hierboven beschreven en euthanaseert u het dier onmiddellijk (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en voert u een laminectomie uit om het resultaat te visualiseren.
- Terwijl het dier onder narcose blijft, euthanaseert u het door een dodelijke dosis pentobarbital toe te dienen via intraperitoneale injectie in een dosis van 150 mg/kg.
- Zodra de ademhaling en hartactiviteit stoppen, opent u de borstholte om de dood te verzekeren. Verleng de chirurgische incisie langs de rug naar de nek.
- Maak een incisie van 4 cm lang in de spier evenwijdig aan de wervelkolom aan beide zijden van de processus spinosus en blijf zo dicht mogelijk bij de processen.
- Verwijder met een fijne pincet of schaar de spier tussen de processus spinosus.
- Verwijder de processus spinosus van L6 tot aan de onderste thoracale wervelkolom met behulp van een rongeur (zie Materiaaltabel). Vermijd draaiende bewegingen, omdat dit de rongeuren kan beschadigen.
- Steek de onderste punt van de rongeur onder de L5 lamina en verwijder het bot dat over het ruggenmerg ligt door er meerdere "happen" uit te nemen.
OPMERKING: Door de processus spinosus L6 terug te trekken, kan het gemakkelijker worden om de punt van de rongeur in te brengen. Er moet voor worden gezorgd dat schade aan het ruggenmerg wordt voorkomen. - Ga door met het uitbreiden van de laminectomie ten minste vier laminae rostraal. Inspecteer het binnenoppervlak van de laminae op tekenen van kleurstof, wat kan duiden op een mislukte injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de nauwkeurigheid van de injectietechniek te bepalen, werd een kleurstof, trypanblauw, gebruikt als surrogaat voor het therapeutische. Deze kleurstof bindt zich gemakkelijk aan eiwitten, dus het blijft over het algemeen binnen de structuur waarin het is geïnjecteerd. Dit betekent dat de kleurstof de distributie van het geneesmiddel na injectie mogelijk niet nauwkeurig voorspelt; Het wordt alleen gebruikt om de nauwkeurigheid van de injectie aan te tonen. Wanneer het met succes in de lumbale stortbak wordt ingebracht, bindt trypanblauw zich aan de dura mater, waardoor de omtrek van het ruggenmerg blauw kleurt. Wanneer de naald echter niet door de dura mater dringt, komt de kleurstof in de epidurale ruimte terecht. Zowel de dura mater als de omliggende weefsels (het oppervlak van het bot en de ligamenten en spieren die de laminae verbinden) worden blauw gekleurd. Deze patronen zijn gemakkelijk zichtbaar voor het blote oog.
Het verschil tussen correct en onjuist toegediende injectie is moeilijk in te schatten als men gewoon een dwarse snede door het ruggenmerg en de wervelkolom maakt. In plaats daarvan wordt aanbevolen om een laminectomie uit te voeren met behulp van een paar rongeurs die beginnen bij de L5-lamina en rostraal bewegen. Er moet voor worden gezorgd dat de dura mater tijdens het proces niet wordt beschadigd. Het gebruik van de ontleedmicroscoop maakt dit proces gemakkelijker. Figuur 1 geeft vergelijkende voorbeelden van succesvolle injecties en slechts gedeeltelijk succesvolle injecties. Bij een succesvolle injectie wordt weinig tot geen reflux langs het naaldspoor waargenomen wanneer de naald wordt teruggetrokken. Na een succesvolle injectie onthult verwijdering van de lamina om het ruggenmerg bloot te leggen trypanblauw in het ruggenmerg, maar niet op het oppervlak van het bot (Figuur 1A). De kleurstof is ook zichtbaar op de hersenstam en het cerebellum na een succesvolle injectie (Figuur 1B). Daarentegen blijkt een gedeeltelijk succesvolle injectie uit een aanzienlijke terugvloeiing van kleurstof in het naaldkanaal tijdens het injectieproces en/of zichtbaar bewijs van kleurstof op het bot (Figuur 1C).
Met behulp van de bovenstaande procedure werd 28 μL van een AAV9-vector die versterkt groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengt, geïnjecteerd in een concentratie van 3 x10 13 vectorgenomen/ml, voor een totale dosis van 8,4 x 1011 vectorgenomen/dier. Vier weken later werden de dieren geëuthanaseerd en geperfundeerd met 4% paraformaldehyde10. De hersenen en het ruggenmerg werden vervolgens geoogst en voorbereid voor bevroren secties. Er werden secties van 40 μm dik verkregen en gekleurd voor GFP. Figuur 2 geeft voorbeelden van het transductiepatroon dat met deze vector wordt verkregen. De transductie was over het algemeen het hoogst in het ruggenmerg, met name in het lumbale gebied (figuur 2A-C), waarschijnlijk vanwege de nabijheid van de injectieplaats. De transductie van de hersenen werd bereikt (Figuur 2D-F), maar zoals verwacht was deze meestal beperkter dan wat in het ruggenmerg werd gezien.
Om de reproduceerbaarheid te illustreren van de resultaten die zijn behaald door een enkele, ervaren chirurg met behulp van een enkele partij virus, worden gekleurde delen van het cerebellum en de cortex van elk van de 15 ratten die voor dit onderzoek zijn geïnjecteerd, gepresenteerd in respectievelijk figuur 3 en figuur 4. De gekleurde delen van het cervicale ruggenmerg worden ook gepresenteerd voor 7 van deze 15 ratten (Figuur 5). Natuurlijk kan de hoeveelheid hersentransductie een nog grotere variabiliteit vertonen met verschillende doses, vectorpartijen en chirurgen10.
Figuur 1: Onthulling van het ruggenmerg na een injectie van de kleurstof. Laminectomieën werden uitgevoerd na de injectie van trypanblauw. (A) Het ruggenmerg is blauw gekleurd bij een correct toegediende injectie en er is geen kleurstof te zien op het bot dat tijdens de laminectomie is verwijderd (pijlen). (B) De kleurstof kan ook rond de hersenstam worden waargenomen. (C) Bij een injectie waarbij er tijdens de injectie aanzienlijke reflux was, is er minder kleurstof in de streng en is er kleurstof aanwezig op het oppervlak van het bot (pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van transductiepatronen die werden bereikt na intrathecale toediening van AAV9-GFP. 40 μm dikke delen van (A) cervicaal, (B) thoracaal en (C) lumbaal ruggenmerg werden immunohistochemisch gekleurd voor GFP (zwarte kleuring). Op alle niveaus werden hoge niveaus van transductie van grijze stof waargenomen. (D) Daarentegen vertonen de hersenen een schaarsere algehele transductie. De linker- en rechtervakken zijn vergroot in respectievelijk (E) en (F). (E) Het merendeel van de kleuring wordt waargenomen in het cerebellum, voornamelijk in Purkinje-neuronen (pijlen). (F) Neuronen (pijlen) en astrocyten (pijlpunten) worden getransduceerd in de hersenschors. Schaal balken: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; en (E,F) 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Reproduceerbaarheid van transductie in het cerebellum. Reproduceerbaarheid van transductie in het cerebellum van 15 ratten geïnjecteerd door dezelfde chirurg met dezelfde dosis en dezelfde hoeveelheid van het virus. Schaal balk: 1 mm. De nummers in de afbeeldingen geven de identificatienummers van de ratten ('nest') aan. individueel"). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Reproduceerbaarheid van transductie in de cortex. Reproduceerbaarheid van transductie in de cortex van 15 ratten geïnjecteerd door dezelfde chirurg met dezelfde dosis en veel virus. Schaal balk: 500 μm. De nummers in de afbeeldingen geven de identificatienummers van de ratten ('nest') aan. individueel"). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Reproduceerbaarheid van transductie in het cervicale ruggenmerg. Reproduceerbaarheid van transductie in het cervicale ruggenmerg van 7 ratten geïnjecteerd door dezelfde chirurg met dezelfde dosis en veel virus. Schaal balk: 500 μm. De nummers in de afbeeldingen geven de identificatienummers van de ratten ('nest') aan. individueel"). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een breed scala aan ziekten tast het CZS aan. Het verstrekken van een functionele kopie van het relevante gen via een virale vector is een aantrekkelijke behandelingsstrategie voor recessieve en monogene genen, zoals spinale musculaire atrofie. De bloed-hersenbarrière (BBB) sluit echter de meeste gentherapievectoren uit die intraveneus worden toegediend11. Degenen die de BBB kunnen kruisen, zoals AAV9, moeten in hoge doses worden gegeven om het vectorverlies als gevolg van perifere transductie te compenseren12. De leeftijd is ook een barrière. Blootstelling aan de verschillende AAV-serotypen in het milieu neemt toe met de leeftijd van13 jaar en leidt vaak tot de productie van antilichamen die therapeutische vectoren kunnen neutraliseren14. Daarom is intraveneuze toediening van gentherapievectoren voor CZS-aandoeningen over het algemeen beperkt tot zuigelingen en wordt het niet gebruikt bij patiënten die later in het leven worden gediagnosticeerd.
Voor oudere patiënten kan directe vectorinjectie in de liquor leiden tot brede transductie in het CZS, waarbij zowel de BBB als reeds bestaande anti-AAV-antilichamen worden omzeild15. Aangezien deze aanpak gericht is, kunnen ook lagere vectordoses worden gebruikt. Er zijn twee primaire benaderingen in de klinische setting: (1) lumbaalpunctie en (2) injectie in de laterale ventrikels. Dit laatste brengt meer risico met zich mee, maar zorgt over het algemeen voor een grotere hersentransductie. Lumbaalpunctie is veiliger, maar de transductie is scheef in de richting van het ruggenmerg. Hersentransductie kan worden verbeterd door de patiënt in de Trendelenburg-positie te plaatsen, maar de gegevens hierover zijn gemengd 16,17. Het gebruik van een katheter om de cisterna magna te bereiken via een lumbaalpunctie kan een betere optie zijn in de kliniek, maar het bevindt zich in een vroeg stadium van gebruik5. Er kunnen andere uitdagingen zijn bij het vertalen van benaderingen die in diermodellen zijn uitgewerkt naar de kliniek, zoals vectorverlies als gevolg van CSF-lekkage18 en toxiciteit in de dorsale wortelganglia19.
De meeste onderzoeken naar op het CZS gerichte therapieën die bij knaagdieren worden uitgevoerd, maken gebruik van pasgeborenen of volwassen dieren (>60 dagen oud). Pasgeborenen hebben het voordeel van een kleine lichaamsgrootte, waardoor hogere effectieve doses mogelijk zijn, en een onvolgroeid immuunsysteem, waardoor de complicaties van een immuunrespons tegen het therapeutische middel worden vermeden. In termen van hersenontwikkeling vertegenwoordigt een pasgeboren muis of rat echter beter een foetaal stadium bij mensen. Voor therapieën bedoeld voor kinderen in de leeftijdscategorie van 5-10 jaar is de jonge rat (25-35 dagen oud) een beter model in termen van neurologische ontwikkeling20. Aangezien een methode voor intrathecale injectie nog niet eerder was beschreven voor jonge ratten en methoden die waren vastgesteld voor volwassen muizen en ratten op deze leeftijd niet effectief bleken te zijn bij ratten, werd de hierboven beschreven aanpak ontwikkeld. Voor alle duidelijkheid: juveniele ratten zijn niet alleen kleiner dan volwassenen, maar kunnen ook verschillen in de elasticiteit van de dura die het ruggenmerg beschermt, waardoor een procedure die werkt om deze laag bij een volwassen rat te doorboren, niet effectief is bij een juveniel.
Bij het leren uitvoeren van intrathecale injectie bij jonge ratten, is het gebruik van een kleurstof (zoals trypanblauw) als surrogaat voor het therapeutisch middel noodzakelijk, en de gebruiker moet veel vertrouwen hebben in zijn vermogen om de procedure met succes en reproduceerbaar uit te voeren voordat hij een onderzoek met een therapeutisch middel start. Om de techniek onder de knie te krijgen, moet u oefenen om ervaring op te doen met hoe de spuit aanvoelt wanneer het traject op het doel ligt of niet op het doel. Er zijn twee veelvoorkomende fouten. Als de invalshoek te ondiep is, zal de naald de bovenkant van een van de laminae of de achterkant van de rostrale lamina raken. Er zal geen spiertrekkingen zijn en de afstand die de naald voortbeweegt zal een paar millimeter korter zijn dan 8 mm. Als de invalshoek te groot is, bestaat het risico dat de naald tussen de twee laminae passeert en de buikholte binnendringt. Wanneer dit gebeurt, zal de naald veel verder dan 8 mm naar voren komen. Als dit gebeurt, verwijdert u de naald, verplaatst u deze en probeert u het opnieuw. In de weinige gevallen dat dit is gebeurd, heeft het tijdelijk binnendringen van de buikholte met een paar millimeter voordat het zich terugtrekt en herpositioneert geen duidelijke blijvende schade aan de dieren veroorzaakt.
Het is gebleken dat het observeren van een fysieke reactie op de plaatsing van de naald van cruciaal belang is voor het bereiken van reproduceerbaarheid met een hoge mate van succes met deze procedure. Toen er geen respons was, was het slagingspercentage van de injectie laag. In sommige gevallen had een dier echter pogingen op meerdere plaatsen nodig om een reactie te bereiken, en er werden sporen van kleurstof waargenomen in een of meer van de vorige naaldsporen. Er werd geen kleurstof waargenomen in de epidurale ruimte, wat suggereert dat sommige van de vorige naaldprikken de dura waren binnengedrongen zonder een staart- of beentrek te veroorzaken. Aangezien de reflux minimaal was (vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in het naaldspoor van de injectie), wordt aangenomen dat het effect van eerdere naaldprikken op de werkzaamheid van de toediening in deze gevallen verwaarloosbaar was.
Zodra men de toedieningstechniek onder de knie heeft, kan een tweede, niet-chirurgische uitdaging worden ondervonden. Met name bij volwassen ratten (~70 dagen oud) kan de potentie van AAV9-vectoren voor intrathecale toediening aan het ruggenmerg en de hersenen aanzienlijk variëren van partij tot partij, zelfs wanneer ze worden gegenereerd door dezelfde vectorkern. Sommige batches zullen presteren zoals verwacht, wat transductie oplevert in de grijze stof van het ruggenmerg over de hele lengte. Anderen zullen er echter niet in slagen om de grijze stof binnen te dringen en voornamelijk dorsale wortelganglia10 transduceren. De oorzaak voor deze variabiliteit is onduidelijk, aangezien de vectoren krachtig zijn in vitro en wanneer ze rechtstreeks in het ruggenmerg worden geïnjecteerd. Het wordt aanbevolen om een pilotstudie van 3-4 dieren uit te voeren met een nieuwe batch virus om te bevestigen dat de nieuwe partij presteert zoals verwacht voordat met een groot onderzoek wordt begonnen. De potentie kan worden beoordeeld met behulp van immunohistochemische of immunofluorescentiekleuring van het eiwittransgenproduct of het kwantificeren van de hoeveelheid transgen-mRNA of vectorgenomen met behulp van kwantitatieve PCR of ddPCR21. Naast de onbekende variabelen die virale partijen onderscheiden, kunnen kleine verschillen in de leeftijd van het dier, het injectievolume, de snelheid van toediening en de vectorconcentratie variabiliteit in de resultaten veroorzaken. Voordat met een groot onderzoek wordt begonnen, moeten ze mogelijk worden geoptimaliseerd voor elk virus of ander kandidaat-therapeutisch middel.
Eenmaal getraind, kan een ervaren chirurg de intrathecale injectieprocedure van een jonge rat binnen ongeveer 30 minuten voltooien, van de inductie van de anesthesie tot het begin van de herstelperiode. Hierdoor kunnen grote cohorten in korte tijd worden behandeld. Het herstel van de operatie gaat ook snel. De meeste dieren lopen normaal binnen 20-30 minuten. Na het uitvoeren van meer dan 200 van deze operaties zijn er geen nadelige effecten van deze procedure opgetreden.
Ten slotte zijn het minimaliseren van dierenleed en het waarborgen van dierenwelzijn tijdens chirurgische ingrepen van het grootste belang. Het juiste gebruik van anesthetica en pijnstillers is dus vereist en de lichaamstemperatuur moet tijdens de procedure op peil worden gehouden en totdat het dier volledig herstelt van de anesthesie. De relevante regelgevende instanties en veterinair personeel van verschillende instellingen kunnen verschillende vereisten en aanbevelingen hebben met betrekking tot deze onderwerpen. Het gebruik van anesthetica en analgetica die in deze procedure worden beschreven, is ontwikkeld in overleg met de dierenartsen van de Emory University en het IACUC-personeel. Onderzoekers moeten nauw samenwerken met hun lokale dierenartsen en IACUC om de benodigde doelen te bereiken.
Er zijn bepaalde beperkingen aan deze procedure. De hier beschreven methode is ontwikkeld voor gebruik bij jonge ratten, en talloze structurele en andere verschillen tussen mensen en ratten kunnen de vertaling van deze procedures naar mensen beperken. Het doel van het mogelijk maken van lumbale intrathecale injectie van een therapeutisch middel bij jonge ratten is het vergemakkelijken van het gebruik van het juveniele rattenmodel voor het testen van de werkzaamheid van de kandidaat-therapeutische behandeling - zelfs als de precieze wijze van toediening zou moeten worden gewijzigd voor toepassing bij patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Donsante is een uitvinder van een aangevraagd patent met betrekking tot CSF-toediening van AAV9-vectoren.
Acknowledgments
De auteurs willen Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi en Lacey Stearman van UT Southwestern bedanken voor een productieve discussie over de uitdaging van jonge ratten voor intrathecale injectie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van Jaguar Gene Therapy (aan JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
