Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.
Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.
Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.
Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения 1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры телана холоде. Благодаря этой уникальной способности активация БАТ также может увеличить расход энергии и улучшить чувствительность к инсулину5.
BAT выполняет свою функцию посредством недрожащего термогенеза, процесса, опосредованного развязкой белка 1 (UCP1)6. Млекопитающие, в том числе мыши и люди, обладают разным количеством BAT. Классическая точка зрения БАТ заключается в том, что эти жировые ткани более распространены у мышей и младенцев, чем у взрослых людей. iBAT, расположенный в верхней дорсальной области между лопатками, является наиболее изученным депо BAT у мышей. Применяя радиоизотопную визуализацию и биопсийные тесты, недавние исследования выявили несколько депо БАТ у взрослых людей. Некоторые из них, в том числе депо, обнаруженные в глубокой шейке и надключичной области, ранее не были идентифицированы у мышей или других модельных животных 7,8,9,10,11. Среди этих депо BAT, scBAT является наиболее часто встречающимся депо у взрослых людей. Чтобы лучше понять происхождение и молекулярный вклад этих недавно обнаруженных депо BAT в организме человека, важно идентифицировать эквивалентные депо у мышей, которые позволяют генетическим и молекулярным манипуляциям отслеживать и тестировать функциональную роль этих депо. Таким образом, мы и другие ученые идентифицировали несколько ранее неизвестных депо BAT в различных анатомических местах у мышей, включая scBAT12,13, грудной периваскулярный BAT14,15, околопочечный BAT16 и периаортальный BAT17. Мышиный scBAT анатомически напоминает человеческий scBAT и морфологически напоминает классический iBAT, экспрессируя высокие уровни UCP112.
В отличие от мышиного iBAT, который легко поддается вскрытию, scBAT располагается в промежуточном слое шеи мыши, под слюнными железами и вдоль наружной яремной вены. Выделение этого депо для гистологического и молекулярного анализов может быть сложной задачей. Здесь мы подробно опишем процедуру препарирования scBAT у постнатальных и взрослых мышей и обработки этого депо для гистологии и анализа экспрессии генов.
В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое пред?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается NIDDK Национального института здравоохранения (NIH) под номером R01DK116899, Министерством сельского хозяйства США (USDA/ARS) под номером 3092-51000-064-000D и пилотной премией от Института сердечно-сосудистых исследований Медицинского колледжа Бэйлора. Блок-схемы были созданы с помощью BioRender.
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
Koptec's Pure Ethanol – 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
RNase H | NEB | M0297S | |
Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |