Summary
Candida spp. ilaç direncinde minyon kolonilerin önemi tam olarak araştırılmamıştır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı umut verici bir strateji sunmaktadır. Bu çalışma, gül bengal aracılı aPDT'nin Candida glabrata'yı etkili bir şekilde deaktive ettiğini ve küçük kolonileri indükleyerek benzersiz bir prosedür sunduğunu göstermektedir.
Abstract
Kandidemi hastalarında %40'lık bir mortalite oranıyla karşı karşıya kalan ilaca dirençli Candida ve minyon mutantları önemli bir tedavi zorluğu olmaya devam etmektedir. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), antibiyotikler/antifungallerden farklı olarak çoklu mantar yapılarını hedefler ve potansiyel olarak direnci engeller. Minyon kolonileri indüklemek için geleneksel yöntemler, ilaca duyarlılığı ve stres tepkilerini etkileyebilen etidyum bromür veya flukonazole dayanır. Bu çalışma, ilaca dirençli bir Candida glabrata izolatı ile mücadele etmek için yeşil ışık (tepe 520 nm) ve gül bengal (RB) ışığa duyarlılaştırıcı uygulamasını araştırdı. Bulgular, aPDT tedavisinin hücre büyümesini önemli ölçüde inhibe ettiğini (%≥99.9 azalma) ve mitokondriyal redoks indikatör boyamasının boyutunun azalması ve kaybıyla kanıtlandığı gibi minyon koloni oluşumunu etkili bir şekilde indüklediğini ortaya koydu. Bu çalışma, aPDT'nin in vitro olarak çok ilaca dirençli bir C. glabrata suşunda minyon kolonileri indükleyebileceğine dair ilk kanıtları sağlamakta ve dirençli mantar enfeksiyonlarıyla mücadele için potansiyel olarak dönüştürücü bir yaklaşım sunmaktadır.
Introduction
Mantar enfeksiyonları, özellikle Candida albicans ve ilaca giderek daha dirençli Candida glabrata'nın neden olduğu enfeksiyonlar, ciddi bir küresel tehdit oluşturmaktadır1. Bu enfeksiyonlar, özellikle hastanede yatan hastalar ve bağışıklık sistemi zayıflamış olanlar için ölümcül olabilir. Artan antifungal direnç, özellikle Candida albicans2'den yüksek mortalite ile ciddi bir mantar enfeksiyonu olan invaziv kandidiyazisin kontrolünü tehdit eder. Dirençli suşlar etkili tedaviyi engelleyerek potansiyel olarak hem karmaşıklığı hem de ölüm oranlarını artırır. ABD'nin Kaliforniya eyaletine bağlı Alameda County'de C. glabrata en yaygın istilacı tür haline gelmiştir3. Candida türlerinin prevalansı ve dağılımındaki bu değişim, yerel sağlık uygulamaları, hasta demografisi, antifungal ajanların kullanımı ve Candida enfeksiyonları için risk faktörlerinin prevalansından etkilenebilir.
Fonksiyonel mitokondriden yoksun olan Candida'daki minyon mutantlar, bu organelin ilaç tepkisini, virülansı ve stres direncini nasıl etkilediğini ortaya koymaktadır 4,5. C. glabrata bu kolonileri kolayca oluşturur, polienlere karşı duyarlılık kazanırken onu azollerekaybeder 6. Azol duyarlılığı ve solunum fonksiyonu karmaşık bir şekilde bağlantılıdır ve mitokondriyal DNA kaybı yoluyla dirence yol açan azalmış solunumile 7. Azol direncine sahip C. glabrata'nın minyon kolonileri, flukonazol tedavisi gören bir kemik iliği nakli alıcısından8 insan dışkı örneklerinden ve kan dolaşımı enfeksiyonu olan hastaların kan kültürü şişelerinden9 izole edilmiştir. İlaç direnci, virülans ve stres tepkisindeki potansiyel etkileri, klinik önemlerini vurgulamaktadır. Ek olarak, farklı özellikleri onları mitokondriyal biyolojideki temel soruları araştırmak için değerli araçlar haline getirir5. Minyon mutantlarla ilgili araştırmalar devam ettikçe, hem klinik hem de temel araştırmalardaki uygulamalarının genişlemesi muhtemeldir.
Bu çalışma, fotodinamik tedavinin (PDT) C. glabrata'da minyon kolonileri indükleyebileceğini ve C. glabrata'yı etidyum bromür veya flukonazole maruz bırakmanın geleneksel tekniklerinin ötesine geçen yöntem yelpazesini genişletebileceğini keşfetti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. glabrata'nın kültürlenmesi
NOT: Deneyler için flukonazol de dahil olmak üzere çoğu antifungal ajana dirençli, çoklu ilaca dirençli bir C. glabrata (C2-1000907) kullanılmıştır. Farklı suşlar arasında farklılıklar olabileceğinden, deneysel koşulların spesifik suşa uyarlanması gerekebilir. Tüm deneyler, tutarlılık için 25 ° C'de (doğal enfeksiyonu taklit ederek) yetiştirilen log faz Candida'yı kullandı. C. glabrata'nın hif eksikliği, 37 ° C'de hif oluşturan C. albicans ile karşılaştırıldığında miktar tayinini basitleştirir10.
- C. glabrata'nın log faz kültürünü hazırlamak için, bir agar plakasından tek bir koloni seçin ve bunu 3 mL steril maya pepton dekstroz (YPD) ortamı içeren bir cam test tüpüne aktarın (bkz. Çalkalayarak 25 ° C'de 14-16 saat inkübe edin (155 rpm, ortama hava iletimini artırmak için 45 ° açı).
- İnkübasyondan sonra, kültürü steril teknik kullanarak taze YPD ile 0.1 OD600'e seyreltin. 25 °C'de 6 saat boyunca 155 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. OD600'ü ölçerek C. glabrata'nın günlük fazını doğrulayın. 1 × 10 7-1.5 × 10 7 hücre/mL'ye karşılık gelen 0.65-1.00'ı hedefleyin.
2. Etidyum bromür, flukonazol ve fotodinamik tedavi ile minyon kolonilerin indüksiyonu
- Etidyum bromür minyon koloni indüksiyonu
- Bir maya süspansiyonunu YPD ile 3 mL'likbir nihai hacme kadar 0.1 (5 × 106 hücre / mL) OD 600'e ayarlayın, ardından 30 μL etidyum bromür stoğu ekleyin (10 mg / mL) (100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için Malzeme Tablosuna bakınız).
- Maya süspansiyonunu gece boyunca (16-18 saat) 25 °C, 155 rpm, 45° açıyla inkübe edin. 0,65 (1 × 107 hücre/mL) OD600'e ayarlayın. Kuyucuk başına 180 μL PBS'ye 20 μL ayarlanmış maya süspansiyonu ekleyerek 96 oyuklu bir plakada 10 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirin. Bu, 10-1 ila 10-5 arasında değişen altı seyreltme oluşturur.
- 4 seyreltme faktörü seçin (ör., 100, 101, 102 ve 103) ve YPD agar plakalarının (üçlü) 4 çeyreğinde her biri 3 damla (20 μL) plaka.
- Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama11 için önceden seçilen seyreltmelerden 5-80 kolonili kadranları seçin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.
- Flukonazol minyon koloni indüksiyonu
NOT: İşlemi hızlandırmak için, flukonazol kaynaklı minyon koloni oluşumu için T3 hücrelerini (3 RB-PDT tedavisinden sonra elde edilen normal ve minyon hücrelerin bir karışımı; bkz. adım 2.3) kullanın. Bunun nedeni, standart tedavinin tipik olarak daha yavaş oluşumla sonuçlanmasıdır.- Adım 2.1.1'de açıklandığı gibi bir maya hücresi süspansiyonu hazırlayın ve ayarlayın.
- Gece boyunca (16-18 saat) 25 °C'de inkübe edin. OD600'ü tekrar 0.1'e ayarlayın.
- Ayarlanmış süspansiyonun 1 mL'sini steril 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Steril bir pamuklu çubuğu (15 cm uzunluğunda, 0,9 cm x 2,6 cm uçlu, Malzeme Tablosuna bakın) maya süspansiyonuna batırın, tüp tabanı ile teması sağlayın ve fazla sıvıyı tüp duvarından çıkarmak için bükün.
- Mueller-Hinton agar kullanarak kaputtaki plakaları hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Pamuğu agar üzerinde ileri geri sürün, iki kez 60° döndürün, ardından eşit kapsama alanı için çevresini temizleyin.
- Forsepsleri 1-2 saniye alev üzerinde sterilize edin, kısa bir süre soğumalarına izin verin, ardından boş diskleri almak için kullanın.
- Bir işaretleyici kullanarak plakayı üç eşit sektöre bölün. Her sektörün ortasına bir boş disk yerleştirin.
- Her diske (25 μg/disk) 12,5 μL flukonazol stoğu (2 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, kabarcıkları önlemek için iyice karıştırın ve 37 ° C'de 20-24 saat inkübe edin.
- TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.
- PDT minyon koloni indüksiyonu
NOT: Farklı mantarlar, PDT'den sonra farklı sayıda minyon koloni üretebilir. Bazı suşlar hiç üretmeyebilir.- aPDT sistemini hazırlayın.
NOT: aPDT sistem cihazı için kurulum prosedürü, Hung ve ark.12 tarafından bildirilen yöntemi takip eder. Kısaca, aPDT sistemi, 520 nm'de bir tepe noktasına sahip yeşil bir LED dizisinden oluşur (Malzeme Tablosuna bakınız), 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu ile iyi bir hizalama ile alttan ışık parlar. - YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 0.65 OD600'e (yaklaşık 1 × 107 hücre / mL) ayarlayın.
- 1 mL maya süspansiyonunu 111 μL %2 gül bengal (RB, Şekil 1) ile karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız) yuvarlak kapaklı bir tüpte %0.2'lik bir nihai RB konsantrasyonu elde etmek için. Karışımı 25 °C'de 15 dakika inkübe edin ve 155 rpm'de 45°'lik bir açıyla döndürün.
- Karışımı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 16.100 x g'da 2.5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için tüpü davlumbaz zemininde beş kez hafifçe kazıyın.
- Tüm RB'yi çıkarmak için süspansiyonu 1x PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamayı, kapsamlı bir yeniden süspansiyon için kısa bir vorteksleme veya pipetleme ile peletin yeniden süspansiyonu takip eder.
- Son yıkamadan sonra 1000 μL PBS ekleyin. Çözelti açık pembe renktedir. Yıkanmış RB yüklü maya süspansiyonunun 200 μL'sini 96 oyuklu bir plakadaki (üç katlı) üç kuyucuğun her birine aktarın.
- 96 oyuklu plakayı, aşağıdan yeşil ışık saçan LED ampullerle fotodinamik ışık sistemine yerleştirin. Eşit aydınlatma sağlamak ve paraziti önlemek için oda ışıklarını kapatın. 2 dakika boyunca 4.38 J /cm2 PDT dozunu vermek için LED ışık sistemini etkinleştirin; Sistemin kuyularla düzgün şekilde hizalandığından emin olun.
- Işınlamadan sonra, maya süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakada seyreltin. 180 μL PBS içeren bir kuyucuğa 20 μL maya süspansiyonu ekleyin ve 10 kat seyreltme oluşturun. 10-1 ila 10-5 aralığına ulaşmak için kalan seyreltmeler için tekrarlayın.
- Maya hücresi konsantrasyon ayarına bağlı olarak dört seyreltme faktörü (örneğin, 10-2 ila 10-5) seçin.
- Her seyreltme faktörü için, YPD agar plakaları üzerinde kadran başına 3 damla (her biri 20 μL) plaka.
- Maya süspansiyonu tamamen emildikten sonra, agar plakaları tarafından yaklaşık 10 dakika ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- T0'ı PDT tedavisi olmayan kontrol ebeveyni C. glabrata olarak tanımlayın. T0 mantarlarını yukarıda tarif edildiği gibi kütük büyüme aşamasında hazırlayın ve bunları %0,2 RB varlığında 4,38 J/cm2 yeşil ışığa maruz bırakın. Bu PDT koşulu sürekli olarak 3 ila 3.5 log mantar büyümesini engeller.
- Hayatta kalan mantarları T1 olarak belirtin ve in vitro olarak bir log büyüme aşamasına genişletildikten sonra tekrar aynı PDT dozuna maruz bırakın. İkinci PDT'den sonra hayatta kalan mantarlar T2 ve benzeri olarak gösterilir.
- Ertesi gün, koloni sayısı 5 ile 80 arasında olan kadranları seçin. Her kadrandaki koloni sayısını sayın ve titreyi aşağıdaki formülle hesaplayın: Koloni oluşturan birim (CFU)/mL = Koloni sayısı (üçlü ortalama) × Seyreltme faktörü × 50.
- TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). Plakayı daha önce açıklandığı gibi tarayın (adım 2.2).
- aPDT sistemini hazırlayın.
3. Mitokondriyal fonksiyon analizi (TCC boyama testi)
NOT: TTC bir redoks göstergesi ve bir elektron alıcısıdır. Beyaz bileşikler elektronlar11 tarafından parçalandığında kırmızıya döner. Tüm hücrelerin, bir agar plakası üzerinde kültürden sonraki 24 saat içinde mutlaka görünür koloniler oluşturmadığını unutmayın. Fonksiyonel mitokondriye sahip koloniler kırmızıya dönerken, fonksiyonel olmayan mitokondriye sahip olanlar beyaz kalır. Bu, farklı mitokondriyal işlevselliğe sahip koloniler arasında ayrım yapılmasına izin verir.
- İşlemden sonra, kolay görselleştirme ve boyama için farklı koloniler elde etmek için YPD agar plakaları üzerindeki Candida süspansiyonlarını istenen hücre yoğunluğuna göre seyreltin.
- 37 ° C'de 24 saatlik büyümeden sonra, tek bir hücreden görünür koloniler oluşur. 20 μL %20 TTC'yi doğrudan her koloninin merkezine pipetleyin.
- Tamamen emildikten sonra, koloniler tarafından yaklaşık 10 dakika TTC, 37 ° C'de 30-40 dakika inkübe edilir.
4. Normal ve minyon C. glabrata'nın büyüme kinetiği
NOT: Üç maya suşu karşılaştırıldı: C. glabrata C2-1000907 T0 (PDT tedavisi olmayan klinik izolat), T3n (C. glabrata C2-1000907, ebeveyn hücrelerine benzer şekilde ortalama çapı 1.5 ± 0.8 mm olan 3 ardışık RB-PDT sergileyen kolonilerden sonra) ve T3p (3 ardışık RB-PDT'den sonra C. glabrata C2-1000907'nin minyon kolonileri).
- YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 3 mL'lik bir tüpte 0.1 (5 × 106 hücre / mL) OD600'e ayarlayın.
- Çok modlu mikroplaka okuyucuyu kullanarak statik kültürün OD600'ünü her 20 dakikada bir otomatik olarak ölçün (Malzeme Tablosuna bakın) 24 saat boyunca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Veriler, standart ± hata ile ortalama olarak sunulmuştur ve her grupta en az üç kopya olmak üzere üç bağımsız deneyden elde edilmiştir. Koloni sayımları, OD600 ölçümleri ve TTC boyama sonuçları dahil olmak üzere deneysel veriler, grafik ve istatistiksel yazılım kullanılarak grafiklendirildi ve istatistiksel olarak analiz edildi (bkz. Verilerin analizinde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) veya t-testi kullanıldı ve p-değeri <0.05 olarak anlamlı kabul edildi. Tarama, 1200 dpi çözünürlükte 48 bit tam renkli optik tarayıcı ile gerçekleştirildi ve koloni çaplarının sonraki ölçümleri ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.
Şekil 2'deki büyüme eğrilerinde gösterildiği gibi, C. glabrata C2-1000907'nin (T3p) minyon mutantları, normal büyüklükteki (T0) tedavi edilmemiş ebeveyn mantarlarına kıyasla daha yavaş büyüme göstermiştir. C. glabrata 15 dakika boyunca% 0.2 RB ile karıştırıldığında ve 4.38 J /cm2 yeşil ışığa maruz kaldığında (PDT tedavisi), mantarların titresi 107.5 CFU / mL'den 104.5 CFU / mL'ye düştü (en az 3 log, Şekil 3) yaklaşık 107 CFU / mL hücre yoğunluğuna sahip olan kontrol grubuna (sadece RB) kıyasla. Ek olarak, aPDT'lerden sonra minyon koloniler gözlendi. Bu minyon koloniler, normal boyut olan 1,5 mm ± 0,8 mm yerine ortalama 0,4 mm ± 0,25 mm boyuta sahipti (Şekil 4A). Mitokondriyal disfonksiyonu olan küçük boyutlu koloniler, %20 TTC ile boyandıktan sonra büyüklükleri ve renkleri ile tanımlanabilir. Beyaz rengi koruyan minyon koloniler (Şekil 3B, beyaz oklar) mitokondriyal disfonksiyon sergilerken, bazı daha küçük kırmızı renkli koloniler ve normal büyüklükteki koloniler normal mitokondriyal fonksiyonu korumuştur (Şekil 4B). Geleneksel DNA birleştirici ajan etidyum bromür (Şekil 4C) ve flukonazol (Şekil 4D), Candida'nın minyon mutantlarını etkili bir şekilde indükleyebilir. Disk difüzyonu, mantarlarda ilaç duyarlılığını tanımlamak için basit bir yöntemdir. Şekil 4D'de, T0 kültüründe (PDT olmadan) 25 μg flukonazol diskini çevreleyen net bir dairesel büyüme bölgesi, bu ebeveyn mantarında daha az ilaç direncini gösterir. Bununla birlikte, C. glabrata C2-1000907, flukonazole (veriler gösterilmemiştir) ve berrak bölgenin çapına karşı minimum inhibisyon konsantrasyonu ile hala dirençli bir suş olarak tanımlanmaktadır. T3 kültüründe, diskin yakınında (ok, alt panel) birçok minyon koloni oluştu, bu da tekrarlanan üç PDT tedavisinden sonra ilaç direncini düşündürdü.
Şekil 1: Gül Bengal'in (RB) moleküler yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tekrarlayan RB-PDT'den 24 saat sonra C. glabrata C2-1000907'nin Büyüme Eğrileri. Büyüme eğrileri üç suş için karşılaştırıldı: C. glabrata C2-1000907 T0 (saf ebeveyn hücreleri), T3n (3 tekrarlanan tedaviden sonra normal büyüklükteki koloniler) ve T3p (3 tekrarlanan tedaviden sonra minyon koloniler). T0 ve T3n ile karşılaştırıldığında, T3p kolonileri önemli ölçüde daha yavaş bir büyüme oranı sergiledi (n = 3, p < 0.05). Tüm hücreler YPD ortamında büyütülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: aPDT'yi takiben C. glabrata C2-1000907'nin Büyüme İnhibisyonu. 4.38 J / cm² ışık dozu ve% 0.2 RB ile tek bir aPDT tedavisi, C. glabrata C2-1000907 büyümesini naif kontrole kıyasla 3 log ile önemli ölçüde inhibe etti (p < 0.0001, eşleşmemiş t-testi). Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil eder, veriler 3 bağımsız deneyden toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Trifeniltetrazolyum klorür (TCC) boyama kullanılarak mitokondriyal disfonksiyon analizi. (A) C. glabrata C2-1000907, aPDT tedavisinden 24 saat sonra (% 0.2 RB, 4.38 J / cm² yeşil ışık), büyük (1.5 mm ± 0.8 mm) ve küçük (minyon) koloniler (0.4 mm ± 0.25 mm) ile iki modlu bir koloni boyutu dağılımı sergiledi. (B) TCC boyama, büyük kolonilerin kırmızıya döndükleri için işlevsel olduklarını, minyon kolonilerin ise beyaz kaldıkları için işlevsel olmadığını ortaya çıkardı. (C) Minyon koloniler ayrıca etidyum bromür (30-40 dakika boyunca 100 μg / mL) ve (D) flukonazol (25 μg / mL) tedavisi ile indüklenmiştir. T0 kültüründe (PDT olmadan) 25 μg flukonazol içeren flukonazol diskini çevreleyen net bir dairesel büyüme bölgesi, duyarlılığı gösterir. T3 kültüründe, diskin yakınında (ok, alt panel) birçok minyon koloni oluştu, bu da tekrarlanan üç PDT tedavisinden sonra ilaç direncini düşündürdü. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, PDT'yi Candida'da minyon koloni oluşumunu indüklemek için bildirilen ilk yöntem olarak ortaya koymakta ve etidyum bromür ve flukonazolün yerleşik etkilerini aşmaktadır. Bu yeni gözlem, virülansı azaltarak hem mantar eradikasyonu hem de direnç mekanizmalarının ortaya çıkması üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir.
RB aracılı PDT, C. glabrata'nın büyümesini etkili bir şekilde inhibe eder ve Candida enfeksiyonları için potansiyel bir alternatif tedavi yaklaşımı önerir. Işıkla aktive olan bir ışığa duyarlılaştırıcı olarak RB, belirli bir dalga boyuna maruz kaldığında singlet oksijen ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretir. Bu oksidatif stres, bu çalışmada gösterildiği gibi lipitler, proteinler ve nükleik asitler13 gibi temel hücresel bileşenlere zarar vererek mitokondriyal disfonksiyona yol açar. Bu, Candida'nın standart antifungal ilaçlarla gözlenen geleneksel mekanizmalar yoluyla direnç geliştirmesini zorlaştırır.
Bu çalışmada kullanılan üç maya suşu, T0, T3n ve T3p, farklı büyüme modelleri sergilemektedir. T0 tedavi edilmeden kalırken, T3n ve T3p üç kez RB-PDT'ye tabi tutulur. T3n normal büyüklükteki kolonileri gösterirken, T3p minyon koloniler sergiler. Minyon kolonilerin daha yavaş büyümesi, hücresel enerji ve metabolizmadaki değişiklikleri gösterebilir. Genellikle mitokondriyal disfonksiyon4 ile ilişkili olan minyon fenotip, aerobik solunumun bozulmasına yol açabilir ve sonuç olarak genel büyüme kinetiğini etkileyebilir. Minyon kolonilerdeki bozulmuş aerobik solunum, virülanslarını, ilaca duyarlılıklarını veya farklı ortamlarda devam etme yeteneklerini etkileyebilir. Bu bağlantı potansiyel klinik etkilere sahiptir ve gelecekteki araştırma yönleri için yollar sağlar.
Bir DNA birleştirici ajan olan etidyum bromür, mitokondriyal DNA sentezini inhibe eder ve mevcut mitokondriyal DNA'yı bozarak Candida'yı mitokondriyal disfonksiyonu olan minyon kolonilere dönüştürür14. Candida enfeksiyonlarını tedavi etmek için yaygın olarak kullanılan flukonazol, C. glabrata6'da ilaç direncine ve minyon koloni gelişimine neden olabilir. Minyon mutantlar, transkripsiyon faktörü PDR1'in aktivasyonu ve CDR1 ve CDR215 genlerinin düzenlenmesi yoluyla azol ilaç direnci gösterebilir. Ayrıca, mitokondriyal DNA'nın kısmen veya tamamen kaybı nedeniyle, mitokondriyal fonksiyon tehlikeye girer16.
PDT, bakteriyel virülansı17 azaltmada, antibiyotiklere18 duyarlılığı indüklemede ve bakterilerde biyofilm oluşumunu19 azaltmada etkinlik göstermiştir. Mantar enfeksiyonlarına karşı PDT ile ilgili çalışmalar sınırlıdır20. Bu keşif, RB-PDT'nin C. glabrata'daki mitokondriyi nasıl etkilediğine dair ilgi çekici soruları gündeme getiriyor. RB-PDT'nin maya hücrelerini nasıl etkilediğini tam olarak anlamak için, büyüme varyasyonlarına neden olan moleküler mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Bununla birlikte, PDT tarafından indüklenen minyon mutantlar şu anda yeterince çalışılmamıştır ve ayrıntılı mekanik temelleri belirsizliğini korumaktadır. Çeşitli yöntemlerle oluşturulan küçük koloniler arasında herhangi bir fark olup olmadığını belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Candida türlerinde minyonların nasıl oluştuğunu anlamak, mitokondriyal fonksiyon ve patojenite arasındaki ilişkiyi incelemek için önemlidir. Ayrıca, minyon mutantlar, antifungal ilaç direnç mekanizmalarını keşfetmek için bir model olarak hizmet edebilir.
Bu çalışma, RB aracılı PDT'nin C. glabrata üzerindeki etkileri ve minyon kolonilerin ortaya çıkışı hakkında değerli bilgiler sağlarken, dikkate alınması gereken bazı sınırlamalara sahiptir. İlk olarak, çalışma öncelikle in vitro deneylere odaklanmıştır ve bu bulguların klinik ortamlara çevrilmesi daha fazla araştırmayı garanti etmektedir. Ek olarak, RB-PDT'yi takiben minyon kolonilerin oluşumunun altında yatan spesifik moleküler mekanizmalar ve bunların antifungal ilaç direnci üzerindeki potansiyel etkileri daha derinlemesine araştırma gerektirir. Ayrıca, çalışma farklı maya suşlarının büyüme modellerini karşılaştırırken, ek moleküler ve genetik analizler, minyon koloni oluşumu ile ilişkili metabolik ve genetik değişikliklerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir.
Ayrıca, C. glabrata'nın farklı klinik izolatları arasında RB-PDT'ye yanıt olarak potansiyel değişkenlik bu çalışmada ele alınmamıştır ve bu da daha geniş suşa özgü araştırmalara duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu sınırlamaları ele alan gelecekteki çalışmalar, RB aracılı PDT'nin etkilerinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması ve antifungal tedavi stratejileri bağlamında minyon kolonilerin ortaya çıkması için çok önemli olacaktır.
Özetle, bu araştırma, aPDT'nin bozulmuş mitokondriyal fonksiyona sahip C. glabrata (C2-1000907) minyon mutantlarını indüklediğini ortaya koymaktadır. Bu benzersiz mekanizma, antifungal çalışmalar için yeni bir yöntem sunabilir. PDT'nin neden olduğu minyon kolonilerin altında yatan kesin etki mekanizması hala açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir ve diğer yöntemlerden potansiyel farklılıkları keşfetmek, terapötik stratejileri optimize etmek için çok önemli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], Ulusal Cheng Kung Üniversitesi [K111-B094], [K111-B095], Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi, Tayvan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J.
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
- Whittaker, P. A.
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J.
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
