Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen
Summary
Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.
Abstract
De adaptieve immuunrespons is afhankelijk van het vermogen van een T-cel om door bloed, lymfe en weefsel te migreren als reactie op ziekteverwekkers en vreemde lichamen. T-celmigratie is een complex proces dat de coördinatie vereist van veel signaalinvoer uit de omgeving en lokale immuuncellen, waaronder chemokines, chemokinereceptoren en adhesiemoleculen. Bovendien wordt de beweeglijkheid van T-cellen beïnvloed door dynamische omgevingssignalen, die de activeringstoestand, het transcriptionele landschap, de expressie van adhesiemoleculen en meer kunnen veranderen. In vivo maakt de complexiteit van deze schijnbaar met elkaar verweven factoren het moeilijk om individuele signalen te onderscheiden die bijdragen aan T-celmigratie. Dit protocol biedt een reeks methoden, van T-celisolatie tot computerondersteunde analyse om T-celmigratie in realtime te beoordelen onder zeer specifieke omgevingsomstandigheden. Deze omstandigheden kunnen helpen bij het ophelderen van mechanismen die migratie reguleren, het verbeteren van ons begrip van de kinetiek van T-cellen en het leveren van sterk mechanistisch bewijs dat moeilijk te bereiken is door middel van dierproeven. Een beter begrip van de moleculaire interacties die van invloed zijn op celmigratie is belangrijk om verbeterde therapieën te ontwikkelen.
Introduction
T-cellen zijn de belangrijkste effectoren van de adaptieve, antigeenspecifieke immuunrespons. Op populatieniveau zijn T-cellen heterogeen, bestaande uit cellulaire subsets met verschillende gespecialiseerde functies. Belangrijk is dat CD8+ T-cellen de belangrijkste cytolytische effectoren van het immuunsysteem zijn, die geïnfecteerde of disfunctionelecellen direct elimineren.
Rijpe CD8+ T-cellen bevinden zich in weefsel en circuleren door bloed en lymfevaten op zoek naar antigenen. Tijdens infectie worden T-cellen gepresenteerd met antigenen in bloed of weefsel en worden ze snel afgevoerd naar de milt of de dichtstbijzijnde drainerende lymfeklier om een productieve immuunrespons te starten. In beide gevallen worden T-cellen geactiveerd, ondergaan ze klonale expansie en verlaten ze het lymfestelsel om in het bloed te komen, als dat nog niet het geval is. Tijdens dit proces zorgt intracellulaire signalering voor de neerwaartse regulatie van lymfatische homing-receptoren en de opregulatie van talrijke integrine- en chemokinereceptoren die essentieel zijn voor weefselspecifieke migratie2. Uiteindelijk wordt de gerichte migratie van T-cellen naar infectieplaatsen aangedreven door convergerende omgevingssignalen, waaronder integrine- en chemokine-signalering.
Chemokines kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee hoofdklassen: (1) homeostatische signalen, die essentieel zijn voor differentiatie, overleving en basale functie, en (2) ontstekingssignalen, zoals CXCL9, CXCL10 en CCL3, die nodig zijn voor chemotaxis. Over het algemeen creëren chemokines een signaalgradiënt die directionele migratie stimuleert, bekend als chemotaxis, naast het activeren van integrine-expressie1. Chemotaxis is fijn gereguleerd en zeer gevoelig, met T-cellen die in staat zijn om te reageren op kleine veranderingen in gradiënt die hen naar een specifieke richting of locatie kunnen leiden.
Naast deze T-cel-gerelateerde factoren wordt migratie ook beïnvloed door de samenstelling en dichtheid van de extracellulaire matrix (ECM). De ECM bestaat uit een dicht netwerk van eiwitten, waaronder collageen en proteoglycanen, die de steiger vormen voor adhesieve integrinereceptoren op T-cellen. Integrinen zijn een diverse familie van transmembraaneiwitten, elk met zeer gespecialiseerde bindingsdomeinen en stroomafwaartse signaaleffecten. Dynamische expressie van integrinereceptoren op het oppervlak van een T-cel maakt een snelle aanpassing aan hun veranderende omgeving mogelijk3. Belangrijk is dat integrinen de ECM- en intracellulaire cytoskeletale actinenetwerken verbinden die samenwerken om de voortstuwingskracht te genereren die nodig is voor de beweging van T-cellen.
Samenvattend variëren migratiepatronen op basis van het fenotype van de immuuncel of omgevingssignalen. Deze complexe biologische processen worden strak gereguleerd door de expressie van cytokines, chemokinen en integrinen op het oppervlak van de T-cel, de omliggende cellen en het lokale, geïnfecteerde weefsel. In vivo kunnen deze migratiemechanismen complex zijn en het gevolg zijn van verschillende additieve signalen4. Vanwege deze complexiteit kan het onmogelijk zijn om een causaal verband vast te stellen tussen schijnbaar in elkaar grijpende variabelen. Om dit te verhelpen, zijn er verschillende in vitro benaderingen om specifieke aspecten van T-celmigratie te bestuderen, zoals de respons op specifieke chemokine-signalen en de interactie tussen T-celintegrinen en ECM-bindende eiwitten. Dit protocol behandelt methoden om muizen CD8+ T-cellen te isoleren en te activeren, met in vitro migratietests in de tweedimensionale ruimte en computationele analysetools voor het analyseren van gespecificeerde T-celmigratie. Deze methoden zijn voordelig voor de gebruiker omdat ze geen geavanceerde materialen of apparaten vereisen, zoals bij sommige andere celmigratietests die in de literatuur worden beschreven. Celmigratiegegevens die met deze methoden worden gegenereerd, kunnen op een simplistische manier bewijs leveren van immuunresponsen die verder, geïnformeerd onderzoek in vivo mogelijk maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het begrijpen van de biologische impact van convergerende signalen in vivo is een uitdaging en niet gemakkelijk te interpreteren. De hierin gepresenteerde protocollen bieden een redelijke methode om T-celmigratie te begrijpen in zeer gedefinieerde en biologisch relevante omstandigheden. Deze voorwaarden kunnen worden gespecificeerd op basis van het oordeel van de onderzoeker, en de protocollen kunnen worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van verschillende T-celpopulaties, activeringsstatus en celfenoty…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken eerdere en huidige leden van het Kim Lab die in de loop van de tijd hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze protocollen. Representatieve gegevens werden mogelijk gemaakt door P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Verenigde Staten en P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Verenigde Staten. Deze publicatie is mede mogelijk gemaakt door subsidienummer T32 GM135134 van de Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
Riferimenti
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
.