Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية توظيف اثنين المنبهات العصبية ، والألديكارب pentylenetetrazole (PTZ) ، بطرق وظيفة مكملة لدراسة متشابك في الخيطية ، C. ايليجانس. ويمكن أيضا أن يكون هذا النهج التكميلية المستخدمة لتسليط الضوء على آليات الحفظ تطويريا لتحوير التزامن العصبية ولها آثار لعلاج الصرع والتشنجات.
Abstract
أصبحت الديدان الخيطية ، ايليجانس انواع معينة ، نموذجا مناسبا لدراسة النقل العصبي. جيم ايليجانس هي فريدة من نوعها بين النماذج الحيوانية ، كما تم تحديد التشريح والاتصال لنظامها العصبي من micrographs الإلكترون وصقلها عن طريق فحوصات الدوائية. في هذا الفيديو ، ونحن تصف الكيفية التي يمكن أن تستخدم المنبهات العصبية two التكميلية ، مثبط أستيل ، ودعا الألديكارب ، وحمض الغاما غاما (GABA) مستقبلات ، ودعا pentylenetetrazole (PTZ) ، مما يشير إلى تميز تحديدا في الاعصاب تقاطعات جيم ايليجانس (NMJs) وتيسير فهمنا الدوائر العصبية عدائية.
الخلايا العصبية من 302 ايليجانس جيم ، تسعة عشر GABAergic مد عضلات الجسم نوع المحرك يعصب جدار الخلايا العصبية (BWMs) ، في حين أن أربع GABAergic الخلايا العصبية ، ودعا RMEs والعضلات يعصب رأسه. على العكس من ذلك الخلايا العصبية الحركية 39 أعرب عن ناقل عصبي مثير ، أستيل كولين (ACH) ، واستعداء انتقال GABA في BWMs لتنسيق الحركة. في البداية تم تحديد طبيعة عدائية من الخلايا العصبية الحركية وGABAergic كوليني NMJs في جدار الجسم بواسطة الليزر التذرية ، والالتفاف في وقت لاحق بسبب التعرض الألديكارب. نتائج التعرض الحاد الألديكارب في الوقت الشلل بالطبع الجرعة أو استجابة في البرية من نوع الديدان. حتى الآن ، وفقدان انتقال أدن تشافيز مثير يمنح مقاومة الألديكارب ، ويتراكم في أقل أدن تشافيز NMJs الدودة ، مما يؤدي إلى أقل من التحفيز BWMs. ويمكن ملاحظة مقاومة الألديكارب مع أدن تشافيز محددة أو عامة المسوخ وظيفة متشابك. بما يتفق مع GABA العدائية ونقل أدن تشافيز ، وفقدان انتقال GABA ، أو عدم تنظيم سلبا أدن تشافيز الإفراج عنهم ، يمنح فرط الحساسية للالألديكارب. على الرغم من أن التعرض الألديكارب أدى إلى عزلة homologs دودة العديد من الجينات العصبي ، الألديكارب التعرض وحدها لا يمكن تحديد الأدوار بكفاءة السائدة للجينات ومسارات معينة في الخلايا العصبية الحركية ايليجانس جيم. لهذا الغرض ، أدخلنا نهجا تكميلية التجريبي ، والذي يستخدم PTZ.
المسوخ العصبي عرض الظواهر واضحة ومتميزة من الشلل الناجم عن الألديكارب ، ردا على PTZ. البرية من نوع الديدان ، وكذلك مع عدم القدرة المسوخ محددة لإطلاق سراحهم أو تلقي أدن تشافيز ، لا تظهر حساسية واضحة لPTZ. ومع ذلك ، المسوخ GABA ، فضلا عن وظيفة عامة المسوخ متشابك ، وعرض التشنجات الأمامي في إطار زمني أو الجرعة بالطبع استجابة. المسوخ التي لا يمكن تنظيم سلبا على الافراج عن العصبي عامة ، وبالتالي تفرز كميات زائدة من أدن تشافيز على BWMs ، أصبحت مشلولة على PTZ. من الظواهر التي يسببها PTZ الطبقات متحولة منفصلة تشير إلى أن اتباع نهج متكامل مع الألديكارب ونماذج التعرض PTZ في ايليجانس جيم قد تعجل فهمنا العصبي. وعلاوة على ذلك ، ينبغي أن يظهر الفيديو كيف نؤدي المقايسات الدوائية تأسيس أساليب متسقة للبحوث ايليجانس جيم.
Protocol
الألديكارب التعرض بارادايم
- في اليوم الأول ، وضمان أن لا يقل عن ثلاثين مرحلة الشباب البالغين الديدان كل الوراثي وتكرار كل ستتوفر لفحوصات الألديكارب في اليوم الثاني. فمن الأفضل إذا كان يختار المجرب خمسين أو أكثر الديدان المرحلة L4 على لوحات NGM الطازجة (بدون النيستاتين أفضل) ، والتي تحتوي E. القولونية (يفضل OP50) كمصدر للغذاء ، وتنمو عليها ل12-24 ساعة عند درجة حرارة ثابتة والإباحية (20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية هو أفضل ، على الرغم من أن درجة حرارة 25 مئوية على ما يرام).
- في اليوم الثاني ، وجعل أسهم 100 ملم حل الألديكارب الايثانول مع 70 ٪ (EtOH) و 30 ٪ DDH 2 O. انتشار كمية مناسبة من الألديكارب على لوحات NGM ناقص النيستاتين مع وحدات التخزين المحددة لتحقيق تركيزات الألديكارب المطلوب. نحن باستمرار استخدام الألديكارب 0.5 مم الطلاء 37.5 ميكرولتر من الألديكارب 100 ملم على 7.5 مل لوحات NGM. السماح لوحات الألديكارب لتجف لمدة 30-60 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. ليس من الضروري للقضاء على هذه الأغطية. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة إلى الألديكارب NGM وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
- بعد التجفيف ، لوحة متناسقة من وحدات التخزين E. القولونية (يفضل OP50) على مركز كل لوحة الألديكارب وجافة لمدة دقيقتين 30-60 في درجة حرارة الغرفة. نحن باستمرار لوحة 25 ميكرولتر من OP50 ، مما يخلق الحشيش الغذاء الحجم بما فيه الكفاية للحفاظ على الديدان تتركز في بقعة صغيرة من دون الاكتظاظ.
- عندما العشب الغذائية الجافة ، ويمكن للمرء أن المضي قدما في المقايسات الألديكارب. نظرا لطبيعة الشخصية للفحوصات الألديكارب ، يوصى بشدة أن يكون أجرى تجارب "عمياء". ويمكن لزميل المجرب الأولية إعادة تسمية لوحات أصلية مع الديدان أن يعاير. وبالمثل ، يمكن نقل الزميل الديدان من اللوحات الأصلية لوحات الألديكارب مشفر مباشرة قبل بدء الموقت. إذا المجرب تتوقع يعاير سلالة معينة من الديدان مع النمط الظاهري مميزة ، مثل uncoordination ، ثم يجب أن يكون هناك أيضا عنصر تحكم مع النمط الظاهري مماثلة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك ، فمن الأفضل إذا المجرب المقايسات سلالة من النوع البري ، فضلا عن سلالة مقاومة شديدة الحساسية والتوتر ، بالتوازي مع المساعدة على توحيد التجارب. يجب أن نسعى جاهدين لالمجرب تحليل عدد ثابت من الديدان لكل تكرار. نحن نحلل على الدوام thirty الديدان من النمط الجيني واحدة لكل تكرار. نقوم ايضا على الاقل ثلاثة مكررات لكل تجربة. يجب على خبرة المجرب يكون قادرا على تحليل لا يقل عن ستة سلالات في وقت واحد.
- حساب عدد من الديدان التي شلت الحث على نحو يتفق مع كل دودة سلك البلاتين. نحن لدينا همز باستمرار الديدان مرتين في الرأس والذيل مرتين في كل 30 دقيقة ليصبح المجموع ثلاث ساعات. ويمكن أيضا وقف ضخ البلعوم يمكن استخدامها لتحديد الشلل ، ولكن فقط إذا كان مجرب يعمل على تعريف ثابت من الشلل على جميع المقايسات. أيضا ، تجدر الإشارة إلى أن بعض الديدان ، وخاصة تلك التي تقاوم الألديكارب ، قد يحاول الزحف بعيدا عن اللوحة. في هذه الحالة ، قد انتشرت المجرب مبلغ ثابت من الحمض النخيلي ، وهو حاجز مادي لتنقل الدودة ، حول لوحات الألديكارب. نحن انتشار 25 ميكرولتر من 10 ملغ حمض EtOH / مل بالميتيك.
PTZ التعرض بارادايم
- في اليوم الأول ، وضمان أن لا يقل عن ثلاثين مرحلة الشباب البالغين الديدان كل الوراثي وتكرار كل ستتوفر لفحوصات PTZ في اليوم الثاني. فمن الأفضل إذا كان يختار المجرب خمسين أو أكثر الديدان المرحلة L4 على لوحات NGM الطازجة (بدون النيستاتين أفضل) ، والتي تحتوي E. القولونية (يفضل OP50) كمصدر للغذاء ، وتنمو عليها ل12-24 ساعة عند درجة حرارة ثابتة والإباحية (20 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية هو أفضل ، على الرغم من أن درجة حرارة 25 مئوية على ما يرام).
- في اليوم الثاني ، وجعل PTZ 0.5 غرام / مليلتر DDH الأسهم O 2 حل PTZ. انتشار كمية مناسبة من PTZ على NGM ناقص لوحات النيستاتين مع وحدات التخزين المحددة لتحقيق تركيزات PTZ المطلوب. لأننا نفضل الجرعة والاستجابة لفحوصات PTZ ، ونحن لوحة كميات مختلفة من لوحات PTZ على 7.5 مل NGM. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن صفيحة 37.5 ميكرولتر من محلول المخزون PTZ على طبق من 7.5 مل NGM لجعل PTZ 5 ملغ / مل حل. السماح لوحات PTZ لتجف لمدة دقيقة تقريبا 60-120 في درجة حرارة الغرفة. ليس من الضروري للقضاء على هذه الأغطية. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة PTZ NGM مباشرة ، ولكن ينبغي استخدامه على الفور لفحوصات بعد ترسيخ. استقرار PTZ هو أقل بكثير من الألديكارب. لذلك ، مع لوحات قديمة المقايسات PTZ هي أقل موثوقية. يجب أن يتم تخزينها في PTZ -20 درجة مئوية في مجفف مع وكيل التجفيف قبل استخدامها. نحن نفضل تجاهل PTZ شهرين تقريبا بعد الافتتاح لضمان الاستقرار.
- بعد التجفيف ، لوحة متناسقة من وحدات التخزين E. القولونية (يفضل OP50)على مركز كل لوحة PTZ وجاف لمدة دقيقتين 30-60 في درجة حرارة الغرفة. نحن باستمرار لوحة 25 ميكرولتر من OP50 ، مما يخلق الحشيش الغذاء الحجم بما فيه الكفاية للحفاظ على الديدان تتركز في بقعة صغيرة من دون الاكتظاظ.
- عندما العشب الغذائية الجافة ، ويمكن للمرء أن المضي قدما في المقايسات PTZ. على الرغم من المقايسات PTZ أقل من المقايسات الألديكارب الذاتية ، فإنه لا يزال ينصح بشدة أن يكون أجرى تجارب "عمياء". ويمكن لزميل المجرب الأولية إعادة تسمية لوحات أصلية مع الديدان أن يعاير. وبالمثل ، يمكن نقل الزميل الديدان من اللوحات الأصلية لوحات PTZ مشفر مباشرة قبل بدء الموقت. إذا المجرب تتوقع يعاير سلالة معينة من الديدان مع النمط الظاهري مميزة ، مثل uncoordination ، ثم يجب أن يكون هناك أيضا عنصر تحكم مع النمط الظاهري مماثلة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك ، فمن الأفضل إذا المجرب المقايسات سلالة من النوع البري ، فضلا عن التوترات مع تشنجات ، أو كامل الجسم الأمامي ، بالتوازي للمساعدة في توحيد التجارب. يجب أن نسعى جاهدين لالمجرب تحليل عدد ثابت من الديدان لكل تكرار. نحن نحلل على الدوام thirty الديدان من النمط الجيني واحدة لكل تكرار. نقوم ايضا على الاقل ثلاثة مكررات لكل تجربة. يجب على خبرة المجرب يكون قادرا على تحليل ما لا يقل عن ثلاث سلالات في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن تواتر وكثافة PTZ بفعل التشنجات الذروة عادة بين 15-30 دقيقة من التعرض ، ومن ثم تخفيف والديدان أصبحت مشلولة ، أو في بعض الحالات ، ويتأقلم مع الدواء.
- عد عدد من "الصرع مثل" تشنج الديدان كل 30 دقيقة ليصبح المجموع ساعة واحدة. فمن الأفضل أن يسجل عدد من الديدان مع التشنجات الأمامي ، والذي نطلق عليه اسم "وجها البوب" ، بمعزل عن عدد من الديدان لكامل الجسم مع التشنجات ، وشلل كامل الجسم ، والذي نطلق عليه اسم "منشط" أو مزيج من التشنجات الأمامي مع BWM الشلل الذي نطلق عليه اسم "منشط - الارتجاجية". معظم الديدان من النمط الجيني واحد يحمل واحد فقط نوع من التشنج. ومع ذلك ، منشط ، رمعي الديدان غالبا ما تصبح منشط تماما ، لذلك ينبغي للمرء أن يواصل مقايسة الماضي 30 دقيقة ، حتى لو كانت جميع الديدان أظهرت بالفعل التشنجات. أيضا ، تجدر الإشارة إلى أن بعض الديدان قد يحاول الزحف بعيدا عن اللوحة. في هذه الحالة ، قد المجرب انتشار كمية الحامض النخيلي ثابت من حول لوحات PTZ. نحن انتشار 25 ميكرولتر من 10 ملغ حمض EtOH / مل بالميتيك.
السلوكية ردود مختارة جيم ايليجانس المسوخ نقل متشابك إلى ألديكارب وPTZ
| اسم متحولة | دور متشابك | السلوك دون مخدرات | وردا على ألديكارب السلوكية (مقارنة البرية من نوع N2) | السلوكية وردا على PTZ |
|---|---|---|---|---|
| توم - 1 (ok188) | يمنع انتقال متشابك | غير المنسقة | تعزيز معدل الشلل | تمييزه عن نوع البرية |
| UNC - 43 (n498n1186) | معقد | غير المنسقة | تعزيز معدل الشلل | كامل الجسم التشنجات |
| UNC - 25 (e156) | يشجع انتقال GABA | غير المنسقة | تعزيز معدل الشلل | الأمامي والتشنجات ، شلل كامل الجسم |
| SNB - 1 (md247) | يشجع انتقال متشابك | غير المنسقة | انخفاض معدل الشلل | التشنجات الأمامي |
| UNC - 4 (E120) | أدن تشافيز يعزز انتقال | غير المنسقة | انخفاض معدل الشلل | تمييزه عن نوع البرية |
ويمكن استخدام اثنين من المنبهات العصبية ، مثبط أستيل ، ودعا الألديكارب ، ومستقبلات GABA ، ودعا pentylenetetrazole (PTZ) ، بطريقة مكملة لوصف جيم ايليجانس المسوخ انتقال متشابك. أستيل مثير الفائض (ACH) يتراكم في الجسم العصبية والعضلية دودة تقاطعات الحائط (NMJs) من الطفرات المؤذية في المنظمين السلبية للانتقال أدن تشافيز (مثل توم UNC - 1 و 43) أو المنظمين الإيجابية للانتقال المثبطة GABA (على سبيل المثال ، UNC - 25). على العكس ، هي تضاؤل مستويات مثير أدن تشافيز في NMJs الدودة التي الطفرات الضارة في التنظيم الإيجابي للانتقال متشابك العامة (على سبيل المثال ، SNB - 1) أو انتقال الجينات أدن تشافيز محددة (مثل UNC - 4). بالمقارنة مع الديدان N2 من النوع البري ، والديدان متحولة مع ارتفاع مثير انتقال أدن تشافيز في معرض NMJs تعزيز معدلات الألديكارب الشلل الناجم ، في حين خفضت الديدان متحولة مع انتقال أدن تشافيز مثير تثبت انخفاض معدلات الألديكارب التي يسببها الشلل. على الرغم من أن يعطل التزامن PTZ العصبية في عضلات ايليجانس جيم جدار الجسم ، وليس خلافا الألديكارب ، PTZ أيضا يعادى المثبطة GABA في عضلات الرأس ايليجانس جيم. نتيجة لذلك ، يمكن الألديكارب الحساسية لا يمكن التنبؤ بدقة PTZ الحساسية. متحولة الديدان بعيوب محددة في regul سلبية أو إيجابيةأوجه انتقال أدن تشافيز لا يمكن تمييزها عن الديدان N2 من النوع البري في حضور PTZ ، بينما الديدان متحولة مع عيوب في التنظيم الإيجابي للانتقال متشابك عامة أو عيوب معينة في المعرض انتقال المثبطة GABA PTZ قوية بفعل التشنجات الأمامي. وعلاوة على ذلك ، UNC - 43 خسارة وظيفة من المسوخ عرض كامل الجسم التشنجات في حضور PTZ وعلى الأرجح إضافية شذوذ انتقال متشابك ، والتي تسهم في ردودهم المخدرات فريدة من نوعها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكولات الحالية للتعرض الألديكارب مع جيم ايليجانس المجربون لا تسمح للتمييز بين المسوخ التي تعاني من عجز معين في انتقال أدن تشافيز والمسوخ التي تعاني من عجز معمم في نقل متشابك ، وكلتا الفئتين من المسوخ المعرض مقاومة الألديكارب. وبالمثل ، لا يمكن أن تستخدم لالألديكارب تحديد ما إذا كان قد عجز محددة المسوخ في انتقال GABA معمم أو الفشل لتنظيم انتقال سلبا أدن تشافيز ، وكلتا الفئتين من المسوخ المعرض فرط الحساسية للالألديكارب. نتائج فحوصات لدينا من التعرض PTZ ، وعندما يقترن نتائج فحوصات التعرض الألديكارب ، يسمح للباحثين لوصف أفضل المسوخ انتقال متشابك.
ويمكن تصنيف جيم ايليجانس المسوخ انتقال متشابك بطريقة مباشرة بواسطة الألديكارب التكميلية ونماذج التعرض PTZ. المسوخ الألديكارب مقاومة مع PTZ بفعل التشنجات الأمامي من المرجح قصور في وظيفة عامة متشابك. على العكس ، من دون مقاومة المسوخ الألديكارب PTZ بفعل التشنجات الأمامي من المرجح ناقصة وتحديدا في نقل أدن تشافيز. المسوخ مع فرط الألديكارب ، الذي لا يحمل PTZ بفعل التشنجات الأمامي ، من المرجح أن تفشل تنظيم انتقال سلبا أدن تشافيز. أخيرا ، مع فرط الحساسية الألديكارب المسوخ ، والتي لا تظهر PTZ بفعل التشنجات الأمامي ، هي GABA المرجح ناقصة.
ضعفت أيضا فائدة التعرض الألديكارب بواسطة الذاتية لها ، وغالبا ما تكون مختلفة المجربون تعريفات متفاوتة من الشلل. ويمكن للتقنية واحد مجرب وتتذبذب أيضا. الديدان أيضا ، الألديكارب المعرضة للتحرك بشكل مختلف استجابة لقوى متنوعة من الحث. يمكن التمييز بين دودة مشلولا ودودة تستجيب تكون خفية مثل رئيس طفيفة أو نشل الذيل. بالإضافة إلى استكمال المقايسات الألديكارب أفضل توصيف C. المسوخ ايليجانس انتقال متشابك ، يمكن أيضا أن تستخدم لPTZ عزل المسوخ انتقال متشابك ، وخصوصا تلك المسوخ مع فرط الحساسية للالألديكارب. قد المجربون ، التي تستخدم PTZ ، والتعرض لمجرد نظرة التشنجات الأمامية ، بدلا من الفروق الدقيقة في الألديكارب التي يسببها الشلل.>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد مولت وجائزة باسل أوكونور الباحث العلمي من مارس من الدايمات وجائزة المهنة من مؤسسة العلوم الوطنية في GAC ، فضلا عن بحوث العلوم الجامعية برنامج منحة من معهد هوارد هيوز الطبي في جامعة ألاباما ، واستثارة العصبية البحث الصرع في مختبر كالدويل.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
