प्रारंभिक चिकी भ्रूण पूर्व vivo (नई संस्कृति) की संस्कृति के लिए विधि
Summary
यह वीडियो नई संस्कृति, एक तरीका है जिसके द्वारा लड़की भ्रूण अंडे के बाहर 24 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं दर्शाता है. इस विधि जल्दी (14 सोम के लिए आदिम लकीर) विकास, एक माउस में E7-9 इसी अवधि के अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. इस तकनीक का आवेदन electroporation स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में शामिल हैं.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह गठन और मस्तिष्क, तंत्रिका ट्यूब somite, और दिल primordia patterning के अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. लड़की भ्रूण संस्कृति के आवेदन डीएनए या शाही सेना के constructs electroporation शामिल क्रम में स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में जीन समारोह, विकास FGFs और BMPs जैसे कारक लिपटे मोतियों के grafts के रूप में अच्छी तरह से पूरे माउंट का विश्लेषण है. इस वीडियो लड़की भ्रूण संस्कृति में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहले, भ्रूण खारा में explanted है. फिर, भ्रूण एक गिलास अंगूठी पर केंद्रित है. भ्रूण झिल्ली अंगूठी की दीवारों के साथ उठा रहे हैं. अंगूठी तो albumine का एक पूल युक्त एक संस्कृति डिश में रखा गया है. संस्कृति डिश मोहरबंद और एक नम कक्ष में रखा, जहां भ्रूण 24 बजे तक के लिए सुसंस्कृत है. अंत में, भ्रूण की अंगूठी से निकाल दिया जाता है, फिक्स्ड और अधिक अनुप्रयोगों के लिए संसाधित. समस्या निवारण मार्गनिर्देशिका भी प्रस्तुत किया है.
Protocol
Discussion
नई संस्कृति विधि 2 आवेदनों की एक विस्तृत विविधता, वृद्धि स्वस्थानी संकरण और पूरे माउंट 4 immunohistochemistry में 3 पूरे माउंट करने के लिए मोती, युक्त कारक के grafts से लेकर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक 24 घ?…
Acknowledgements
यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Riferimenti
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
