初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法
Summary
このビデオでは、新しい文化、最大24時間までのニワトリ胚が卵の外側に培養される方法を示しています。このメソッドは1つが、マウスのE7 – 9に相当する期間を早期に開発を（14 SOMの原条。）勉強することができます。この技術のアプリケーションでは、in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学では、エレクトロポレーションが含まれています。
Abstract
ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さ、それを脳、神経管、体節、心臓原基の形成およびパターニングを研究するための理想的なツールとなっています。ニワトリ胚培養のアプリケーションでは、成長因子の移植、遺伝子機能を解析するためにそのようなFGFのとBMPだけでなく、in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の全体マウントとしてコーティングされたビーズをDNAまたはRNA構築物のエレクトロポレーションが含まれています。このビデオでは、ニワトリ胚培養における異なる手順を示し、まず、胚は生理食塩水に植されています。その後、胚をガラスリングの中央に配置されます。胚を包む膜は、リングの壁に沿って持ち上げられて。リングは、アルブミンのプールを含む培養皿に置かれます。培養皿を密封し、胚が最大24時間培養された湿潤なチャンバ内に置かれます。最後に、胚は、リングから削除さに固定し、さらにアプリケーション用に処理されます。トラブルシューティングガイドも表示されます。
Protocol
Discussion
新しい培養法2は、in situハイブリダイゼーションおよび全体のマウント免疫組織化学4 に全体のマウントにビーズ3を 、含んでいる成長因子の移植に至るまで幅広いアプリケーションに使用できます。 24時間の期間にわたって文化は、そのような時間経過の細胞運動の分析5あるいはエレクトロポレーションの構成要素6を含むGFPの監視などのアプリ?…
Acknowledgements
この作品は、RHFへマーガレットM. Alkek財団によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
Riferimenti
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
