Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter
Summary
Detta är tänkt som en introduktion till patch clamp-inspelning från Xenopus laevis oocyter. Det omfattar vitelline membran borttagning, bildandet av en gigaohm tätning (gigaseal) och valfria omvandlingen av plåstret på utsidan ut topologi.
Abstract
Sedan dess utveckling genom Sakmann och Neher 1, 2, har patch clamp etablerat sig som en mycket användbar teknik för elektrofysiologiska mätningar av ett eller flera jonkanaler i cellerna. Denna teknik kan tillämpas på jonkanaler i både deras naturliga miljö och uttrycks i heterolog celler, t.ex. oocyter skördats från klor afrikanska grodan, Xenopus laevis. Här beskriver vi den väletablerade tekniken med patch clamp inspelning från Xenopus oocyter. Denna teknik används för att mäta egenskaperna hos uttryckt jonkanaler antingen i populationer (macropatch) eller individuellt (singel-kanals inspelning). Vi fokuserar på tekniker för att maximera kvaliteten i äggcellen förberedelse och tätning generation. Med alla faktorer optimeras, ger denna teknik en sannolikhet för framgångsrik säl generationen över 90 procent. Processen kan optimeras på olika sätt av varje forskare bygger på de faktorer som han eller hon finner viktigast, och vi presenterar den metod som lett till den största framgången i våra händer.
Protocol
Discussion
Det finns många parametrar elektrofysiologiska inspelning inte diskuteras här. Rigg setup, system för bullerbekämpningen, kanal uttryck, och protokoll inspelning är alla också kritiska till goda experimentella resultat.
Enligt vår erfarenhet, dessa är de mest kritiska parametrarna för att bilda pålitliga tätningar: hög kvalitet ägg, ta bort vitelline membranet snabbt (aka "peeling"), använder nya drog pipetter skyddas från damm, släta pipetter, positivt tryck användas vid inträde i badet lösning, korta t…
Acknowledgements
Krympande lösning recept från labbet i RW Aldrich. Vi tackar följande finansiärer och stiftelser till stöd: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, muskeldystrofi Association, Donald B. och Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein fonden och McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA or Axon | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mM N-methyl-D-glucamine 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Aspartic Acid 220 KCl 2 pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Laboratories INC | 146481 |
Riferimenti
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. . Single-channel Recording. , (1983).
