Summary
Fundamentais, ainda propriedades únicas do sistema olfativo dos roedores, levaram ao seu estudo crescente entre os biólogos. A avaliação relativamente simples de sua função é, então, também é necessário. Aqui nós descrevemos testes sensíveis para a caracterização da sensibilidade olfativa do mouse e preferência.
Abstract
O sistema olfativo dos roedores é de crescente interesse para os cientistas, estudou, em parte, em biologia de sistemas por causa do seu circuito, estereotipada, porém acessível. Além disso, a capacidade única desta área para gerar novos neurônios ao longo da vida de um organismo faz com que seja um sistema atraente para os biólogos do desenvolvimento e regenerativos semelhantes. Tal interesse exige um meio para uma avaliação rápida, mas confiável da função olfativa. Muitos testes de capacidade olfativa é complexa, variável ou não projetados especificamente para ratos. Além disso, alguns testes são sensíveis a déficits de memória, bem como defeitos na capacidade olfativa, confundindo resultados obtidos.
Aqui, descrevemos uma simples bateria de testes para identificar defeitos na sensibilidade olfativa e preferência. Primeiro, uma avaliação da saúde geral inicial permite a identificação de animais adequados para testes adicionais. Segundo, os ratos são expostos a várias diluições de aromas para verificar se há uma diferença de limiar. Em terceiro lugar, os camundongos são apresentados com aromas diversos, atraente e aversivo, que permitem a avaliação de preferência olfativa. Estes estudos simples deve fazer a primeira caracterização do comportamento olfativo acessíveis para laboratórios de recursos variados e expertise.
Protocol
Exame Geral de Saúde
Um tratamento mais abrangente dos exames de saúde geral podem ser encontradas em Crawley recurso Jacqueline de fenotipagem excelente comportamento, que há de errado com o meu mouse? 1. Primeiro, use uma bateria de testes modificados observacional para avaliar a saúde geral do assunto. A bateria inclui itens do protocolo de Samuel Irwin avaliação abrangente de 2 a identificar rapidamente os assuntos que serão inadequados para testes adicionais. Em breve, a bateria modificada identifica os animais que são fisicamente anormais (por exemplo severamente sub ou excesso de peso, mal preparado, dispnéico) ou que apresentam postura anormal de locomoção, ou comportamentos. Estes todos poderiam ser manifestações da doença. Qualquer avaliação inicial que identifica de forma semelhante assuntos insalubre é apropriado.
Também é importante notar que os animais são usados de forma humana, tanto durante o exame de saúde geral, bem como durante os testes subseqüentes. Sem anestesia ou analgesia é usado como estes testes não incorporam quaisquer procedimentos potencialmente dolorosos.
Teste de Sensibilidade olfativa
Este teste foi concebido para detectar uma diferença de sensibilidade olfativa entre dois grupos de camundongos (por exemplo, digite um selvagem e um grupo mutante de animais). Neste teste, diluições múltiplas de um perfume são feitas. Um animal de ingênua, em seguida, investiga uma diluição única de este perfume eo tempo total de exploração (dentro de 3 minutos) é registrado. Diluições múltiplas do perfume são testados em diferentes, os indivíduos ingênuos e do tempo total exploratória é usada para gerar curvas de dose-resposta para cada grupo de camundongos. Dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição.
Pesquisador principal
- Obter quatro gaiolas limpas (8 H x 10 W x 18 L, em polegadas), todas sem fundamento. Alinhe os quatro gaiolas no gabinete de biossegurança.
- Configurar partições entre cada arena usando filtro de papel opaco. Coloque um cartaz em preto em toda a partição final de tal forma que as linhas laterais pretas ao lado e fundo da gaiola. Cobrir a parte superior da arena com um pedaço transparente de acrílico para permitir a luz para iluminar a arena.
(A)
(B) 
Figura 1. Arena Set-Up. (A) adequadamente coberto arena, vazia (b) Arena com o assunto e perfumado papel de filtro. - Começar a habituar os indivíduos. Colocar o assunto em primeiro lugar na primeira gaiola de habituação. Após 15 minutos, mova o primeiro tópico da segunda gaiola. Limpar a gaiola primeiro com TB Quatricide. Em seguida, coloque o assunto em segundo lugar na gaiola, primeiro limpa. Continue esse processo com assuntos subseqüentes. Em última análise, cada indivíduo deve ser habituado em todas as três gaiolas antes de serem colocados na arena (gaiola quarto e último) por mais 15 minutos de habituação antes do teste.
(B) 
Pesquisador cego
- Faça um número apropriado de 2 polegadas por 2 polegadas quadrados de papel de filtro para amostras perfume.
- Usando o perfume pré-selecionados, devidamente diluir. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex.
- Definir um dispositivo de gravação digital de vídeo na extremidade do gabinete de segurança biológica de tal forma que o fim gaiola inteira está em foco. Tome um vídeo preliminar para assegurar os parâmetros são adequados.
- Gravar a ordem em que serão testadas diluições, tomando cuidado para randomizar a ordem dos julgamentos.
- Ninhada registro assunto e números de identificação.
- Uma vez que o assunto tem sido habituados por 15 minutos na arena, começar a preparação para o primeiro julgamento. Pipeta primeira diluição cima e para baixo no tubo cônico antes de pipetar-lo para um quadrado de papel de filtro. A superfície do papel filtro deve ser otimizada cobertos ~ 85% (cerca de 0,50 ml de solução). Use uma kimwipe para certificar-se do papel de filtro não é muito saturado.
- Iniciar a gravação de vídeo.
- Coloque o quadrado de papel de filtro na gaiola no lado oposto da posição atual do animal.
- Começar a cronometragem.
- Após 3 minutos, parar a gravação e remover o cheiro diluído.
- Se apenas um aroma (por exemplo, canela) está a ser testado, remova o assunto primeiro teste da arena. Repita os passos 6-11 para cada animal, devidamente diluir o perfume para cada assunto. Se mais de um perfume deve ser testado, no entanto, não remova o assunto de teste da arena. Em vez disso, começar a cronometragem.
- Apropriadamente diluir o cheiro seguinte usando os mesmos métodos listados acima.
- Após 1 minuto, iniciar a gravação de vídeo. Coloque o quadrado de papel de filtro com a diluição do cheiro próximo a gaiola na extremidade oposta da positio atual do animaln.
- Repita os passos 6-13 para cada perfume, observando o número de arquivos de vídeo para cada julgamento.
- Repita os passos 6-14 para cada assunto.
Figura 2. Resultados representativos para uma sessão de testes de sensibilidade olfativa. Cada rato tanto do grupo controle (Grupo A) ou o grupo experimental (Grupo B) foi exposto a um dos cinco diferentes diluições de extrato de canela em papel de filtro para uma sessão minuto, três. Tempo total gasto explorando o papel de filtro foi avaliada. Ratos do grupo A têm uma maior sensibilidade olfativa do que os do Grupo B.
Teste de Preferência olfativa
Este teste foi concebido para identificar as deficiências específicas de detecção, ou seja, a capacidade de sentir cheiros atraentes ou aversivo. O procedimento a seguir toma emprestado livremente a partir do protocolo de Kobayakawa, K., et al.3. Novamente, dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição. O tempo total exploratória é novamente gravado (em cima da visão de vídeo) para diversos aromas. Aqueles perfumes com um total de vezes maior do que a água exploratória são designados como "atraente", enquanto aqueles com menos de água vezes são chamadas de "aversão". O pesquisador então se considera os perfumes são mesmo "atraente" ou "aversão" para assuntos de teste diferente.
Por favor, siga os passos 1-3 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador principal.
Pesquisador cego
O procedimento para o teste de preferência olfativa é o mesmo, com ligeiras modificações das etapas 2 e 4. Por favor, siga os passos 1-15 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador cego, com as seguintes alterações: Para a etapa 2, usando os aromas pré-selecionadas (uma combinação de aromas atraentes e aversivo), tornam as soluções adequadamente diluída de cada um em tubos cônicos. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex. Para a etapa 4, ao invés de gravar a diluição a ser testada, gravar a ordem dos aromas variados que serão testados, randomizing a ordem dos julgamentos.
Este teste foi concebido para identificar as deficiências específicas de detecção, ou seja, a capacidade de sentir cheiros atraentes ou aversivo. O procedimento a seguir toma emprestado livremente a partir do protocolo de Kobayakawa, K. et al. 3. Novamente, dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição. O tempo total exploratória é novamente gravado (em cima da visão de vídeo) para diversos aromas. Aqueles perfumes com um total de vezes maior do que a água exploratória são designados como "atraente", enquanto aqueles com menos de água vezes são chamadas de "aversão". O pesquisador então se considera os perfumes são mesmo "atraente" ou "aversão" para assuntos de teste diferente.
Por favor, siga os passos 1-3 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador principal.
Pesquisador cego
O procedimento para o teste de preferência olfativa é a mesma, com pequenas modificações de passos 2, 4 e 13. Por favor, siga os passos 1-15 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador cego, com as seguintes alterações: Para a etapa 2, usando os aromas pré-selecionadas (uma combinação de aromas atraentes e aversivo), tornam as soluções adequadamente diluída de cada um em tubos cônicos. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex. Para a etapa 4, ao invés de gravar a diluição a ser testada, gravar a ordem dos aromas variados que serão testados, randomizing a ordem em cada tentativa. Para a etapa 13, colocar o quadrado de papel de filtro com o cheiro próximo a gaiola no lado oposto da posição atual do animal.
Figura 3. Resultados representativos para uma sessão de testes de preferência olfativa. Cada rato foi exposto a cada um dos diferentes aromas em papel de filtro para uma sessão minuto, três. Tempo total gasto explorando o papel de filtro foi avaliada. Manteiga de amendoim e baunilha são aromas atraentes (scent tempo exploratória> água tempo exploratório) e 2-Methylbutyric ácido é aversivo (scent tempo exploratória <água tempo exploratório).
Pontuação dos Testes Olfactory
Depois de adquirir todos os sensibilidade olfativa e vídeos de preferência, é necessário analisar o tempo total gasto explorando cada diluição / perfume. Têm o pesquisador cego analisar todos os vídeos para a consistência.
- Visualizar a video, observando o seguinte: a) quando o papel filtro é colocado na arena, b) quando o mouse se aproxima do papel de filtro, c) quando o mouse investiga o papel de filtro e d) quando tenham decorrido três minutos (a partir de quando o filtro papel foi colocado na arena). Saber quando o foco sobre o comportamento do rato torna mais fácil com precisão a pontuação do tempo total gasto explorando após a revisão.
- Rever o vídeo. Observe o momento em que o primeiro rato investiga o papel de filtro (latência).
- Usando um cronômetro o tempo, todas as investigações dentro de três minutos de colocar o papel de filtro na arena. O tempo de investigação é definido como qualquer momento em que o mouse narinas são <1 mm a partir do papel de filtro. É importante não incluir qualquer parte do tempo quando o mouse está em estreita proximidade com o papel de filtro, mas não é ativamente investigando o caso. Não incluem surtos de mastigação e lambendo o papel ou surtos de sentar-se sobre o papel no tempo total de exploração. É necessário aderir de perto e de forma consistente com estas regras com precisão analisar o comportamento olfativo.
- Tempo de latência Record, o tempo total gasto investigando o papel de filtro e número de arquivo de vídeo.
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Discussion
Os testes citados permitem a avaliação rápida e confiável da função olfativa básica. Não é para ser esquecido, no entanto, que essa confiabilidade requer a seleção adequada e preparação de temas para o teste. Animais que estão doentes ou incapacitados são muitas vezes assuntos de teste inconsistentes. Além disso, a habituação dos assuntos de teste é fundamental. Descobrimos que o uso de gaiolas múltiplas durante o processo de habituação permite que os animais se sentem confortáveis com experimentador manuseio e mudando arredores. Temos também descobriu que os tempos mais curtos do que os indicados para a habituação não são suficientes para reduzir a ansiedade. Animais ansiosos também são muitas vezes assuntos de teste imprevisível e pode obscurecer diferenças verdadeiras.
No próprio ensaio dos camundongos, é importante não apenas para ser consistente quando a aquisição dos dados, mas também em analisar o comportamento dos sujeitos. Nós descobrimos que é útil apenas para contar o tempo em que o nariz da cobaia é <1 mm a partir do papel de filtro, como parte do tempo total de exploração. Além disso, comportamentos como morder ou mastigar o filtro de papel não estão incluídos no tempo total de exploração. Além disso, a latência do tempo (por aromas atraentes) também pode ser uma métrica útil. Diferentes origens ratos podem exigir diferentes diluições de aromas para a discriminação efetiva entre um grupo controle e experimental. Também é importante para o sexo e idade match-match-pares. Encontrámo-lo útil para derivar empiricamente diluições perfume apropriado (sobre temas semelhantes ao grupo controle) antes de prosseguir com o teste experimental de camundongos ingênuos. Finalmente, estes testes foram selecionados para minimizar o efeito de qualquer deficiência cognitiva outros, mais notavelmente, defeitos na aprendizagem e / ou memória. Para o efeito, é fundamental usar camundongos ingênuos para testes.
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Acknowledgments
Financiamento: Este trabalho foi financiado por uma HQ & Stuart Fellowship Victoria Quan Predoctoral (FMR), Prêmio NIH Pioneer (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
