Метод полного окрашивания антител горе в Чик
Summary
Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для исследования антител выражение в развитии мозга, нервной трубки и сомитов. Это видео демонстрирует различные этапы в целом монтажа антител окрашивания использования HRP сопряженных вторичными антителами; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эндогенной пероксидазы инактивированная; эмбрион затем подвергаются первичного антитела. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали с вторичными антителами конъюгированных с ПХ. Пероксидазы активность обнаруживаются с помощью реакции с диаминобензидина подложки. Наконец, зародыш фиксируется и обрабатывается для фотографирования и секционирования. Преимущество этого метода по сравнению с использованием флуоресцентных антител является то, что эмбрионы могут быть обработаны для воска секционирования, что позволяет изучать антигена сайтов в поперечном сечении. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
Discussion
Это видео демонстрирует различные этапы в выполнении целого монтажа антител окрашивания у молодых куриных эмбрионов. Этот протокол существенно используется пространственная и временная характеристика новых антител в куриных 2,3, а также для использования известных маркеров дл?…
Acknowledgements
Моноклональных антител (15.3B9, Pax7), разработанная (Дж. Додд, ТМ Jessell и А. Каваками) были получены из исследований развитием Гибридома Банке разработана под эгидой NICHD и поддерживается университете штата Айова, Отделение биологических наук , штат Айова. DP является получателем Рут Kirschstein премии 1F32-01A1 DA021977 из Национального института по злоупотреблению наркотиками. Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Altro | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
Riferimenti
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
