Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для исследования антител выражение в развитии мозга, нервной трубки и сомитов. Это видео демонстрирует различные этапы в целом монтажа антител окрашивания использования HRP сопряженных вторичными антителами; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эндогенной пероксидазы инактивированная; эмбрион затем подвергаются первичного антитела. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали с вторичными антителами конъюгированных с ПХ. Пероксидазы активность обнаруживаются с помощью реакции с диаминобензидина подложки. Наконец, зародыш фиксируется и обрабатывается для фотографирования и секционирования. Преимущество этого метода по сравнению с использованием флуоресцентных антител является то, что эмбрионы могут быть обработаны для воска секционирования, что позволяет изучать антигена сайтов в поперечном сечении. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Схема Обзор: Это видео демонстрирует различные этапы в целом иммуногистохимии монтирования в куриных эмбрионах. Во-первых, эмбрион закрепляется в PFA [IHC1]. Затем, эндогенной активности пероксидазы гасится [IHC2]. Эмбрион затем инкубировали в первичных антител [IHC3]. После нес…
Discussion
Это видео демонстрирует различные этапы в выполнении целого монтажа антител окрашивания у молодых куриных эмбрионов. Этот протокол существенно используется пространственная и временная характеристика новых антител в куриных 2,3, а также для использования известных маркеров дл?…
Acknowledgements
Моноклональных антител (15.3B9, Pax7), разработанная (Дж. Додд, ТМ Jessell и А. Каваками) были получены из исследований развитием Гибридома Банке разработана под эгидой NICHD и поддерживается университете штата Айова, Отделение биологических наук , штат Айова. DP является получателем Рут Kirschstein премии 1F32-01A1 DA021977 из Национального института по злоупотреблению наркотиками. Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Altro
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.