Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

Summary

Le crabe fer à cheval, américains, Limulus polyphemus, est sans doute la source la plus commode pour les grandes quantités de sang de tous les invertébrés. Le sang est simple dans sa composition, avec un seul type cellulaire dans la circulation générale, le Amébocytes granulaire, et seulement trois protéines abondantes dans le plasma, l'hémocyanine, les protéines C-réactive, et α2-macroglobuline. Le sang est recueilli par le cœur et les cellules du sang et le plasma sont séparées par centrifugation.

Abstract

La limule a le meilleur système caractérisé immunitaire de tout invertébré de longue durée. L'étude de l'immunité dans les limules a été facilitée par la facilité dans la collecte de grandes quantités de sang et de la simplicité du sang. Les limules afficher uniquement un seul type cellulaire dans la circulation générale, le Amébocytes granulaire. Le plasma a la teneur en sel de l'eau de mer et à seulement trois protéines abondantes, l'hémocyanine, la protéine respiratoires, les protéines C-réactive, qui fonctionnent dans la destruction cytolytique des cellules étrangères, y compris les cellules bactériennes, et α2-macroglobuline, qui inhibe les protéases des agents pathogènes envahisseurs. Le sang est recueilli par ponction cardiaque directe dans des conditions qui minimisent la contamination par le lipopolysaccharide (aka, endotoxines, LPS), un produit de la bactérie à Gram négatif. Un grand animal peut produire de 200 à 400 ml de sang. Pour l'étude du plasma, les globules sont immédiatement retirés du plasma par centrifugation, le plasma peut ensuite être fractionné en ses protéines constituantes. Les cellules sanguines sont idéalement étudiés au microscope par la collecte de petites quantités de sang dans le LPS sans solution saline isotonique (0,5 M de NaCl) dans des conditions qui permettent l'examen microscopique direct en plaçant l'un des plus LPS sans coverglasses sur la surface du plat de la culture, puis monter les coverglasses dans des chambres simple observation suivante fixation des cellules. Une deuxième préparation pour l'observation directe est de collecter 3 – 5 mL de sang dans un plat embryon LPS-libre et puis explantation des fragments de amebocytes agrégées pour une chambre qui sandwichs le tissu entre une lame et une lamelle. Dans cette préparation, le amebocytes mobiles migrent vers la surface lamelle, où ils peuvent être facilement observés. Le système de la coagulation du sang implique l'agrégation des amebocytes et la formation d'un caillot extracellulaire d'une protéine, coagulin, qui est libéré par les granules de sécrétion des cellules du sang. L'analyse biochimique des cellules sanguines lavées exige que l'agrégation et la dégranulation ne se produit pas, ce qui peut être accompli par la collecte de sang dans 0,1 volumes de 2% de Tween-20, 0,5 M de NaCl LPS-libres, suivi par centrifugation des cellules et de lavage avec 0,5 M NaCl.

Protocol

Caractéristiques anatomiques de la limule pertinents à une hémorragie (Fig. 1) Figure 1 Les trois principales divisions du corps, d'avant en arrière, sont les prosoma (P), le opisthosome (O), et le telson (T) 1. Les marges antérieures et latérales libres de la prosoma est la bride. L'in…

Discussion

Il ya quatre espèces de limules, polyphemus Limulus de la côte Est d'Amérique du Nord et trois espèces qui vont du Japon à la baie du Bengale. L'animal est identifié comme un "fossile vivant" parce que les formes anatomiquement similaires ont été trouvés comme des fossiles de 445 millions d'années ^27. La limule représente un animal à long terme, nécessitant 10 – 13 ans pour atteindre la maturité et la vie d'au moins 20 ans ^28. Bien qu'il ait été soumis à la récol…