Source: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Département des sciences biologiques, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Les cellules procaryotes sont capables d’habiter presque tous les environnements de cette planète. En tant que royaume, ils possèdent une grande diversité métabolique, leur permettant d’utiliser une grande variété de molécules pour la production d’énergie (1). Par conséquent, lors de la culture de ces organismes en laboratoire, toutes les molécules nécessaires et spécifiques nécessaires à la mise en énergie doivent être fournies dans les médias de croissance. Alors que certains organismes sont métaboliquement diversifiés, d’autres sont capables de survivre dans des environnements extrêmes tels que des températures élevées ou basses, un pH alcalin et acide, des environnements réduits ou absents en oxygène, ou des environnements contenant beaucoup de sel (2,3,4). Qualifiés d’« extrémophiles », ces organismes ont souvent besoin de ces environnements intenses pour proliférer. Lorsque les scientifiques cherchent à cultiver de tels organismes, les composants des médias ainsi que toutes les conditions environnementales spécifiques doivent tous être pris en compte afin de cultiver avec succès les organismes d’intérêt.
Les scientifiques sont capables de cultiver des organismes culturables en laboratoire parce qu’ils comprennent les exigences spécifiques dont ces espèces ont besoin pour croître. Cependant, les organismes culturables représentent moins de 1 % des espèces estimées à être sur la planète (5). Les organismes que nous avons détectés par séquençage génétique mais qui ne sont pas en mesure de croître en laboratoire sont considérés comme incultes (6). À l’heure actuelle, nous n’en savons pas assez sur le métabolisme et les conditions de croissance de ces organismes pour reproduire leur environnement en laboratoire.
Des organismes exigeants se situent quelque part entre les deux premiers. Ces organismes sont culturables, mais ils nécessitent des conditions de croissance très spécifiques, telles que des composants spécifiques des médias de croissance et/ou des conditions de croissance spécifiques. Deux exemples de ces genres sont Neisseria sp. et Haemophilus sp., qui nécessitent tous deux des globules rouges partiellement décomposés (également connu sous le nom d’agar de chocolat), ainsi que des facteurs de croissance spécifiques et un environnement riche en dioxyde de carbone (7). Sans tous les composants spécifiques requis, ces organismes ne se développeront pas du tout. Souvent, même avec toutes leurs exigences, ces organismes se développent mal.
Contrairement aux cellules eucaryotes, qui ne peuvent se développer que dans un environnement aérobie ou contenant de l’oxygène, les cellules procaryotes sont capables de se développer anaérobie en utilisant plusieurs voies de fermentation pour générer suffisamment d’énergie (8). D’autres procaryotes préfèrent un environnement microaérophile, ou réduit d’oxygène, ou même un environnement capnophilique, ou à haute teneur en dioxyde de carbone (9). Ces organismes sont plus difficiles à enrichir, car l’atmosphère doit être modifiée. Les scientifiques qui travaillent fréquemment avec des organismes sensibles à un environnement oxygéné travailleraient normalement dans une chambre anaérobie et un incubateur, où un gaz lourd et inerte comme l’argon est pompé pour déplacer l’oxygène (10). D’autres utilisent des systèmes de paquets de gaz scellés disponibles de façon conventionnelle qui utilisent de l’eau pour produire de l’hydrogène et du dioxyde de carbone, ainsi qu’un catalyseur comme le palladium pour éliminer tout l’oxygène atmosphérique. Ces kits disponibles dans le commerce peuvent créer l’une des conditions atmosphériques mentionnées ci-dessus (10).
Qu’il s’agisse de cultiver un agent pathogène pour déterminer une infection potentielle ou de chercher à identifier une espèce spécifique de bactéries présentes dans un environnement naturel, un problème existe. Aucune espèce bactérienne n’habite un seul habitat. Les bactéries vivent comme des communautés multicellulaires partout, de la peau des humains aux océans de notre planète (11). Lorsqu’ils tentent d’isoler une espèce de bactéries, les scientifiques doivent s’efforcer d’exclure les nombreux autres organismes qui habitent également la zone isolée. Pour cette raison, les supports de croissance enrichis pour les bactéries exercent souvent deux fonctions. La première est de rendre les médias sélectifs. Un agent sélectif empêchera certaines espèces de croître, sans qu’elles n’inhibent et, souvent, ne favorisent même pas la croissance d’autres espèces (12). La deuxième fonction des ingrédients des médias peut être de travailler comme agents différentiels. Ces agents permettent l’identification d’une caractéristique biochimique particulière d’un organisme isolé. En jumelant plusieurs médias sélectifs et différentiels différents ainsi que des conditions de croissance appropriées, les scientifiques et les diagnostiqueurs sont en mesure d’identifier la présence d’espèces bactériennes spécifiques à partir d’un isolat particulier.
Un exemple d’un média sélectif et différentiel aidant à l’identification est dans le cas de l’organisme cliniquement significatif Staphylococcus aureus. Cet organisme est généralement cultivé sur l’agar de sel de mannitol. Ce milieu sélectionne non seulement pour les organismes qui peuvent vivre dans un environnement de haute teneur en sel, qui comprennent certains grammes positifs comme Le Staphylococcus, mais il inhibe également tous les organismes sensibles au sel. Le sucre de mannitol est la composante différentielle de ce milieu. De toutes les espèces de Staphylococcus cliniquement significatives, seul S. aureus est capable de fermenter le mannitol. Cette réaction de fermentation produit de l’acide comme sous-produit, ce qui fait jaunir l’indicateur rouge rétorque dans les médias. D’autres espèces de Staphylococcus (comme Staphylococcus epidermidis) bien que capables de croître, laisseront les médias de couleur rouge.
Cet exercice de laboratoire démontre la technique aseptique appropriée, aussi bien que l’inoculation appropriée des médias de croissance du bouillon. Il introduit également la croissance d’organismes contaminants communs sur les supports d’enrichissement, l’utilisation d’un système de culture anaérobie paquet de gaz pour les bactéries anaérobies, et l’utilisation de différents médias sélectifs et différentiels pour l’identification présumée de gram bactéries positives et gramnégatives.
Mannitol Salt Agar (MSA): This medium is selective for gram positive organisms that are able to survive in 6.5% sodium chloride. The gram-negative organisms Escherichia coli and Proteus vulgaris should not be able to grow on this medium because of the high salt concentration. S. epidermidis and S. aureus should be able to grow. The media is differential between the two because the S. aureus is able to ferment the mannitol – turning the methyl red indicator bright yellow due to the production of acid as a fermentation by-product. S. epidermidis should maintained the pink color on the plate.
NOTE: If colonies are small, growth on this medium may require additional incubation for a total of up to 48 hours at optimal temperature – here, 37°C.
Eosin Methylene Blue agar (EMB): This medium is selective for gram negative organisms, so Escherichia coli and Proteus vulgaris plates should exhibit growth. The eosin and methylene blue dyes are toxic to gram positive cells so neither Streptococcus species should grow. The outer membrane of gram-negative cells prevents the dyes from entering the cells. This media is differential because it allows for one to test for the ability of the organism to ferment lactose. E. coli turns a bright purple color (often with a green metallic sheen if cultivated long enough) due to the fermentation of lactose in the media. The P. vulgaris, although able to grow, does not ferment lactose (however it is able to ferment other sugars).
Tryptic Soy Agar (TSA): This medium is non-selective, so all of the study species should grow. However, comparing the aerobic versus anaerobic conditions, the plates from the gas package should display less growth (and smaller colonies). This is because none of the bacteria grown in the demonstration are obligate aerobes, but their optimal growth condition does include oxygen.
Different bacterial species are able to grow in different environments and are able to use different carbon sources as a way of generating energy. When working with these as cultures in the lab, it is important to know the components of the growth media being worked with and to match the growth media to the bacterial species. Scientists and diagnosticians can also exploit the varying biochemical reactions as a way to isolate different species from others and as a way to distinguish and identify bacteria in a mixed environment.
Bacteria are able to inhabit almost every environment on Earth, from desert tundra to tropical rainforests. This ability to colonize vastly different niches is due to their adaptability and vast metabolic diversity, which allows them to utilize a wide variety of molecules for energy generation. It is this massive array of diversity which leads to the phenomenon that less than 1% of the bacterial species on the planet are considered culturable and these are only possible due to an understanding of their specific metabolic and environmental needs.
Performing manipulations of media and environment in the laboratory not only allows researchers to experiment to find the optimal conditions for culturing a species of interest, but it also enables enrichment, the process of changing conditions to select for specific species from a mixed culture. Some microbial species are generalists and able to tolerate a wide variety of states or environments. Such organisms may grow readily under laboratory conditions, but they may also be prevented from growing if given an extreme habitat – which can help if the goal is to enrich for organisms from a mixed culture which are tolerant to this condition.
Fastidious organisms can be culturable but only when specific conditions are met. Neisseria or Haemophilus species, for example, require media containing partially broken down red blood cells and a high carbon dioxide concentration, which may also discourage the growth of other species. Extremophiles are named for their preference for extreme conditions, such as very low or high temperatures, reduced or oxygen absent conditions, or in the presence of high salt. These conditions are likely intolerable to most other microbes.
To further enrich for an organism of interest, some media types contain indicators which give insight into the metabolism of the organism. Mannitol Salt Agar inhibits the growth of organisms sensitive to high salt. Gram negative bacteria typically cannot survive, but the gram positive Staphylococcus genus are able to thrive. In addition, the MSA agar indicates any colonies able to ferment mannitol because the acid byproducts of fermentation will turn the methyl red indicator in the media to a bright yellow. This can allow for more specific selection of a species.
Another common enrichment medium, Eosin Methylene Blue, contains eosin and methylene blue dyes, which are toxic to gram positive organisms. It also contains lactose and bacteria on these plates which can ferment this will produce acids that lower the pH encouraging dye absorption. These colonies take up large amounts of pigment and appear dark and metallic. In this lab, you will grow four different test organisms across three different media conditions and then under aerobic versus anaerobic conditions before observing their development.
Before beginning the experiment, thoroughly wash your hands and dry them, before putting on appropriately sized laboratory gloves. Then, sterilize the work surface with 5% bleach, wiping it down thoroughly. Next, take a sterile inoculating loop and place it handle down into an empty 125 milliliter flask so that it does not touch the bench surface. Then, from the refrigerator, gather four plates of Mannitol Salt Agar, or MSA, four plates of Eosin Methylene Blue agar, EMB, and eight Tryptic Soy Agar, or TSA, plates. TSA medium is a non-selective growth medium which will be used for the two different environmental conditions. Finally, gather your cultures of interest in a tube rack. Here, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, and Proteus vulgaris will be grown.
To begin, light a Bunsen burner, which will be used to sterilize the tools. Then, place one MSA plate, one EMB plate, and two TSA plates close at hand. Then, select one of the bacterial cultures. You will inoculate all four of these plates with the first culture. With your free hand, pick up the inoculating loop and then sterilize it in the flame of the burner until it glows orange for a couple of seconds. Allow the loop to cool in the air. Then, open the broth culture tube and quickly flame the opening. Dip the loop into the culture and then streak the organism onto the first quadrant of the first plate. Then flame sterilize the loop again and streak the second quadrant. Repeat this action of flame sterilization and then streaking to complete the third and fourth quadrants. Streaking in this manner should give isolated colonies and also allow for confirmation that the culture is not contaminated.
Now, replace the lid and label the bottom of the plate with the name of the bacteria, media type, date, and your initials. Then, repeat the streak plating using the same bacterial culture for each of the remaining three plates taking care to label them each time. Now that the first culture has been streaked, repeat these steps for the other bacteria to obtain one inoculated MSA plate, one EMB plate, and two TSA plates for each species. Once all of the organisms have been transferred, flame the loop one final time.
To determine which organisms can grow in a reduced oxygen environment, open up a sealed gas chamber system and place one set of four TSA bacteria plates inside. Then, place an anaerobic condition sachet into the chamber and seal it tightly. Finally, place all of the plates, including those inside the sealed gas chamber system, into a 37 degree Celsius incubator overnight. Going forward, check the plates every 24 to 48 hours to give the colonies time to grow and metabolize any indicator reactants.
To assess how well the different bacterial species responded to each growth condition, first examine the plates for growth and record which species were able to produce colonies on each media type and in the anaerobic versus aerobic condition. Note the color of the organisms growing as well as the sizes and shape of the colonies.
The mannitol salt agar medium is selective for gram positive organisms which are able to survive in 6. 5% sodium chloride. In this experiment, this meant that the gram negative E. coli and P. vulgaris did not grow due to the high salt concentrations. S. epidermis and S. aureus were able to grow, however, confirming that they are gram positive. Additionally, there is a clear difference between the two species because the S. aureus is able to ferment mannitol turning the methyl red indicator in the media to a bright yellow due to the acid byproducts of fermentation. This was not seen in the case of S. epidermis.
The EMB medium on the other hand is selective for gram negative organisms because the eosin and methylene blue dyes are toxic to gram positive cells. The outer membrane of gram negative bacteria prevents these toxic dyes from entering the cells, meaning they are able to grow. Moreover, this medium indicates whether the bacterial species present is able to ferment lactose. Here, E. coli colonies turn a dark purple color, sometimes with a green metallic sheen indicating fermentation. P. vulgaris grows on this medium but does not ferment lactose and so appears a light pinkish to purple from being in the presence of the dye. In the anaerobic condition, the bacterial species on TSA media should still grow but may do so very poorly compared to those with ample oxygen. This is because none of the test species are obligate anaerobes.
Experiments like this to enrich the growth environment can help to favor and isolate a specific species from a mixed sample. They can also help determine the optimal growth conditions for different bacterial species in a laboratory setting, thus aiding further research.
