출처: 크리스토퍼 P. 코르보1,조나단 F. 블레이즈1,엘리자베스 수터1
1 생물과학부, 바그너 칼리지, 1 캠퍼스 로드, 스태튼 아일랜드 뉴욕, 10301
대핵 세포는 이 행성의 거의 모든 환경에 거주할 수 있습니다. 왕국으로서, 그들은 에너지 생성 (1)을 위해 분자의 다양한 사용할 수 있도록, 큰 신진 대사 다양성을 가지고. 따라서 실험실에서 이러한 유기체를 재배할 때 에너지를 만드는 데 필요한 모든 필요하고 구체적인 분자가 성장 매체에 제공되어야 합니다. 일부 유기체는 대사적으로 다양하지만, 다른 생물은 고온 또는 저온, 알칼리성 및 산성 pH, 감소 또는 산소 결석 환경 또는 높은 염(2,3,4)을 포함하는 환경과 같은 극단적인 환경에서 살아남을 수 있습니다. “극단적 인”이라고 불리는 이 유기체는 종종 이러한 강렬한 환경이 확산될 것을 요구합니다. 과학자들이 이러한 유기체를 성장시키고자 할 때, 미디어 구성 요소뿐만 아니라 특정 환경 조건은 모두 관심있는 유기체를 성공적으로 육성하기 위해 고려해야합니다.
과학자들은 그 종들이 성장해야 하는 특정 요구 사항을 이해하기 때문에 실험실에서 컬터류 유기체를 키울 수 있습니다. 그러나, 컬터류 유기체는 지구상에 있는 것으로 추정되는 종의 1% 미만을 차지합니다 (5). 유전자 시퀀싱에 의해 검출되었지만 실험실에서 성장할 수 없는 유기체는 헤비울 수 없는 것으로 간주됩니다(6). 이 때, 우리는 실험실에서 그들의 환경을 복제하기 위하여 이 유기체의 물질 대사 그리고 성장 조건에 관하여 충분히 모릅니다.
까다로운 유기체는 이전 둘 사이에 어딘가에 놓여 있습니다. 이 유기체는 culturable, 그러나 특정 성장 매체 분대 및/또는 특정 성장 조건과 같은 아주 특정 성장 조건을 요구합니다. 이러한 제네라의 두 가지 예는 Neisseria sp. 및 혈우병 스프., 둘 다 부분적으로 세분화 된 적혈구 (초콜릿 한천이라고도 함), 특정 성장 인자와 이산화탄소가 풍부한 환경 (7)을 필요로한다. 필요한 특정 구성 요소를 모두 사용하지 않으면 이러한 유기체는 전혀 성장하지 않습니다. 종종, 심지어 그들의 요구 사항의 모든, 이러한 유기체 가난한 성장.
유산소 또는 산소함유 산소에서만 자랄 수 있는 진핵세포와 달리, 환경, 원핵세포는 충분한 에너지를 생성하기 위해 여러 발효 경로를 사용하여 혐기성으로 성장할 수 있다(8). 다른 판핵생물은 마이크로에어로필릭, 또는 감소된 산소 환경, 또는 심지어 카노필릭, 또는 높은 이산화탄소 환경(9)을 선호한다. 이 유기체는 대기를 변경해야 하기 때문에, 풍부하게 하기 위하여 더 도전적입니다. 산소가 있는 환경에 민감한 유기체와 자주 작동하는 과학자들은 일반적으로 혐기성 챔버와 인큐베이터에서 작동하며, 아르곤과 같은 무겁고 불활성 가스가 산소(10)를 대체하기 위해 펌핑됩니다. 다른 사람들은 물을 사용하여 수소와 이산화탄소를 생성하는 기존의 밀봉 가스 패킷 시스템을 사용할 수 있으며 팔라듐과 같은 촉매와 함께 모든 대기 산소를 제거합니다. 이러한 시판되는 키트는 위에서 언급한 대기 조건(10)을 생성할 수 있습니다.
잠재적인 감염을 결정하기 위하여 병원체를 육성하거나 자연 환경에 존재하는 박테리아의 특정 종을 확인하기 위하여 찾고 있든, 1개의 문제가 있습니다. 아무도 세균성 종은 하나의 서식지에 거주하지 않습니다. 박테리아는 인간의 피부에서 지구의 바다에 이르기까지 사방에 다세포 공동체로 살고 있습니다 (11). 박테리아의 한 종을 격리하려고 할 때, 과학자는 또한 고립 된 지역에 살고있는 수많은 다른 유기체를 제외하기 위해 노력해야합니다. 이러한 이유로, 박테리아에 대 한 농축 된 성장 매체는 종종 두 가지 기능을 수행. 첫 번째는 미디어를 선택적으로 만드는 것입니다. 선택적 에이전트는 일부 종 성장 방지 할 것 이다, 억제 하지 않는 동안 종종 성장 하는 다른 사람을 촉진 (12). 미디어 성분의 두 번째 기능은 차동 제로 작용할 수 있다. 이러한 제제는 분리된 유기체의 특정 생화학적 특징을 식별할 수 있도록 허용한다. 몇몇 다른 선택적이고 차동적인 매체를 적당한 성장 조건과 결합해서, 과학자 및 진단자는 특정 격리에서 특정 세균종의 존재를 확인할 수 있습니다.
식별을 돕는 선택적 및 차동 매체의 한 예는 임상적으로 중요한 유기체 황색포도상구균의 경우이다. 이 유기체는 일반적으로 매니톨 소금 한천에 배양된다. 이 매체는 황색포도상구균과같은 일부 그램 양성을 포함하는 높은 소금 환경에서 살 수있는 유기체만을 선택할뿐만 아니라 소금에 민감한 유기체를 억제합니다. 매니톨 설탕은 이 매체의 차동 성분입니다. 모든 임상적으로 중요한 황색포도상구균 종 중, 오직 S. 아우레우스만이 매니톨을 발효시킬 수 있다. 이러한 발효 반응은 매체의 적색 메틸 적색 표시등이 노란색으로 변하는 부산물로 산을 생성합니다. 다른 황색포도상구균 종 (예 : 황색 포도상 구균 표피증)은성장 할 수 있지만, 색상의 미디어를 빨간색으로 남겨 둡니다.
이 실험실 운동은 적절한 무균 기술뿐만 아니라 국물에서 성장 미디어의 적절한 접종을 보여줍니다. 또한 농축 매체에 대한 일반적인 오염 물질의 성장, 혐기성 박테리아에 대한 가스 패키지 혐기성 배양 시스템의 사용, 그리고 그램 양성 및 그람 음성 박테리아의 추정 식별을 위한 다른 선택적 및 차동 매체의 사용을 소개합니다.
Mannitol Salt Agar (MSA): This medium is selective for gram positive organisms that are able to survive in 6.5% sodium chloride. The gram-negative organisms Escherichia coli and Proteus vulgaris should not be able to grow on this medium because of the high salt concentration. S. epidermidis and S. aureus should be able to grow. The media is differential between the two because the S. aureus is able to ferment the mannitol – turning the methyl red indicator bright yellow due to the production of acid as a fermentation by-product. S. epidermidis should maintained the pink color on the plate.
NOTE: If colonies are small, growth on this medium may require additional incubation for a total of up to 48 hours at optimal temperature – here, 37°C.
Eosin Methylene Blue agar (EMB): This medium is selective for gram negative organisms, so Escherichia coli and Proteus vulgaris plates should exhibit growth. The eosin and methylene blue dyes are toxic to gram positive cells so neither Streptococcus species should grow. The outer membrane of gram-negative cells prevents the dyes from entering the cells. This media is differential because it allows for one to test for the ability of the organism to ferment lactose. E. coli turns a bright purple color (often with a green metallic sheen if cultivated long enough) due to the fermentation of lactose in the media. The P. vulgaris, although able to grow, does not ferment lactose (however it is able to ferment other sugars).
Tryptic Soy Agar (TSA): This medium is non-selective, so all of the study species should grow. However, comparing the aerobic versus anaerobic conditions, the plates from the gas package should display less growth (and smaller colonies). This is because none of the bacteria grown in the demonstration are obligate aerobes, but their optimal growth condition does include oxygen.
Different bacterial species are able to grow in different environments and are able to use different carbon sources as a way of generating energy. When working with these as cultures in the lab, it is important to know the components of the growth media being worked with and to match the growth media to the bacterial species. Scientists and diagnosticians can also exploit the varying biochemical reactions as a way to isolate different species from others and as a way to distinguish and identify bacteria in a mixed environment.
Bacteria are able to inhabit almost every environment on Earth, from desert tundra to tropical rainforests. This ability to colonize vastly different niches is due to their adaptability and vast metabolic diversity, which allows them to utilize a wide variety of molecules for energy generation. It is this massive array of diversity which leads to the phenomenon that less than 1% of the bacterial species on the planet are considered culturable and these are only possible due to an understanding of their specific metabolic and environmental needs.
Performing manipulations of media and environment in the laboratory not only allows researchers to experiment to find the optimal conditions for culturing a species of interest, but it also enables enrichment, the process of changing conditions to select for specific species from a mixed culture. Some microbial species are generalists and able to tolerate a wide variety of states or environments. Such organisms may grow readily under laboratory conditions, but they may also be prevented from growing if given an extreme habitat – which can help if the goal is to enrich for organisms from a mixed culture which are tolerant to this condition.
Fastidious organisms can be culturable but only when specific conditions are met. Neisseria or Haemophilus species, for example, require media containing partially broken down red blood cells and a high carbon dioxide concentration, which may also discourage the growth of other species. Extremophiles are named for their preference for extreme conditions, such as very low or high temperatures, reduced or oxygen absent conditions, or in the presence of high salt. These conditions are likely intolerable to most other microbes.
To further enrich for an organism of interest, some media types contain indicators which give insight into the metabolism of the organism. Mannitol Salt Agar inhibits the growth of organisms sensitive to high salt. Gram negative bacteria typically cannot survive, but the gram positive Staphylococcus genus are able to thrive. In addition, the MSA agar indicates any colonies able to ferment mannitol because the acid byproducts of fermentation will turn the methyl red indicator in the media to a bright yellow. This can allow for more specific selection of a species.
Another common enrichment medium, Eosin Methylene Blue, contains eosin and methylene blue dyes, which are toxic to gram positive organisms. It also contains lactose and bacteria on these plates which can ferment this will produce acids that lower the pH encouraging dye absorption. These colonies take up large amounts of pigment and appear dark and metallic. In this lab, you will grow four different test organisms across three different media conditions and then under aerobic versus anaerobic conditions before observing their development.
Before beginning the experiment, thoroughly wash your hands and dry them, before putting on appropriately sized laboratory gloves. Then, sterilize the work surface with 5% bleach, wiping it down thoroughly. Next, take a sterile inoculating loop and place it handle down into an empty 125 milliliter flask so that it does not touch the bench surface. Then, from the refrigerator, gather four plates of Mannitol Salt Agar, or MSA, four plates of Eosin Methylene Blue agar, EMB, and eight Tryptic Soy Agar, or TSA, plates. TSA medium is a non-selective growth medium which will be used for the two different environmental conditions. Finally, gather your cultures of interest in a tube rack. Here, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, and Proteus vulgaris will be grown.
To begin, light a Bunsen burner, which will be used to sterilize the tools. Then, place one MSA plate, one EMB plate, and two TSA plates close at hand. Then, select one of the bacterial cultures. You will inoculate all four of these plates with the first culture. With your free hand, pick up the inoculating loop and then sterilize it in the flame of the burner until it glows orange for a couple of seconds. Allow the loop to cool in the air. Then, open the broth culture tube and quickly flame the opening. Dip the loop into the culture and then streak the organism onto the first quadrant of the first plate. Then flame sterilize the loop again and streak the second quadrant. Repeat this action of flame sterilization and then streaking to complete the third and fourth quadrants. Streaking in this manner should give isolated colonies and also allow for confirmation that the culture is not contaminated.
Now, replace the lid and label the bottom of the plate with the name of the bacteria, media type, date, and your initials. Then, repeat the streak plating using the same bacterial culture for each of the remaining three plates taking care to label them each time. Now that the first culture has been streaked, repeat these steps for the other bacteria to obtain one inoculated MSA plate, one EMB plate, and two TSA plates for each species. Once all of the organisms have been transferred, flame the loop one final time.
To determine which organisms can grow in a reduced oxygen environment, open up a sealed gas chamber system and place one set of four TSA bacteria plates inside. Then, place an anaerobic condition sachet into the chamber and seal it tightly. Finally, place all of the plates, including those inside the sealed gas chamber system, into a 37 degree Celsius incubator overnight. Going forward, check the plates every 24 to 48 hours to give the colonies time to grow and metabolize any indicator reactants.
To assess how well the different bacterial species responded to each growth condition, first examine the plates for growth and record which species were able to produce colonies on each media type and in the anaerobic versus aerobic condition. Note the color of the organisms growing as well as the sizes and shape of the colonies.
The mannitol salt agar medium is selective for gram positive organisms which are able to survive in 6. 5% sodium chloride. In this experiment, this meant that the gram negative E. coli and P. vulgaris did not grow due to the high salt concentrations. S. epidermis and S. aureus were able to grow, however, confirming that they are gram positive. Additionally, there is a clear difference between the two species because the S. aureus is able to ferment mannitol turning the methyl red indicator in the media to a bright yellow due to the acid byproducts of fermentation. This was not seen in the case of S. epidermis.
The EMB medium on the other hand is selective for gram negative organisms because the eosin and methylene blue dyes are toxic to gram positive cells. The outer membrane of gram negative bacteria prevents these toxic dyes from entering the cells, meaning they are able to grow. Moreover, this medium indicates whether the bacterial species present is able to ferment lactose. Here, E. coli colonies turn a dark purple color, sometimes with a green metallic sheen indicating fermentation. P. vulgaris grows on this medium but does not ferment lactose and so appears a light pinkish to purple from being in the presence of the dye. In the anaerobic condition, the bacterial species on TSA media should still grow but may do so very poorly compared to those with ample oxygen. This is because none of the test species are obligate anaerobes.
Experiments like this to enrich the growth environment can help to favor and isolate a specific species from a mixed sample. They can also help determine the optimal growth conditions for different bacterial species in a laboratory setting, thus aiding further research.
