İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Bu prosedür, eksi 17 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat üzerinde sekiz mikrometre sıvı nitrojen buharlı donmuş doku bloğunun düz yüksüz cam slaytlar üzerine bölünmesiyle başlar. Daha sonra histo gen boyama kiti ile kesitler boyanır. Piramidal nöronları tanımladıktan sonra, yaklaşık 500 hücre, HS yakalama kapağına lazerle yakalanır.

Hücreli kapak, ters çevrilmiş 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirilir ve daha önce Irak'ta konumlandırılmış bir Falcon tüpüne yerleştirilir ve 42 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosuna oturtulur. Kısa bir santrifüjleme adımından sonra kapak çıkarılır. Kalan çözelti daha sonra RNA izolasyonu için hazırdır.

Merhaba, ben McLean Hastanesi Yapısal ve Moleküler Sinirbilim Bölümü'ndeki Wilson Wu'nun laboratuvarından Charmaine Peterson. Bugün size insan ölüm sonrası beyin dokusundan parametal nöronları lazerle yakalamak için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü şizofreni hastalarının üstlerinde ve fakir giruslarında diferansiyel gen ekspresyonunu mikroarray teknolojisi kullanarak incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Beyin dokuları, doku kesitinden önce Harvard Beyin Dokusu Kaynak Merkezi'nden sıvı nitrojen buharlı donmuş bloklar olarak elde edildi. RNA kontaminasyonunu azaltmak önemlidir: çalışma alanı, kesit bıçağı ve slaytlar dahil tüm yüzeyler RNA SAP gibi bir RNA dekontaminasyon solüsyonu ile işlenir ve %100 etanol ile silinir.

Bu prosedür, eksi 17 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat üzerindeki sıvı nitrojen buharlı donmuş doku bloklarının düz yüksüz cam slaytlar üzerine bölünmesiyle başlar. Doku kesitleri artık histo gen hızlı boyama kiti kullanılarak piramidal nöronların tanımlanması için hazırdır. Uygun etanol konsantrasyonlarından 25 mililitre etanol dehidrasyon serisini ve RNA içermeyen suyu, histo gen kiti ile birlikte verilen boyama kavanozlarına hazırlayın.

%75 etanol içeren bir kavanoz dışında tüm kavanozları bir buz kovasına koyun. Bu %75'lik etanolü eksi 20 santigrat derece dondurucuya koyun. Daha sonra, 100 mikrolitre boyama çözeltisi başına bir mikrolitre RNA inhibitörü ekleyerek boyama çözeltisini hazırlayın.

İki slaytta dört doku kesitini boyayacağımız için, bir mikro santrifüj tüpünde 400 mikrolitre boyama solüsyonuna dört mikrolitre RNA inhibitörü eklenir. Boyama solüsyonunu buz üzerinde tutun. Çeker ocak altında.

Doku kaldırmasını tehlikeye atabilecek fazla suyu çıkarmak için ksilen kavanozuna moleküler elekler ekleyin. Sıcaklık 42 santigrat dereceye ayarlanmış su banyosunu açın ve su banyosuna bir rafla desteklenen 50 mililitrelik bir Falcon tüpü yerleştirin. Eksi 80 santigrat derece dondurucudan iki slaytı çıkarın ve bir Kim mendilinde buzlarını çözün.

Yaklaşık 30 saniye boyunca veya sadece slaytların köşeleri çözülmeye başlayana kadar, dokuyu eksi 20 santigrat derece dondurucuda 30 saniye boyunca% 75 etanol içinde kısaca sabitleyin. Daha sonra RNA içermeyen forseps kullanarak, slaytları 32. yıkama için nükleaz içermeyen suya aktarın Slaytlar yıkandıktan sonra, boyama solüsyonunu kesit üzerinde yoğunlaştırmak için bölümleri bir PAP bariyer kalemi ile ana hatlarıyla çizin, dört bölümü histo gen boyama solüsyonu ile 20 saniye boyayın. Bölüm başına 97 mikrolitre leke kesme RNA inhibitörü ile, önceden hazırlanmış etanoldeki bölümleri buz üzerinde adım başına 30 saniye kurutun.

Yeterli doku kaldırması için yeterli dehidrasyon elde etmek için son %100 etanol adımı üç dakikaya kadar uzatılmalıdır. Son olarak, slaytları beş dakika boyunca ksilene batırın, lazer yakalama mikrodiseksiyonuna geçmeden önce slaytların tamamen kurumasına izin verin, piramidal nöronlar, tek hücreli lazer yakalama prosedürünü boyadıktan hemen sonra çıkarılmalıdır. MİKRODISEKSIYON veya LCM, daha önce kurulmuş olan a tarafından desteklenen 50 mililitrelik bir Falcon tüpü içeren 42 santigrat derecelik bir su banyosu gerektirir.

Tek hücreli LCM, ARCTURUS XT lazer yakalama sistemi ve yazılımı ile gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için kızakları ve kapakları arcturus XT aparatına yükleyin. Yakalama HS kapaklarını kullanın, ancak program ayarını makroda tutun.

Her slaydın genel bakış fotoğrafını almak için genel bakışlı kutu yüküne tıklayın. Lazer yakalama için en uygun bölümü belirlemek için parlaklık odağını iki x büyütmede ayarlayın. Aşırı katlanan doku bölümlerinden kaçının, ancak sağlam, pürüzsüz ve lekeli bölümleri seçin.

Yakalayacağınız genel alanın üzerine bir kapak yerleştirin ve yakalanacak alanı bizim durumumuzda dahil ettiğinizden emin olun. Korteksin üçüncü katmanı. Kapak raylarının herhangi bir kıvrıma dayanmadığından emin olun, çünkü bu, kapağı eğerek değişken spot boyutlarına neden olur.

Ardından, IR lazer noktasının konumunu 40 x büyütmede manuel olarak onaylayın. Mavi çarpı, IR lazer noktası içinde ortalanmalıdır. Değilse, noktaya sağ tıklayarak ve bulunan IR noktasını seçerek konumunu ayarlayın.

40 x büyütmede, piramidal nöronları aşağıdaki kriterlere göre tanımlayın, biri piramidal şekilli hücreler ve iki, apikal ve/veya bazal dendritlerin proksimal kısmı tanımlanabilir. Konum işlevindeki artı işaretine tıklayarak kapağın konumunu kaydedin. Bu şekilde, kapak hareket ettirilirse, her zaman tam olarak nokta boyutunu ayarladığınız aynı noktaya geri dönecektir.

Bu değerleri kontrol kutusuna girin: 70 güce ve 16 süreye. Bu parametreler dokumuza özgü olduğundan, başlamadan önce bu değişkenleri spesifik doku örneğinize göre test etmenizi ve bunlara göre ayarlamanızı öneririz. Tek hücrelerin lazerle yakalanmasıyla, sahneyi otomatik taşı seçeneğinin işaretini kaldırın ve doğru boyuttaki sembolün sağdaki paneldeki sembolle ilişkili olduğundan emin olun.

Yakalamayı test etmek istediğiniz bir nöronu seçmek için sağ alttaki daire seçeneğini seçin. Ve mavi çarpı dairesini daire ile hizaladıktan sonra, IR noktasını test et'e tıklayarak lazeri etkinleştirin. Lazer tarafından yapılan nokta, öncelikle yakalanan nesnenin etrafında net bir koyu halka sahip olmalıdır.

Halkanın hücreyi kapsayacak kadar büyük, ancak istenmeyen doku veya diğer hücreleri içermeyecek kadar küçük olduğundan emin olun. Bu halka çok hafifse, hücre yakalanmamıştır. Koyu halkanın ortasında karanlık bir nokta varsa, lazer gücü eğik çizgi süresi çok fazladır.

Bu işlemi, yakalamak istediğiniz katmandaki dokunun farklı kısımlarında tekrarlayın. Spot boyutunun konuma bağlı olarak farklılık göstermediğini kontrol etmek için buna göre ayarlayın. Yaklaşık 500 hücreyi yakalamak için piramidal nöronları tanımlayın.

Hücreleri yakalamak için lazer yakalama düğmesine basın. Kapağı QC istasyonuna taşıyın. Nöronların en az% 90'ının çıkarıldığından emin olun.

Değilse, hücrelerin çoğunun yakalandığı alanda daha fazla hücre yakalayın. Kapağı 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu içeren 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Kapak, tamponun sızmasını önlemek için mükemmel şekilde oturacak şekilde tasarlanmıştır.

Ekstraksiyon tamponunun tüm kapağı kapladığından emin olarak düzeneği ters çevirin ve 50 santigrat dereceye ayarlanmış su banyosunda 42 mililitrelik Falcon tüpünün altına yerleştirin. İnkübasyondan sonra dokuyu kapaktan çıkarmak için nöronları 30 dakika inkübe edin, tüpü ve kapak tertibatını 800 g'da iki dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra kapağı çıkarın.

RNA izolasyonu sadece daha sonra gerçekleştirilecekse. Kalan hücre ekstraktını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aksi takdirde, bir sonraki bölümde gösterildiği gibi hücre ekstraktından RNA'yı izole etmeye devam edin, RNA izolasyonu, LCM örneklerinden az sayıda hücreyi izole etmek ve düşük bollukta mRNA'yı korumak için tasarlanmış PICO saf izolasyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu prosedüre başlamak için, kit ile birlikte verilen %70 etanolü hücre ekstraktına ekleyin ve önceden koşullandırılmış bir saflaştırma kolonunda santrifüjleyin. Yıkamadan sonra RNA'yı kolon filtreye bağlamak için, DNA girişimi riskini ortadan kaldırmak için RNA'yı D N'lerle tedavi edin. Bu adım, gerçek zamanlı R-T-P-C-R gibi aşağı akış uygulamalarında özellikle önemlidir.

DNA sindiriminden sonra 40 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve saflaştırma kolonunu 8.000 Gs'de 15 saniye santrifüjleyin.Daha sonra, kit ile verilen protokole göre yıkamalara devam edin, ancak son yıkama adımını iki yıkama tamponu ile iki ila iki buçuk dakika uzatın, böylece kolonda yıkama tamponu kalmamasını sağlayın, bu da RNA veriminizi azaltabilir. Kolonu başka bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Elucian tamponunu ekleyin ve RNA'yı elüte etmek için sütunu bir dakika boyunca santrifüjleyin, kolondaki filtre üzerinde inkübe edin.

Son olarak, sanal bir jel ve elektroferogram numunenin 1,3 mikrolitresini 0,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyen bir Experian High Sense laboratuvar çipi çalıştırarak ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini kontrol edin. Kalite kontrol testi için numunenin geri kalanını eksi 80 santigrat derecede dondurun. RNA'nın kalitesi doğrulandıktan sonra, yükseltilebilir, etiketlenebilir ve hibritleştirilebilir.

Gen ekspresyonu Profil Oluşturma analizi için, ribo amp HS plus kiti ile iki tur doğrusal amplifikasyon gerçekleştirilecektir, bu da hem mikrodizi hem de Q-R-T-P-C-R deneylerinin performansı için yeterli olan yaklaşık 50 mikrogram amplifiye RNA ile sonuçlanmalıdır. Turbo biyotin etiketleme kiti ve moleküler cihazlardan gelen etiketleme, amplifiye edilmiş RNA'yı etiketlemek için kullanılır. Son olarak, atrix'ten insan X üç P gen çipli pro bere kullanılarak gen ekspresyon profillemesi yapılacaktır.

Doku kesiti, slayt başına iki bölüm, vaka başına toplam dört bölüm olmak üzere iki slaytla sonuçlanmalıdır. Her bölüm minimum yırtılma, çatlama veya katlanma ile pürüzsüz olmalıdır. Piramidal nöronlar, piramidal bir şekil ve görünür apikal dendritler ile yaklaşık 20 ila 25 mikrometre boyutunda koyu renkli bir şekilde boyanmalıdır.

LCM sırasında, lazer termoplastik film boyunca darbelendikten sonra, hücreler kapağa yapışır ve bu nedenle artık çevredeki dokuyu terk eden slayt üzerinde değildir. Nöronların yaklaşık% 85 ila 100'ünün arkasında, makro ayarlarda yakalama HS kapakları ve lazer gücünün ve gücünün doğru ayarlanması ile kapağa yapışması gerekir. Her bölüm için, bölüm başına yaklaşık 500 ila 700 hücre elde etmelisiniz, bu da vaka başına en az 500 pikogram toplam RNA ile sonuçlanır.

Total RNA izolasyonundan sonra, RNA kalitesi bir elektroferogram ve BioRad Experian aracılığıyla sanal bir jel vasıtasıyla değerlendirilir. Elektroferogramda, ölüm sonrası dokuya sahip 18 s ve 20 a ribozomal RNA birimlerine karşılık gelen iki farklı tepe görmelisiniz. Bununla birlikte, kesit almadan önceki faktörler nedeniyle doku bozulabileceğinden, bu her zaman böyle değildir.

Normalde, kırmızı oklarla gösterildiği gibi 18 s civarında büyük bir tepe ve 28 s civarında daha küçük bir tepe ile bozulmayı gösteren büyük bir çıkıntı göreceksiniz. Buna karşılık, çok fazla bozunmaya sahip kötü kaliteli RNA, eğrisinin altında geniş bir alana sahip bir elektroferogram ile gösterilecektir. İki tur doğrusal amplifikasyondan sonra mRNA'nın kalitesini test etmek için yayılma konumunda bir vites küçültmeye ek olarak, hem BioRad Experian standart Sense laboratuvar çipini hem de NanoDrop spektrofotometresini kullanıyoruz.

Geleneksel Atrics mikroarray teknolojisi, bu protokolle tespit edilebilmesi için mRNA transkript yayılımının en az 600 nükleotid uzunluğunda olmasını gerektirir. mRNA yayılımı, elektroferogramın gösterdiği gibi 1000 nükleotid aralığına ulaştı ve büyük tepeler zamanın bir fonksiyonu olarak yavaşça alçaldı. Bu sonuç sanal jel tarafından da onaylanır.

Transkript uzunlukları 600 nükleotidden kısaysa, numune dahil edilmemelidir Hibridizasyon için, NanoDrop okumaları, numuneler arasında ortalama iki 60 üzeri iki 80 oranı veya 2.5 saflık gösterdi. Ortalama konsantrasyon mikrolitre başına 1.7 mikrogram idi, bu da numune başına yaklaşık 50 mikrogram mRNA ile sonuçlandı, bu hem mikrodizi analizi hem de 15 ila 20 mikrogram mRNA ve ardından sonuçların QR TPCR ile doğrulanmasını gerektiren müteakip doğrulama için yeterliydi. Sonuçlarımız, bu protokolle, elde edilen RNA'nın hem miktarının hem de kalitesinin, atrix insan X üç P çipi aracılığıyla gen ekspresyon farklılıklarını araştırmak için yeterince iyi olduğunu göstermektedir.

Atrics Human X üç P çipine hibridizasyondan sonra, yeterli hibridizasyon ve prob yoğunluklarını gösteren ortalama %26,6'lık bir yüzde çağrısı elde ettik. Bu hücrelerden elde edilen RNA'yı kullanmak için ölüm sonrası insan beyin dokusundan parametal nöronları lazerle nasıl yakalayacağınızı az önce gösterdik. Bu prosedür yapılırken mikroarray G profilleme çalışmaları için, RNA bütünlüğünü korumak için tüm adımların RNA'lardan arındırılmış bir ortamda gerçekleştirilmesi ve adımların zamanında tamamlanması önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.