Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Inicie o procedimento colocando um peixe adulto anestesiado em uma pilha de papel absorvente. Agora use uma lâmina de barbear estéril para cortar a barbatana da cauda e transfira rapidamente o peixe para um tanque contendo água doce para recuperação. Transfira o clipe da cauda para um tubo limpo contendo um tampão de lise. O tampão de lise contém detergentes noniônicos, que solubilizam a membrana plasmática e a membrana nuclear de uma célula. O tampão também contém uma enzima chamada proteinase K que quebra proteínas e permite a liberação do DNA no lysate. digestão.
Agora, deixe os tubos com clipes de cauda em uma incubadora durante a noite para quebrar completamente o tecido a 55 graus Celsius com rotação contínua. Em seguida, aqueça o tubo a 95 graus Celsius por 15 minutos para inativar proteinase K. Centrifugar o tubo para pelotas de material não digerido e transferir o supernatante contendo DNA para outro tubo. Adicione álcool para precipitar o DNA e centrífuga novamente para coletar o DNA em uma pelota. No protocolo seguinte, vamos isolar o DNA do clipe da cauda de um zebrafish adulto e de um embrião inteiro.
- No dia da preparação do DNA, adicione proteína fresca K ao tampão de lise a uma concentração de 1 miligrama por mililitro. O tecido pode ser coletado de um peixe adulto usando um clipe de barbatana ou de um peixe embrionário.
Primeiro, anestesiar o peixe em solução tricaine. Espere até que os movimentos da brânquia diminuam. Em seguida, coloque o peixe em uma pilha de tecidos e, com uma lâmina de barbear estéril, corte um pequeno pedaço da barbatana traseira de cerca de 2 a 3 milímetros de comprimento.
Pegue o clipe da barbatana com uma ponta de pipeta estéril e transfira-o para um tubo cheio de cem microliters de tampão de dna. Certifique-se de rotular tanto o tanque do animal quanto o tubo. Incubar todos os tecidos coletados por pelo menos quatro horas e até durante a noite a 55 graus Celsius.
Após a incubação, inative a proteína K aquecendo os tubos a 95 graus Celsius por 15 minutos. Estas amostras devem ser usadas para PCR imediatamente, mas também podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até três meses.
