Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Nei pazienti adulti con infezione da HIV, la neuroinfiammazione interferisce con la normale segnalazione sinaptica, portando a deficit neurocognitivi che includono difficoltà con l'astrazione, la fluidità verbale, l'apprendimento dell'attenzione, nuove informazioni e memoria. HIV one tat induce la secrezione di molecole infiammatorie, che possono imitare la disfunzione sinaptica osservata nei pazienti con HIV qui. I topi adulti che esprimono GFP in cellule mononucleate, comprese le microglia, sono utilizzati per studiare la neuroinfiammazione indotta da HIV con un solo tatuaggio utilizzando la microscopia a due fotoni del cranio sottile.

Le risposte della microglia dopo l'iniezione di tat possono essere visualizzate in vivo. Le immagini risultanti dimostrano l'accorciamento e l'ispessimento dei processi microgliali e la formazione di strutture simili a coppette fagocitiche, nonché il traffico di monociti periferici nei microvasi cerebrali. Ciao, sono Dan Marker del laboratorio di Harris Galbard e del Center for Neural Development and Disease dell'Università di Rochester.

Ciao, sono EF Trombley del Laboratorio di Esca presso il Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester. Ciao, sono Shain Luu, anche lui di Albas Lab. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging a due fotoni utilizzando una preparazione sottile del cranio.

Utilizziamo questa procedura per studiare la neuroinfiammazione cronica. Quindi iniziamo nell'esperimento mostrato qui. Vengono utilizzati GFP espressi OT in linee cellulari mononucleate in cui vengono utilizzate microglia.

Diversi ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di un progetto specifico. Inizia a preparare un topo anestetizzato con fentanil, midazolam meine per l'intervento chirurgico. Innanzitutto, assicurati che l'animale non risponda più a stimoli dolorosi come un pizzico di coda.

Posiziona l'animale su un termoforo per prevenire l'ipotermia post anestesia. Quindi coprire gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico protettivo per mantenere gli occhi umidi. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere stati sterilizzati in autoclave o con uno sterilizzatore a microsfere di vetro, disinfettare ulteriormente gli strumenti immergendoli in etanolo al 70%.

Usando le forbici, rimuovi i peli dal cuoio capelluto dell'animale, quindi disinfetta l'area utilizzando una soluzione di iodio povidone al 10% e etanolo al 70%. Inizia l'intervento chirurgico usando piccole forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana nel cuoio capelluto, iniziando da quattro a cinque millimetri, cordale al cranio e avanzando in avanti verso la parte anteriore degli occhi. Questa incisione dovrebbe essere abbastanza lunga da non consentire alla pelle di interferire con l'incollaggio della piastra che stabilizza la testa del topo durante l'imaging a due fotoni.

Successivamente, applica il batuffolo di cotone sterile al 100% di etanolo per asciugare le membrane sulla parte superiore del cranio. Raschiateli via con una pinzetta fine. Se le membrane non vengono rimosse, l'attacco della piastra di testa sarà instabile.

Sotto un cannocchiale da dissezione, identificare l'area da assottigliare. Evitare le aree di interesse situate direttamente sopra le suture craniche poiché il cranio è meno stabile in queste aree e i grandi vasi e le meningi sottostanti interferiranno con l'imaging inviato alla finestra di visualizzazione sull'area di interesse. Poi di nuovo, usando un batuffolo di cotone, riprova il cranio usando una soluzione al 10% di cloruro ferrico.

Posizionare uno strato sottile di colla perma bond, nove 10 attorno ai bordi della finestra di visualizzazione sotto la piastra di testa. Quindi posizionare la piastra sull'area di interesse sul cranio dell'animale con una leggera pressione per legare la colla. Applicare una piccola quantità di acrilico attorno al bordo della finestra di visualizzazione utilizzando una siringa.

Infine, applicare una piccola quantità di Tite 4 54 ai bordi della finestra di visualizzazione. Per evitare perdite. Avvitare la piastra della testa al supporto dell'animale e verificarne la stabilità al microscopio da dissezione Sondando leggermente con un paio di pinze, non dovrebbe esserci alcun movimento del cranio rispetto alla piastra della testa.

Posizionare una goccia di soluzione salina sulla finestra di visualizzazione per assicurarsi che non vi siano perdite in preparazione al diradamento. Asciugare il cranio utilizzando una combinazione di tamponi di cotone sterili e aria compressa. Assottigliare il cranio usando una punta da trapano IRF 0 0 7 in un micro o due trapano.

A 4.000 giri/min. Inizia molto delicatamente a diradare un'area circolare da due a 2,5 millimetri di diametro. Usa solo movimenti leggeri e ampi quasi paralleli al cranio.

Non esercitare una pressione diretta verso il basso. Interrompere la perforazione ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea utilizzando l'aria compressa. Queste interruzioni nella perforazione consentono al cranio di raffreddarsi in modo che non vi siano danni indotti dal calore al tessuto cerebrale sottostante.

Man mano che la perforazione procede, si noti la transizione verso lo strato osseo spinoso più umido chiamato Diplo. Una volta raggiunto questo strato, prestare particolare attenzione con il trapano. Di tanto in tanto controllare la sottigliezza del cranio posizionando soluzione salina sull'area sottile e osservando sotto il cannocchiale da dissezione.

La soluzione salina consentirà ulteriormente la dissipazione del calore. Man mano che il cranio si assottiglia, diventa visibile una vascolarizzazione più piccola. Utilizzare una microlama dentale per ottenere il diradamento finale sotto soluzione salina.

La microlama fornisce un feedback molto più tattile sulla stabilità del cranio. Ciò consente preparazioni molto più sottili rispetto al solo trapano. Lo spessore ottimale del cranio per l'imaging è compreso tra 10 e 30 micrometri.

L'intero processo di diradamento dura normalmente tra i 15 e i 30 minuti. Controllare più volte la sottigliezza del cranio sotto epifluorescenza mentre si crea una finestra del cranio sottile. La nitidezza e la profondità delle microglia e della vascolarizzazione visibili danno una buona indicazione su quando la finestra è pronta per l'imaging.

Una volta che la finestra è pronta, utilizzare una pipetta di vetro di un millimetro di diametro per posizionare una piccola goccia di colla acrilica Cy sulla sottile area del cranio e abbassare con cautela un pezzo di vetro di copertura su di essa. Quindi premere delicatamente contro il teschio per spremere la colla in eccesso, evitando la formazione di bolle tra esso e il vetro di copertura, che potrebbero ostruire la visuale. Una volta asciutto, utilizzare una microlama per rimuovere con cura la colla rimasta sulla parte superiore del vetro di copertura in preparazione per l'imaging a due fotoni.

Coprire la sottile finestra corticale del cranio con soluzione fisiologica e individuare l'area di interesse sotto epifluorescenza. Per abilitare l'imaging successivo dell'area, scattare una foto utilizzando una fotocamera per l'imaging. Qui viene mostrato un fotomicroscopio a due su misura con un laser in zaffiro ti sintonizzato a 920 nanometri.

La fluorescenza viene rilevata utilizzando un tubo fotomoltiplicatore o un PMT in modalità di rilevamento dell'intero campo e un filtro di emissione 5 81 80. Per tutta la sessione di imaging viene utilizzata una lente a immersione in acqua 20x. Impostare la potenza massima del laser dell'obiettivo tra 50 e 65 milliwatt.

Quindi, selezionare un'area di interesse, lo strato corticale uno o due, fino a 150 micrometri sotto la superficie della buccia. Per facilitare la ricreazione dell'immagine, scattare foto dello stesso campo visivo con uno x a due x con zoom digitale e tre x. I vasi sanguigni possono fungere da punti di riferimento per trovare facilmente lo stesso campo visivo durante le successive sessioni di imaging.

Con uno zoom di tre x, acquisisci più Zack con incrementi da 80 a 90 Z ciascuno e un passo di 0,69 micrometri ogni cinque minuti per un massimo di 30 minuti. Ciò consente un buon campionamento della morfologia e del comportamento della microglia nel tempo tra le acquisizioni di Zacks, verificare il livello di soluzione salina e la profondità dell'anestesia. Se necessario, durante la procedura può essere somministrata una dose di richiamo pari a un terzo della dose originale di cocktail anestetico per prevenire la deposizione di tat sulla siringa e sull'ago durante i giorni di iniezione prima dell'iniezione.

Silosificare il rivestimento interno di un ago calibro 35 e di una siringa per microvolumi da 10 microlitri prelevando la soluzione di dimensionamento fino a riempire sia l'ago che la siringa. Lasciare riposare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi svuotare la soluzione dalla siringa, rimuovere lo stantuffo e lasciare asciugare completamente la siringa e l'ago. Infine, lavare accuratamente la siringa e l'ago con acqua deionizzata.

Una volta isolati, una siringa e un ago possono essere utilizzati per più di sei mesi prima che sia necessaria una ricodifica. Il giorno dell'iniezione, porre una piccola goccia della soluzione TAT su un vetrino silosizzato. Utilizzando un puntale per pipetta siliconato, caricare la quantità desiderata di soluzione nella siringa per microvolumi da questa goccia.

Utilizzando una punta da trapano, eseguire una piccola craniotomia di 0,5 millimetri di diametro, rostrale di tre millimetri o lateralmente alla sottile finestra corticale del cranio dove sono state ottenute due immagini fotoniche. Per fare ciò, assottiglia con cura il cranio. Quindi usa un paio di pinze affilate per rimuovere il sottile strato di osso.

Utilizzare un micro manipolatore per allineare l'ago e la siringa di calibro 35 con la craniotomia. Quindi far avanzare con cautela l'ago a una profondità compresa tra 700 e 900 micrometri sotto la superficie della buccia. Eroga tre microlitri a 80 nanolitri al minuto utilizzando una pompa a siringa controllata da microprocessore.

Questa figura mostra la microglia marcata con GFP visualizzata con l'imaging a due fotoni dopo l'impianto della sottile finestra corticale del cranio, a circa 50 micrometri sotto la superficie della buccia. Le singole due sezioni di fotoni prelevate il giorno zero, da 15 a 30 minuti dopo l'impianto della sottile finestra corticale del cranio, così come quelle prelevate sette e 17 giorni dopo, dimostrano che le finestre rimangono libere mentre la microglia rimane attivata in assenza di insulti infiammatori. Ciò evidenzia l'utilità di questo metodo per studiare le interazioni normali e infiammatorie tra le cellule effettrici immunitarie e altri tipi di cellule neurali.

In vivo, le proiezioni Z effettuate a sei e 24 ore dopo l'iniezione della neurotossina dell'HIV TAT mostrano marcati cambiamenti morfologici della microglia attivata. Dimostrando ulteriormente la nostra capacità di studiare i cambiamenti morfologici della microglia in tempo reale in modelli acuti e cronici di neuroinfiammazione. Ti abbiamo appena mostrato come preparare una sottile finestra del cranio e usarla per studiare la neuroinfiammazione Quando si esegue questa procedura.

È importante ricordarsi di prendersi il tempo necessario quando ci si prende cura del cranio per evitare danni causati dalla preparazione stessa. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.