Saggio degli anticorpi neutralizzanti AAV basato su cellule: una tecnica colorimetrica per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro specifici virus adeno-associati nel siero

I virus adeno-associati ricombinanti, rAAV, virus a DNA a filamento singolo geneticamente modificati, senza involucro, sono promettenti vettori genici terapeutici.

Gli rAAV si legano ai recettori della membrana cellulare bersaglio e subiscono l'endocitosi mediata dalla clatrina, facilitando la consegna nucleare del genoma rAAV e l'espressione genica terapeutica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti del sistema immunitario diretti contro i rAAV si legano allo specifico epitopo rAAV, interferendo con il legame della membrana cellulare, l'ingresso cellulare e il trasferimento genico.

Per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro specifici rAAV nel siero di pecora, in primo luogo, ottenere concentrazioni appropriate di siero diluito. Aggiungere AAV ricombinanti che esprimono il gene della fosfatasi alcalina placentare umana, hPLAP. Consentire agli anticorpi neutralizzanti di legarsi e neutralizzare gli AAV.

Trasferire questa miscela nei pozzetti di una piastra a più pozzetti contenente colture cellulari epiteliali umane aderenti. Dopo l'incubazione, gli AAV vanno incontro a endocitosi cellulare. Le cellule trasdotte esprimono hPLAP legato alla membrana cellulare. Tuttavia, gli AAV neutralizzati non possono entrare nelle cellule.

Scartare il substrato dai pozzetti. Usa la paraformaldeide per fissare le cellule. Aggiungere un tampone preriscaldato e riscaldare le cellule per inattivare la fosfatasi alcalina cellulare endogena; hPLAP è resistente all'inattivazione del calore.

Aggiungere i substrati hPLAP - bromocloroindolil fosfato, BCIP, e nitro blu tetrazolio, NBT. hPLAP defosforila BCIP, che subisce dimerizzazione, formando un intermedio blu. Gli ioni idrogeno rilasciati riducono la NBT, producendo un precipitato viola insolubile. Immagine per osservare i depositi viola che circondano le cellule trasdotte.

Una percentuale inferiore di area viola suggerisce un aumento della concentrazione di anticorpi neutralizzanti l'AAV.

Iniziare a placcare le cellule HT1080 il primo giorno diluendo le cellule a una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/mL in terreno DMEM completo preriscaldato.

Quindi, seminare 100 microlitri di cellule, per pozzetto, in piastre trasparenti a fondo piatto da 96 pozzetti alla concentrazione di 1 x 10⁴ cellule per pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-22 ore.

Il secondo giorno, generare diluizioni seriali dei campioni di siero di interesse in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando DMEM completo preriscaldato.

A ciascuna provetta con campioni di siero diluito, aggiungere 66 microlitri della soluzione di lavoro del virus 7,5 x 10⁶ genoma virale per microlitro. Miscelare le diluizioni virus/siero mediante pipettaggio, quindi posizionare le provette contenenti le miscele virus/siero in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 30 minuti, per consentire la potenziale neutralizzazione.

Dopo 30 minuti, pipettare 100 microlitri della miscela virus/siero in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente 1 x 10⁴ cellule per pozzetto, quindi avvolgere la piastra in un foglio da posizionare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-24 ore.

Il terzo giorno, aspirare il terreno dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti utilizzando un aspiratore per cappa aspirante senza interrompere le celle aderenti e aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto. Dopo aver avvolto il piatto in un foglio, lasciarlo per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare e aspirare le cellule due volte con 200 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Dopo il secondo lavaggio, pipettare 200 microlitri di PBS preriscaldato in ciascun pozzetto e avvolgere la piastra in un foglio seguito da incubazione a 65 gradi Celsius per 90 minuti per denaturare l'attività endogena della fosfatasi alcalina.

Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di BCIP/NBT appena preparato e disciolto in ciascun pozzetto e incubare le piastre avvolte a temperatura ambiente per 2-24 ore. Successivamente, scatta foto di ciascun pozzetto utilizzando un obiettivo 4x in una fotocamera per microscopio ottico, garantendo l'uso coerente della stessa esposizione, bilanciamento del bianco e impostazioni di luce per tutti i saggi.