Saggio della placca virale: una tecnica per misurare il virus infettivo dell'herpes simplex attraverso la quantificazione delle placche formate nel monostrato di cellule infettate da virus

Per iniziare, preparare diluizioni seriali del virus dell'herpes simplex, un virus infettivo avvolto, in tampone.

Ottenere una piastra a più pozzetti contenente un monostrato di coltura di cellule epiteliali sensibili al virus. Sostituisci il volume specifico dei terreni con sospensioni virali diluite, garantendo una copertura uniforme del monostrato. Lasciare che il virus si adsorba sulla superficie cellulare.

Rimuovere eventuali virus non adsorbiti. Coprire il monostrato cellulare con mezzi contenenti metilcellulosa, formando un rivestimento semisolido.

Dopo l'incubazione, l'involucro virale e la membrana cellulare si fondono, rilasciando il nucleocapside virale che racchiude il genoma a doppio filamento nel citoplasma. Inoltre, il genoma virale viene rilasciato nel nucleo cellulare.

Utilizzando il macchinario cellulare dell'ospite e la proteina del virione, il genoma virale esprime immediatamente le proteine virali precoci, che regolano l'espressione dei geni precoci. Le proteine virali precoci mediano la replicazione del DNA virale.

Quindi, i geni virali tardivi esprimono proteine strutturali, che insieme al genoma virale si assemblano per produrre particelle di virione progenie. Le cellule infettate dal virus si lisano, rilasciando virioni.

La metilcellulosa limita il movimento del virus, facendo sì che i virioni infettino solo le cellule vicine e la successiva lisi, creando buchi nel monostrato.

Dopo l'incubazione, rimuovere il rivestimento di metilcellulosa. Aggiungere la soluzione di cristallovioletto etanolico. L'etanolo fissa le cellule e inattiva i virus, mentre il cristallovioletto colora le cellule. Di conseguenza, sul monostrato di cellule viola compaiono chiare zone lisate o placche.

Contare le placche in ciascun pozzetto ad ogni diluizione del virus per determinare il titolo o la concentrazione del virus infettivo.

Rimuovere il terreno di coltura cellulare da uno o due pozzetti utilizzando una pipetta. Con cautela, aggiungere il campione di virus diluito goccia a goccia su ciascun monostrato di cellule, goccia a goccia attraverso il lato di ciascun pozzetto.

Ripetere il processo per ogni uno o due pozzetti fino a riempire l'intera piastra con i campioni di virus da placcare. Scuotere delicatamente l'intero piatto a mano.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 1 ora per consentire l'adsorbimento del virus. Dopo ogni 10 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatrice, farla oscillare delicatamente di nuovo per diffondere il virus in modo più uniforme su ogni pozzetto, quindi rimetterla nell'incubatrice.

Per ridurre la possibilità di contare inavvertitamente l'inoculo non assorbito, rimuovere il campione di virus dai pozzetti utilizzando un puntale per pipette da 1.000 microlitri e gettare il campione in un becher di scarto.

Mettere 2,5 millilitri di una sovrapposizione di metilcellulosa sulla piastra e rimetterla nell'incubatrice. Disinfettare il becher di scarto, in genere con l'aggiunta di candeggina, uno iodoforo o un virucida simile, prima di rimuoverlo dalla cabina di biosicurezza.

Dopo i due giorni di incubazione, rimuovere il rivestimento di metilcellulosa da uno o due pozzetti alla volta, utilizzando una pipetta, e metterlo in un becher di scarto. Aggiungere circa 2 millilitri di cristallovioletto all'1% e etanolo al 50% in ogni pozzetto. Incubare la piastra con tutti i pozzetti riempiti con la macchia per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

A questo punto, disinfettare il becher dei rifiuti, come dimostrato in precedenza. Lavare energicamente le piastre con acqua di rubinetto, fino a quando il deflusso è limpido.

Assicurarsi che ci siano differenze di circa 10 volte nel numero di placche in ciascuna serie di diluizione.