PCR bloccante wild-type per rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza

La reazione a catena della polimerasi bloccante wild-type, o WTB-PCR, rileva mutazioni puntiformi amplificando selettivamente gli alleli mutanti a bassa abbondanza e inibendo l'amplificazione degli alleli wild-type ad alta abbondanza nei campioni di DNA.

La WTB-PCR utilizza acidi nucleici bloccati, o oligonucleotidi modificati a filamento singolo contenenti LNA, complementari al filamento di DNA wild-type del campione che si lega specificamente al filamento complementare. Il legame con l'LNA blocca l'attività della DNA polimerasi e inibisce l'allungamento del DNA stampo wild-type.

Per eseguire la WTB-PCR, prelevare una miscela master contenente dNTP, LNA e primer diretti e inversi specifici per il bersaglio in acqua distillata priva di nucleasi.

Aggiungere una soluzione termostabile contenente DNA polimerasi alla provetta e pipettare la miscela nel pozzetto di una piastra PCR. Aggiungere il campione di DNA genomico contenente DNA wild-type e mutante nel pozzetto e iniziare la PCR.

Durante la PCR, la denaturazione mediata da alta temperatura separa i DNA a doppio filamento. I filamenti separati fungono da modelli per la ricottura dei primer, mentre l'LNA si lega al suo filamento complementare di DNA wild-type e forma l'ibrido bloccante-DNA wild-type. A una temperatura più elevata, la DNA polimerasi aggiunge dNTP ed estende i modelli primer-DNA.

Una temperatura di fusione più alta dell'ibrido LNA-DNA rispetto al complesso DNA-DNA lo mantiene intatto. La modifica dell'LNA alla fine impedisce alla DNA polimerasi di estendere l'ibrido LNA-DNA, che ne inibisce l'allungamento.

Nel corso di diversi cicli di PCR, il blocco mediato dall'LNA aumenta il numero di ampliconi di tipo mutante rispetto alla sua variante wild-type nel campione, aiutandone la rilevazione selettiva.

I primer diretti e inversi sono stati progettati con una sequenza 5'-M13 per consentire la ricottura di primer di sequenziamento complementari. Progettare l'oligonucleotide bloccante in modo che sia lungo circa 10-15 basi e complementare al modello wild-type in cui si desidera l'arricchimento mutante.

Un oligo più corto migliorerà la discriminazione del mismatch. Per ottenere un'elevata specificità del bersaglio, è importante non utilizzare troppo nucleotidi bloccanti, poiché ciò si tradurrà in un oligonucleotide molto "appiccicoso".

Per progettare l'oligonucleotide bloccante, inizia navigando sul sito Web di Oligo Tools. Seleziona lo strumento "Oligo T_M Prediction". Si aprirà una nuova finestra. Incolla la sequenza del modello wild-type da bloccare nella casella "Oligo Sequence". Aggiungi un segno più davanti alle basi del blocco per contrassegnarle. Fare clic sul pulsante "Calcola" per determinare il T_M approssimativo dell'ibrido bloccante del DNA. Le temperature di fusione calcolate appariranno nelle caselle sottostanti.

Progettare l'oligo bloccante in modo che abbia una temperatura di fusione da 10 a 15 gradi Celsius al di sopra della temperatura di estensione durante il ciclo termico. Qui, la temperatura di estensione è di 72 gradi Celsius. Per regolare la temperatura di fusione, aggiungere, rimuovere o sostituire le basi di blocco. Evitare lunghi tratti di tre o quattro basi C o G bloccanti.

Successivamente, per evitare la formazione di strutture secondarie o l'auto-dimerizzazione, torna alla schermata iniziale del sito Web di Oligo Tools e seleziona lo strumento "Oligo Optimizer". Si aprirà una nuova finestra. Incolla la sequenza del modello wild-type da bloccare nella casella. Aggiungi un segno più per indicare le basi di blocco. Seleziona le due caselle "Struttura secondaria" e "Solo auto" e premi il pulsante "Analizza" per vedere i punteggi per l'ibridazione e la struttura secondaria.

Questi punteggi rappresentano stime molto approssimative delle temperature di fusione degli autodimeri e delle strutture secondarie, rispettivamente. Punteggi più bassi sono ottimali e possono essere raggiunti limitando l'accoppiamento bloccante-bloccante. Rimuovere o riposizionare i nucleotidi bloccanti per ottenere punteggi più bassi. L'oligonucleotide bloccante ottimizzato per MyD88, mostrato qui, raggiunge un equilibrio tra la temperatura di fusione dell'ibrido bloccante del DNA e punteggi di ibridazione e struttura secondaria sufficientemente bassi.

È stato progettato per coprire gli amminoacidi da Q262 a I266 e presenta un dT 3'-invertito per inibire sia l'estensione da parte della DNA polimerasi che la degradazione da parte della 3'-esonucleasi. Una volta progettati i primer, impostare la PCR bloccante wild-type ed eseguire il termociclo, come descritto nel documento di accompagnamento.