Generazione di virus influenzali vivi attenuati ricombinanti per vaccini

Iniziare con plasmidi bidirezionali che trasportano cDNA che codificano alcune proteine virali essenziali di un ceppo influenzale adattato al freddo.

Introdurre un nuovo set di plasmidi bidirezionali contenenti emoagglutinina e cDNA modificato della neuraminidasi di un diverso ceppo influenzale.

Introdurre un reagente di trasfezione in questa miscela e incubare per formare un complesso con i plasmidi.

Trasferisci questi complessi su cellule epiteliali umane in coltura per consentire l'ingresso del plasmide nella cellula.

I plasmidi bidirezionali con due promotori in orientamenti opposti consentono la produzione di proteine virali e del loro RNA corrispondente.

Incubare le cellule a una temperatura più bassa.

Le proteine virali e gli RNA virali si autoassemblano per formare virus influenzali ricombinanti adattati al freddo con replicazione ridotta in condizioni più calde.

Sovrapposizione con cellule MDCK che sovraesprimono acido sialico ed enzimi tripsina modificati che consentono l'adesione e l'ingresso virale all'interno delle cellule.

Incubare alla stessa temperatura per indurre la replicazione e la produzione di nuovi virus.

Centrifugare e raccogliere i virus influenzali vivi attenuati ricombinanti pronti per la preparazione di un vaccino.

Per iniziare, piastrate un milione di cellule 293T in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di streptococco in penna. Quindi, preparare una miscela di trasfezione plasmidica sufficiente per 100 microlitri per pozzetto. Combinare un microgrammo di ciascun plasmide e riempire la provetta con terreno cellulare Opti-MEM preriscaldato fino a 50 microlitri. In un altro tubo, aggiungere il doppio del volume di lipofectamina 2000 corrispondente alla quantità totale di plasmide da trasfettare e rabboccare il tubo a 50 microlitri con Opti-MEM.

Prima di aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule, lasciarla riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 100 microlitri della miscela di trasfezione a ciascun pozzetto e spostare la piastra in un'incubatrice per 16 ore. Il giorno successivo, cambia il terreno in DMEM con lo 0,3% di BSA e l'1% di streptococco in penna. Allora. spostare le celle a 33 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per cinque ore.

Dopo cinque ore, aggiungere una sovrapposizione di un milione di cellule MDCK permissive all'influenza in DMEM integrato con tripsina. Mantenere le co-colture per 2 o 3 giorni sotto il regime di incubazione a 33 gradi Celsius per generare e amplificare il virus. Successivamente, rimuovere i detriti con una centrifuga di cinque minuti da 260 g, quindi raccogliere i surnatanti.