사람의 체외에서 억제

이 절차의 전반적인 목표는 체외 인간 억제 분석을 사용하여 treg 기능을 측정하고 향후 기능 손실을 잠재적으로 예측하는 것입니다. 이는 먼저 세포 자극기로 사용될 코딩된 비드를 준비하고 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 순수 순수 CD, 4개의 양성 CD, 25개의 음성 T 세포, 생체 내 활성화 CD 4개의 양성 CD, CD 25개의 낮은 T 세포 및 조절 CD 4개의 양성 CD 25개의 높은 T 세포 N을 항원 제시 세포 또는 APC로 사용하기 위해 방사 PP BMC로 분리

다음으로 단일 배양은 동일한 조건에서 P BMC를 APC 또는 공동 배양으로 사용하여 반응자로 순진하거나 활성화된 T 세포를 설정하지만 tregs를 1:10 비율로 추가합니다. 마지막 단계는 세포를 채취하고 tritiated에 의해 세포의 증식을 측정하는 것입니다. 최종적으로 얻어진 티미딘 통합은 순진한 T 세포 반응과 생체 내 활성화 T 세포 반응의 억제에 있어 차이를 입증할 수 있습니다.

제 이름은 제프 우드클리프입니다. 조절 T 세포는 고유한 세포 표면 마커를 발현하지 않습니다. 따라서 기능을 안정적으로 측정하려면 최상의 분리를 제공하는 기술을 사용하여 분리해야 합니다.

최대 분리와 같은 다른 방법보다 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 주요 이점은 팩스가 달성할 수 있는 순수한 세포 집단을 제공한다는 것입니다. 그런 다음 여기에 설명된 바와 같이 체외 억제 분석에서 세포 기능을 안정적으로 테스트할 수 있습니다.그러나 이 방법은 1형 당뇨병과 관련된 건강 및 피험자의 treg 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 인간적인 류마티스 관절염 조직 루푸스, ery 유사분열, 다발성 경화증 및 다른 사람과 같은 다른 자기 면역 질병에 반대로 인간적인 CD 3로 taal에 의하여 활성화된 구슬을 입히기 위하여 적용될 수 있습니다.

원래 바이알의 M 4개 50 toil 활성 비드 1ml를 1.5ml 튜브에 넣고 모든 비드가 튜브 측면에 부착될 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 그런 다음 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 동안 비드 버퍼를 피펫팅하여 제거합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내고 버퍼 1 1ml를 추가합니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 반복해서 놓습니다. 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 동안 버퍼를 제거합니다. Resus, 1 밀리리터의 완충액에 비드를 다시 매달아 놓습니다.

이번에는 40 마이크로 리터의 반 인간 CD 3를 추가합니다. 비드와 항체를 섭씨 37도에서 15분 동안 교반합니다. 그런 다음 부피 BS, A 당 0.1 % 무게를 추가하고 다음 16 시간 동안 교반을 계속하십시오.

다음으로, 1ml의 완충액에 비드를 배양하여 버퍼 2로 비드를 두 번 세척합니다. 섭씨 2도에서 8도에서 5분 동안 2회 촬영한 다음 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 동안 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 동일한 멸균 조건에서 비드를 한 번 더 세척하십시오.

이번에는 1ml의 버퍼 3을 사용하여 최적의 비율과 96 볼 플레이트에서 웰당 50, 020 5, 000 P BMC를 3배로 인용하는 ALI를 결정하기 위해 셀당 다양한 수의 CD 3 코팅 비드를 추가하여 항체 코팅의 효율성을 테스트합니다. 섭씨 37도에서 72시간 배양 후 트리티화 티미딘 마이크로 카레 1개를 추가하고 다음 16시간 동안 배양을 계속합니다. 다중 스크린 수확 플레이트 또는 이와 유사한 곳에서 세포를 수확합니다.

섬광 액체를 추가하고 분당 계수 또는 웰당 CPM을 읽습니다. top count N XT 섬광 계수기 또는 이와 유사한 것을 사용하여 경험에 비추어 볼 때 A CPM이 지속적으로 5, 000 이상이지만 15, 000 미만인 CPM을 사용하여 비드 대 세포 비율을 결정합니다. 세포당 3개의 구슬의 비율은 일반적으로 테스트된 모든 인간 피험자에서 반응자와 treg 세포 모두에 최적의 자극을 제공합니다.

50ml 원뿔형 튜브에 15ml의 fal plus를 채웁니다. 그런 다음 혈액 튜브에 PBS 250ml를 첨가하여 50ml의 버피 코트를 1-6회 희석합니다. 층을 방해하지 않고 fial pack 위에 희석된 buffy coat 25ml를 천천히 겹칩니다.

섭씨 4도에서 30분 동안 800배 G로 원심분리기합니다. 브레이크를 끈 상태에서 피알과 버퍼 사이의 흰색 중간 단계인 PBMC 층을 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우 튜브 벽에서 세포를 긁어냅니다.

몇 분 정도 기다렸다가 중간 단계에서 다시 수집하십시오. 세포를 새로운 50ml 튜브로 옮기고 튜브에 PBS 펠릿을 채워 세척합니다. PBM cs.

매번 세탁 단계를 두 번 반복하십시오. 두 개의 셀 펠릿을 단일 튜브로 결합하면 궁극적으로 모든 셀 펠릿을 단일 50ml 튜브로 결합할 수 있습니다. 그런 다음 20마이크로리터의 부유 세포를 사용하여 트리안 블루 배제에 의한 세포 생존율을 측정합니다.

1ml의 생존 가능한 pbmC를 새 튜브로 옮겨 APC를 생성합니다. 그런 다음 4ml의 배지를 추가하고 나머지 P BMC가 들어 있는 튜브에 PBS 완충액을 5, 000 rads로 세포에 조사합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 250 배 G로 세포를 회전 한 후 상등액을 붓고 동일한 혼합물을 4 밀리리터로 세포를 재현탁시킵니다.

그런 다음 200마이크로리터의 최대 anti-CD 4개의 마이크로비드를 pbmc에 추가하고 세포와 비드 혼합물을 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 40ml의 PBS 완충액으로 세포를 세척한 다음 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 상등액을 붓고 실온에서 8ml의 Degas PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, pres separation filters를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하여 분리합니다. 그런 다음 PBM CS를 두 개의 15ml 튜브로 나눕니다. 각 튜브에 4ml의 P BMC를 추가합니다.

두 개의 s 컬럼을 미니맥스 분리기에 두껍게 부착하고 각 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓습니다. 그런 다음 완충액이 남아 있지 않을 때 세포 현탁액이 완전히 소진되기 전에 각 튜브의 전체 4ml 세포 용액을 각 컬럼에 3ml의 DGA PBS 완충액을 추가합니다. 각 컬럼에 3ml의 DGA 실온 PBS 버퍼를 추가하고 버퍼가 수집 튜브로 흐르도록 합니다.

깨끗해질 때까지 버퍼를 더 추가하십시오. DGA를 5ml 더 피펫팅하여 LS 컬럼에 버퍼링한 다음 미니맥스 분리기에서 LS 컬럼을 제거합니다. 컬럼을 새로운 멸균 50ml 수집 튜브에 넣습니다.

반 밀리리터가 다 떨어지도록 한 다음 나머지 부피, 즉 약 4 밀리리터를 천천히 떨어 뜨립니다. 이제 두 개의 CD 4개의 양의 분수를 결합합니다. 그런 다음 튜브에 최대 50ml의 PBS를 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 400배 G로 세포를 회전시킨 후 세포를 계산합니다.

2ml의 PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 사실 염색에 사용할 항체를 하나의 튜브 anti CD 14, CD 32, CD one 16 및 선택적으로 anti CD four로 결합합니다. FLUOROCHROME을 염색하기 위해 튜브 하나를 뺀 혼합물의 분취량을 취하십시오.

5마이크로리터의 튜브 밀리리터 세포 현탁액을 팩스 튜브로 옮겨 FMO 튜브를 준비하고 이전에 준비된 항체 칵테일 2마이크로리터로 세포를 염색합니다. 다음으로, 염색되지 않은 세포와 단일 형광 색소로 염색할 마우스 IgG로 코팅된 비드를 세포 분류를 위한 보상 제어로 사용하기 위해 새로운 개별 팩스 튜브에 추가합니다. 그런 다음 칵테일에 50마이크로리터의 항인간 CD 25 PE를 추가하고 나머지 세포 현탁액에 칵테일을 추가합니다.

튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 항체 칵테일로 세포를 배양한 후 세포에 PBS 완충액을 첨가한 다음 Resus를 펠릿화합니다. PBS 완충액에 펠릿을 10 - 7 cells per milliliter 리더의 농도로 현탁시킵니다.

FMO 튜브를 사용하여 CD 25 양성 T 세포의 분류 임계값을 설정합니다. 이 게이팅 전략을 사용하여 먼저, 이 그림에서 볼 수 있듯이 단핵구, 대식세포 및 기타 모든 CD 4개의 양성 non T 세포로 구성된 fitz 양성 세포를 제외하기 위해 fite 음성 세포 주위의 보행을 설정합니다. 별도의 플롯에서 이 그림과 같이 CD 25 음성 및 CD 25 낮은 T 세포 및 CD 25 높은 Treg 세포에 대한 보행을 그립니다.

유동 후, 세포 subset을 분류하고, 수집 튜브를 펠릿화한 다음 도금할 때까지 T 세포를 얼음 위에 유지합니다. 표와 같이 U 하단 96웰 플레이트에 레이블을 지정합니다. 96 웰 플레이트에 10% 풀링된 human AB 혈청이 있는 완전한 배지에서 웰당 반응자 세포당 3개의 비드 농도로 계산된 CD 3코팅 비드의 50마이크로리터 분취액을 현탁한 다음 이전에 조사된 APC를 배지에서 10의 5배에서 밀리리터당 5번째 세포의 농도로 희석합니다.

50 마이크로 리터의 세포를 96 웰 플레이트에 첨가 한 다음 2.5 배 10을 4 개의 CD 4 개의 긍정적 인 CD 25 음성 또는 CD 4 개의 긍정적 인 CD 25 낮은 T 세포에 3 회 첨가하여 B행에 tregs를 추가하고 여기에 표시된 바와 같이 1 대 10 비율로 공동 배양의 tregs로만 표시된 웰에 tregs를 추가합니다. 그런 다음 포화 습도에서 5%CO2의 인큐베이터에서 섭씨 37도의 플레이트를 72시간 동안 배양합니다. 다음으로, 트리티화된 티미딘 1개의 마이크로 퀴리로 세포를 펄스한 다음 공동 배양의 마지막 몇 시간 동안 티미딘이 통합된 후 다음 16시간 동안 섭씨 37도에서 배양을 계속합니다.

필터 메이트 수확기를 사용하여 다중 스크린 수확 플레이트에서 세포를 수확합니다. 그런 다음 이전에 섬광 유체로 채워진 투명한 플라스틱 덮개로 수확 플레이트를 덮습니다. 마지막으로 웰당 CPM을 읽습니다.

섬광 계수기를 사용하여 T 세포 subset은 다음 일련의 점도표에서 볼 수 있듯이 이 시스템에 의해 고순도로 분리될 수 있습니다: CD 4개의 positive CD, 25 negative T cell이 하단 게이트에 표시되어 있습니다. 다음 그림에서는 고도로 정제된 CD 4개의 positive CD 25 low T cell을 볼 수 있습니다. 흐름의 순수 모집단은 CD 4 양성으로 분류되었습니다.

CD 25 고treg 셀은 상단 게이트 컨트롤에 표시됩니다. 건강한 피험자로부터 얻은 APC 및 treg의 단세포 유형 배양은 thymidine 통합에 의해 측정된 바와 같이 백그라운드에 대한 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않은 반면, naive CD 25 음성 및 생체 내 활성화 CD 25 low T 세포는 이러한 반응 세포 유형이 treg 세포와 공동 배양될 때 억제되는 현저한 증식을 나타냈습니다. 반응자를 억제하는 tregs의 능력에는 약간의 차이가 있었지만 Naive CD 25 negative와 in vivo activated CD 25 low T cell이 관찰되었습니다.

중요한 통제는 아니었습니다. 위험에 처한 피험자로부터 APC 및 Tregs의 단일 세포 유형 배양은 thymidine 통합에 의해 측정된 바와 같이 배경에 대한 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않았습니다. 반면, Naive CD 25 음성 및 InVivo 활성화 CD 25 저T 세포는 건강한 대조군에 비해 낮은 증식 수준을 보였습니다.

반응자 T 세포는 tregs 및 co 배양에 의해 더욱 억제되었는데, 이는 분석이 신뢰할 수 있는 결과를 생성하기 때문입니다. 또한 낮은 CPM 값은 신호 전달의 잠재적 결함을 암시한다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 다른 유형의 연구에서 추가로 조사해야 합니다. 그러나 위험 피험자에서 CD 25 음성과 CD 25 저반응 T 세포를 억제하는 tregs의 용량 차이는 유의했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 건강한 피험자와 면역 체계가 손상된 피험자에서 Tregs의 존재에 대한 성공적이고 신뢰할 수 있는 기능 테스트에 필요한 모든 단계를 원활하게 연결하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 예를 들어, 제1형 당뇨병이 있는 피험자에서.