기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

다음 실험의 목적은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 세포 점탄성 특성을 분석하는 것입니다. 이는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관으로 구성된 압력 변환기에 연결된 aass 마이크로 피펫을 통해 세포막에 음압을 가함으로써 달성됩니다. 피펫은 도립 현미경의 스테이지에 위치한 미세 마이크로 매니퓰레이터에 장착되고 피펫 끝은 세포에 가깝게 가져옵니다.

다음으로, 피펫 끝과 피펫 내로의 세포막 변형 사이에 밀봉이 생성된 다음 음압이 가해진 단계에 대한 응답으로 측정됩니다. 잘 정의된 힘에 대한 반응으로 막 변형의 정도에 따라 세포 생체역학적 특성에 대한 다양한 처리의 효과를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 우리 연구실의 영향은 이상지질혈증이 혈관 내피 세포의 생물물리학적, 생체역학적 특성에 미치는 영향을 조사하는 것이며, 오늘은 세포 경직도를 측정하는 데 사용하는 마이크로피펫 흡인이라는 방법에 대해 말씀드리

이 기술의 의미는 혈관 신생, 기계적 감지, 이동 등과 같은 여러 메커니즘에서 세포 생체 역학에 대한 기본적인 이해로 확장됩니다. 이 방법은 세포 생체 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모델 멤브레인, 세포 내 소기관 또는 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 세포막을 시각화하고 피펫으로의 막 투영을 관찰하기 위해 혈관 내피 세포막을 친유성 형광 염료로 염색합니다.

먼저 원액 염료를 가열된 PBS 용액으로 작업 농도로 희석하고 혼합물을 5분 동안 초음파 처리하여 D 응집체를 분해합니다. 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 회전한 후 PBS 0.5ml를 첨가하여 supinate 세척 혈관 내피 세포를 제거합니다. 5분 후 용액을 흡입하고 두 번 더 세척합니다.

그런 다음 주사위 용액을 세포에 넣고 30분 동안 배양하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 배양합니다. 배양 후 이전과 같이 PBS로 세포를 다시 세척합니다. 마이크로 피펫은 중간에 유리 모세관을 가열하여 당겨집니다.

유리가 녹기 시작하면 모세관의 두 반쪽이 분리되어 두 개의 마이크로 피펫이 생성됩니다. 이러한 실험에 사용된 피펫의 팁은 일반적으로 2-6미크론 사이입니다. 외경은 세포의 크기에 따라 팁의 모양이 원통형 튜브와 비슷하여 피펫 풀러에 유리 모세관을 삽입하기 시작해야 합니다.

이 시연에서는 Suter P 97 수평 피펫 당김이 최적화된 프로그램과 함께 사용됩니다. 이 풀러는 풀의 속도 및 기타 매개변수를 변경할 수 있는 여러 프로그래밍 가능한 옵션을 제공합니다. 풀 프로그램 활성화를 진행합니다.

각 마이크로 피펫을 당긴 후 현미경으로 팁의 모양을 확인합니다.팁을 불로 연마한 후 마이크로 피펫에 PBS 또는 비형광 성장 매체와 같은 생리학적 식염수를 채웁니다. 중요한 것은 세포막이 피펫 내부로 원활하게 이동할 수 있도록 용액에 30% 혈청을 보충해야 한다는 것입니다. 이 시연에서는 3D 디콘볼루션 기능이 있는 도립 형광 현미경을 컴퓨터, 압력 변환기, 무진동 스테이션 및 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 비디오 카메라와 함께 사용하여 세포를 기질에서 들어 올리고 도립 형광 현미경에 장착된 얕은 세로 챔버에 피펫팅하여 세포를 마이크로 흡인 챔버에 장착하기 시작합니다.

얕은 세로 챔버를 사용하는 이유는 마이크로 피펫이 가능한 한 수평에 가까운 매우 얕은 각도로 셀에 접근할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 마이크로 피펫으로 당겨진 멤브레인을 단일 초점면에서 시각화할 수 있도록 하기 위해 수행됩니다. 채워진 마이크로 피펫을 유연한 튜브로 전력 변환기에 연결된 피펫 홀더에 넣고 꼭 맞도록 피펫 홀더의 커넥터에 맞게 직경을 조정합니다.

각 실험을 시작할 때 피펫의 압력은 대기압과 평형을 이루고 미크론 범위 범위에서 피펫 움직임을 미세하게 제어할 수 있는 마이크로 매니퓰레이터에 피펫을 장착합니다. 피펫을 챔버 바닥에 얕은 각도로 배치하고 피펫 끝을 시야의 중앙으로 가져옵니다. 멤브레인이 흡인되는 피펫 팁의 원통형 부분인 피펫의 생크는 초점면에 수평으로 정렬되어야 합니다.

이 첫 번째 위치를 달성하기 위해 가능한 가장 얕은 각도로 피펫을 만든 다음 챔버 바닥에 대해 피펫의 생크를 구부립니다. 생크가 매우 얇기 때문에 셀에 접근하는 동안 챔버 바닥에서 미끄러질 수 있을 만큼 유연합니다. 코스매니퓰레이터를 사용하여 세포의 초점면 근처까지 마이크로 피펫을 단일 세포의 측면으로 천천히 내려갑니다.

그런 다음 미세 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 끝이 멤브레인에 부드럽게 닿을 때까지 마이크로 피펫을 세포 가장자리로 이동합니다. 피펫의 위치를 관찰하기 위해 하나의 이미지를 촬영합니다. 피펫의 전체 팁이 세포 표면과 완전히 접촉하고 접촉이 안정적일 때 양호한 밀봉이 생성됩니다.

다음으로, 트랜스듀서를 사용하여 음압 단계를 적용하고 멤브레인 돌출부가 안정화될 때까지 유지합니다. 멤브레인을 피펫으로 흡인하는 데 필요한 압력의 양은 세포 유형과 특정 실험 조건에 따라 다릅니다. 초기 변형은 일반적으로 수은 영하 2에서 영하 15밀리미터 범위의 압력을 가할 때 관찰됩니다.

압력이 가해지면 멤브레인은 특정 길이로 안정화될 때까지 점차적으로 피펫으로 변형됩니다. 이 시간 동안 일반적으로 2-3분이 소요되는 프로세스로, 파이펫으로 당겨지는 멤브레인의 진행 상황을 추적하기 위해 30초마다 멤브레인 변형 이미지가 필요합니다. 마지막으로, 수은 2-5mm 단계로 압력을 다음 수준으로 높입니다.

멤브레인 돌기가 세포에서 분리되어 피펫 내부로 이동할 때까지 전체 절차를 반복한 다음 실험이 중지됩니다. 멤브레인 변형의 정도를 정량화하기 위해 흡입 길이는 피펫 끝에서 멤브레인 돌출 둘레의 정점까지 측정됩니다. 더 큰 피펫은 피펫 직경 간의 변동성을 설명하기 위해 동일한 수준의 압력에서 세포막에 더 많은 힘을 가합니다.

기질 부착 세포에 대한 마이크로 흡인 기법의 사용을 검증하기 위해 각 실험에 대해 측정된 피펫 직경에 대해 흡인 길이를 정규화하고, 이 접근법에 의해 추정된 바와 같이 소 대동맥 내피 세포의 세포 강성을 감소시키는 F 액틴의 중단으로 테스트되었습니다. 여기서, 마이크로 피펫을 통해 가해지는 음압에 반응하여 점진적 변형을 겪는 내피막의 전형적인 일련의 형광 이미지가 예상대로 표시됩니다. 멤브레인은 점차적으로 피펫 내로 흡인되고 변형의 가해진 압력 시간 경과의 함수로 흡인 길이가 증가하며, 이는 f actin의 파괴가 모든 압력 조건에서 돌출부의 흡인 길이를 크게 증가시킨다는 것을 보여줍니다.

이 접근법을 사용하여 세포막에서 콜레스테롤이 고갈되면 세포 경직도가 증가하는 반면 콜레스테롤 농축은 효과가 없다는 것이 밝혀졌습니다. 여기. 콜레스테롤이 풍부한 세포, 대조군 세포 및 콜레스테롤 고갈 세포는 수은을 뺀 15mm의 최대 흡인 길이에 도달한 후 표시됩니다. 투영은 일반적으로 수은 영하 10mm에서 발생하기 시작했으며, 멤브레인 변형의 시간 원인은 수은 10, 15 및 20mm의 음압에서 측정 할 수 있습니다.

여기서, 최대 흡인 길이는 적용된 압력의 함수로 표시됩니다. 고갈된 세포의 최대 정규화 길이는 수은 영하 15mm와 수은 영하 20mm의 압력에 대해 대조 세포보다 현저히 낮았습니다. 수은이 25mm 이상인 음압을 가하면 흡인 돌출부가 분리되어 별도의 SLE를 형성했습니다.

막 박리를 초래한 압력 수준은 다른 콜레스테롤 조건과 예상치 못한 관찰에서 비슷했습니다. 이전 연구에서 밝혀진 바와 같이, 막 콜레스테롤의 증가는 막 지질 이중층의 강성을 향상시킵니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행하면 2-3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안 이 실험이 개별 세포에서 수행된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 총 3개의 총 3개의 실험에 대해 실험당 조건당 3개에서 5개의 세포를 분석해야 합니다.