Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Olá, meu nome é Dorte do Thea Hands Institute da Universidade de Tecnologia, Reen Laser. A microdissecção é uma técnica que permite obter uma população celular especial a partir de quantidades muito pequenas de tumor original. As células dissecadas podem ser usadas para estudos transcriptômicos e proteômicos, avaliação de DNA ou análise cromossômica.

Aqui, fornecemos nosso protocolo para aquisição de metacélulas pancreáticas humanas de espécimes cirúrgicos para serem usados em estudos transcriptômicos. Corte o tecido pancreático em pedaços pequenos. Coloque uma peça no centro de um molde criogênico e cubra-a com composto de incorporação refrigerado.

Congele o tecido imediatamente com dois materiais refrigerados Butão e armazenados a menos 80 graus Celsius. Seccionar a etiqueta 40 lâminas adesivas e pré-resfriá-las dentro da Câmara Crística. Fixe o tecido congelado no suporte da amostra com o composto OCT depois de aparar o bloco criogênico.

Corte 40 seções de 10 micrômetros de espessura. Transfira uma seção para uma lâmina tocando na parte de trás da lâmina com o dedo para aquecer apenas a posição de colocar a seção sobre ela.Experimente as seções dois a três minutos dentro do criogênico morto e armazene-as depois a 80 graus Celsius negativos, prepare os reagentes de ação e resfrie todos os líquidos, exceto a selina no gelo. Isso aumentará a autofluorescência intrínseca das células PET antes da microdissecção.

Quatro seções serão reduzidas a cada vez. Lidar com duas seções ao mesmo tempo. Fixe-os primeiro em etanol a 70% por 30 segundos.

Em seguida, lave as seções com cinco a seis mergulhos rápidos. Em água tratada DPC a seguir. Desidrate o tecido um minuto em 100% de etanol e repita Esta etapa, incube as lâminas em seline por quatro minutos.

Enquanto isso, inicie a desidratação de outro par de seções. Finalmente, seque as lâminas ao ar por três a cinco minutos no escuro. Proteja o tecido da umidade e a autofluorescência do branqueamento, colocando as duas lâminas costas com costas em uma folha Enrole o tubo de 50 ml Antes da seção, limpe o microscópio com RNAs e prenda a tampa adesiva no robô Mover.

Insira o slide no stage e mova a tampa sobre a seção sem tocá-la. Localize os ilhós identificando as melhores áreas celulares autofluorescentes. A autofluorescência intrínseca das células humanas melhores aparece amarela na configuração, enquanto os ductos pancreáticos mostram autofluorescência verde brilhante.

Selecione as melhores áreas celulares com a ferramenta de seleção à mão livre e microdisseque-as iniciando o laser. Disseque os ilhós de quatro seções criogênicas reduzidas em uma tampa adesiva dentro de 40 a 60 minutos. Se desejar, verifique o tecido capturado movendo a tampa para o ponto de verificação do microscópio.

Remova a tampa do motor robótico e canalize-a. Tampão de extração de 10 microlitros na tampa da tampa para ruptura celular. Incube a tampa de cabeça para baixo a 42 graus Celsius por 30 minutos.

Gire o lisado, rotule o tubo e armazene-o a menos 80 graus Celsius diminuídos até que a extração de RNA possa ocorrer. Execute o laser de ação, micro dissecção e lise com todas as 40 dissecações criogênicas. Em seguida, unir os 10 lisados e continuar com o isolamento de RNA usando o kit de isolamento de RNA de PU UR seguindo o protocolo fornecido para obter 11 microlitros de RNA.

Em geral, não encontramos uma relação direta entre a quantidade de tecido microdissectivo e o rendimento de RNA As diferenças no intervalo de tempo entre a coleta pelos cirurgiões e o congelamento da amostra pancreática após seu exame pelo patologista, poderiam explicar em parte a qualidade e a quantidade de RNA recuperado. Outros fatores-chave a serem considerados são a energia do laser aplicada para microdissecção com a energia mais baixa, usando a integridade do RNA mais alta, bem como o foco do laser e a distância dos pontos de apontamento do cortador de pressão do laser. Além disso, a quantidade de RNA pode ser otimizada mantendo a distância entre a tampa adesiva e a mais baixa possível.

Evite a perda de tecido microdissecado durante o processo de captura, desde que o microscópio de microdissecção a laser esteja disponível. Este procedimento pode ser implementado em qualquer instituição de pesquisa que realize ectomias parciais do pâncreas, aumentando assim o acesso ao material palpebral humano de indivíduos não diabéticos e diabéticos.