胚心室内皮細胞の単離

この手順の全体的な目標は、胚性心室内皮細胞を単離することです。これは、最初に解剖のために胚を回収することによって達成されます。次に、心臓を切除します。

房を切除し、みじん切りにした心室をコラーゲン溶液に移します。次に、シングルセル懸濁液を、内皮細胞を認識する抗体とインキュベートします。そして最後に、磁石を使用して抗体結合内皮細胞を分離します。

最終的には、明視野顕微鏡を通じて内皮鎖形成を示す結果を得ることができます。この方法は、冠状動脈内皮の移動を促進する要因など、心血管開発分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は内皮細胞の挙動に関する洞察を提供することができますが、筋細胞や線維芽細胞などの他の細胞タイプにも適用できます 組織培養フードで解剖作業を行う前日に、ここで使用するラット抗CD31抗体の製造元の指示に従って、選択した抗体を適切なダイナビーズと組み合わせます。

25マイクロリットルのビーズに3マイクロリットルの抗体を添加し、最終濃度を10個に1.5マイクログラムにすると、7個のビーズが抗体中のビーズを摂氏4度で一晩インキュベートし、氷上の組織培養フードで単離された細胞を迅速に尿細管形成するためのコラーゲンゲルを調製します。コラーゲン1型滅菌水、10 XM 1 99、および5モルの水酸化ナトリウムを組み合わせました。テキストプロトコルに従って、20マイクロリットルのコラーゲンゲルを384ウェル組織培養プレートのウェルにピペットで移します。

プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに30分間置きます。各ウェルに80マイクロリットルのDMMを加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。培地を取り出し、最終すすぎ後にさらに2回洗浄を繰り返し、各ウェルに80マイクロリットルの10%FBS DMを加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。

所望の胚の日に時限妊娠マウスを安楽死させた後。承認された技術を使用し、テキストプロトコルに従って子宮角を取り外し、1つのXPBSを入れたペトリ皿に入れてすすぎます。胎盤と胚の接合部にある正中線切開を介して胚嚢が露出したら、胚嚢を切り開いて胚を回収します。

胚を冷たいPBSを入れた2番目のシャーレに置き、子宮角を氷に戻して胸壁へのアクセスを改善します de 胚を降伏させます。そして、ジェノタイピングを行う場合は、尾を切って氷の上のチューブに保存します。胚を背中に切って

胸壁を開いて心臓と肺を視覚化し、心臓を切らないようにします。胸郭の側面に沿って4本の肢の近くで垂直に切り込みを入れ、続いて肋骨の底を横切って水平に切り込みを入れます。次に、胸壁をゆっくりと引き上げ、ほぼ胎児の13.5日目まで邪魔にならないように

胸壁は透明で、視覚化に役立ちます。鉗子を使用して、心臓を慎重に持ち上げ、下の血管を切断します。必要に応じて、心臓を清潔な皿に移して、心臓を肺から解放し、大きな血管の上で切ります。

次に、心室から心房と大血管を分離して廃棄します。次に、ハサミを使用して心室を細かく刻み、氷上の約500マイクロリットルのコラゲナーゼに入れます。残りの胚から心室を切除して処理し、各心臓を別々のチューブに集めます。

15分ごとに45分間揺さぶりながら、ミンチした心室を摂氏37度に置き、サンプルを静かに取り出し、ピペットで上下させて細胞を機械的に解離します。インキュベーション後、心室コラゲナーゼ溶液を70μmフィルターに通して残りの細胞塊を除去し、細胞を400Gで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、DMEMピペットで約200マイクロリットルの10%FBSと交換して細胞を再懸濁し、細胞を再度回転させ、次に2回目の洗浄と回転後に回転させます。Resusは、細胞を10%FBSのdmmで50マイクロリットルに懸濁します。

次に、まず抗体とビーズのチューブを磁石に1分間置いてビーズを調製し、上清を吸引します。次に、チューブを磁石から取り外し、dmmに約100マイクロリットルの10μリットルを追加します。チューブを磁石に1分間戻し、上清を取り除きます。

最終洗浄後、合計3回洗浄を繰り返します。抗体標識ビーズをDMM中の10%FBSに各細胞サンプルに再懸濁し、抗体標識ビーズを5マイクロリットル加えます。ビーズ細胞懸濁液を摂氏4度に置き、層流フードに30分間揺さぶり、サンプルを磁石に1分間置き、上清を吸引します。

チューブをマグネットから取り外し、約100マイクロリットルの10%FPSとdmで洗浄します。最終洗浄後、合計5回の洗浄を繰り返します。ビーズを約100マイクロリットルのDMEMに懸濁します。

チューブを磁石に1分間置きます。培地を取り出し、100〜200マイクロリットルの温めたEDTAに0.25%トリップを加え、サンプルを摂氏37度、二酸化炭素5%で5分間インキュベートします。チューブを磁石に2分間置きます。

次に、上清を含む細胞を慎重に新鮮なチューブに移し、400Gで5分間遠心分離します.最後に、上清Resusを除去した後、細胞を80〜100マイクロリットルの内皮増殖、培地およびプレートに懸濁します。96または384のよく処理された培養皿において、E 14.5〜E 16.5胚からの心室の各ペアの予想収量に応じて、CD31を認識する内皮特異的抗体を用いてここで実証されるように、典型的には450〜600個の細胞を収量する。内皮細胞は、E 13.5日目の胚の心室から単離されました。

未処理の培養皿で培養すると、これらの細胞は丸みを帯びたままで、コンフルエントに近いときに丸石のパターンを形成します。細胞は希薄なコラーゲンでコーティングされたプレートに接着しますが、E 18.5心室から単離されたこれらの細胞は、コラーゲンゲルでコーティングされた場合よりも少ない鎖を形成します。さらに、細胞はより迅速に細胞細胞相互作用を形成し、鎖を形成し、コラーゲンゲル上の分岐とコラーゲンコーティングされたプレートの分岐がそれらの同一性の検証として行われます。

この図の細胞は、内皮マーカーISOセレクチンで陽性に標識されています。また、ここに示すように、E18.5心室から単離された内皮細胞は、内皮マーカー、PAMおよびフリック1で正に標識した。この図は、E 14.5胚の心室から単離され、内皮特異的色素細胞で標識された内皮細胞を示しています。

16個の単離された細胞は、1回の弱体化培養まで生き残りますが、化には耐性があるため、終末実験に最適です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約3時間半で完了します。この手順に続いて、チューブ形成アッセイやトランズウェル遊走アッセイなどの他のアッセイを実施して、これらの単離された細胞がin vitroでどのように振る舞うかを決定することができます。