La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l'aide de micro puits Plaques

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire un grand nombre de sphéroïdes tumoraux de taille uniforme et contrôlée. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des plaques de micropuits afin d'agréger les cellules destinées à former les sphéroïdes. Dans un deuxième temps, une culture du type cellulaire souhaité est récoltée, fournissant ainsi la suspension cellulaire qui déterminera la taille et la composition des OID.

La suspension cellulaire est ensuite centrifugée dans les micropuits et incubée afin de permettre la formation de stéroïdes après l'incubation. Les stéroïdes obtenus sont très uniformes et peuvent être collectés ou cultivés dans les micropuits où ils se sont formés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'un très grand nombre d'agrégats uniformes peuvent être produits simultanément.

Les personnes novices avec cette méthode peuvent constater que leur carburant varie beaucoup en taille. Il est important de s'assurer que la suspension cellulaire est uniformément répartie sur la plaque, et que les supports mobiles de la plaque dans la centrifugeuse centrale se déplacent librement afin que la force soit perpendiculaire à la surface. Pour commencer, préparez une plaque agro well 400 stérile en ajoutant 0,5 millilitre de solution de rinçage contenant un agent tensioactif à chaque puits.

L'utilisation d'un tensioactif garantit que les cellules n'interagissent pas avec la surface du micropuits. Pour éviter de piéger des bulles d'air dans les micropuits, ajoutez le liquide sur un côté et laissez-le s'étendre sur la surface, plutôt que de le laisser tomber verticalement sur celle-ci. Après avoir ajouté la solution dans les puits, remettez le couvercle en place.

Veillez à ce que le rotor soit correctement équilibré avant de centrifuger les plaques pendant deux minutes à 2000 fois G. À l’aide d’un microscope inversé à faible grossissement, vérifiez que les bulles ont été éliminées des micro-puits. Incubez la plaque pendant au moins 30 minutes, couvercle en place, à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Aspirez la solution de rinçage des puits et lavez la plaque avec de l’eau stérile ou du PBS immédiatement avant utilisation.

Ne laissez pas les plaques sécher après le codage. Les détails de la préparation des cellules varient selon le type cellulaire spécifique étudié. Toutefois, nous avons observé que cette condition est efficace pour un large éventail de cellules, y compris les lignées que nous avons mentionnées ici, ainsi que les cellules souches embryonnaires humaines et neuronales, les cellules souches pluripotentes induites humaines, les fibroblastes, les cellules endothéliales primitives présumées et les cellules stromales. Pour préparer les cellules, commencez avec un flacon T 75 de cellules HT 29.

Aspirez le milieu de croissance du flacon et ajoutez trois millilitres de trypsine. Incubez les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Arrêtez la digestion par la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de croissance.

Transférez le reste dans un tube de centrifugation de 15 millilitres. Ensuite, à partir d’un tube de 15 millilitres, prélevez une aliquote pour le décompte cellulaire. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 200 ×g pendant que la centrifugation est en cours.

Compter les cellules. Ensuite, aspirer le mélange de milieu contenant la tryine et le remplacer par du milieu de croissance frais, en un volume déterminé selon la densité cellulaire requise calculée précédemment, comme décrit dans le protocole écrit, en une étape facultative.

Faire passer la suspension cellulaire à travers un tamis afin d'éliminer tous les agrégats. Les sphéroïdes peuvent être générés selon diverses formulations de milieu, mais les essais initiaux doivent être réalisés avec le milieu dans lequel les cellules ont été cultivées. Pour distinguer les effets liés au passage à un système de culture tridimensionnel de ceux liés à un changement de composition du milieu, commencer par ajouter 0,4 millilitre de milieu de croissance à chaque puits centrifugé pendant deux minutes à 2000 ×g. À l’aide d’un microscope inversé à faible grossissement, vérifier que les bulles ont été éliminées des micropuits.

Ensuite, ajoutez 0,4 millilitre de suspension cellulaire à la densité requise dans les micropuits. Mélangez ensuite délicatement par aspiration et distribution à l’aide d’une pipette, sans introduire de bulles d’air dans les micropuits, et assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans tout le puit. Pour obtenir des stéroïdes cohérents.

Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 200 fois g. La plaque doit être équilibrée intérieurement ainsi qu’en regard de l’autre plaque afin que le poids soit réparti uniformément des deux côtés du porte-plaque. Cela garantit que la plaque s’auto-niveaute durant la centrifugation, empêchant ainsi l’apparition de courants de convection qui entraîneraient une répartition inégale des cellules dans les micropuits.

À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez que les cellules se sont regroupées dans les micropuits et qu’elles sont uniformément réparties dans le puits avant d’incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius. Observez le processus de formation des sphéroïdes à l’aide d’un microscope inversé. Certaines lignées cellulaires formeront des sphéroïdes compacts en moins de 24 heures.

D'autres peuvent prendre plus de temps. La progression du regroupement en agrégat chez les cellules HT29 est illustrée ici. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à extraire les stéroïdes intex sans perturber les structures. Pour extraire les stéroïdes des puits microscopiques, pipetez doucement par aspiration et distribution afin de permettre aux sphéroïdes de sortir des puits microscopiques.

Ensuite, inclinez la plaque pour aspirer le mélange de milieu et de stéroïde. Utilisez des embouts de pipette à orifice large pour les stéroïdes de plus grande taille afin d'éviter de les fragmenter. Après avoir récupéré le stéroïde des micropuits, transférez-le en culture en suspension en les expulsant délicatement à l’aide d’une pipette.

Alternativement, la rose sévère peut être maintenue en culture avec un renouvellement du milieu. La durée dépend de la taille initiale et du taux de croissance, qui détermine le temps nécessaire avant qu'elles ne dépassent la taille des micropuits. En effet, ils ont été formés afin de permettre le renouvellement du milieu sans perte de stéroïdes.

Aspirez le milieu au bord du puits. À l’aide d’une pipette Pasteur, abaissez lentement la pointe jusqu’à ce qu’elle commence à aspirer le liquide à partir du ménisque, puis suivez la descente du ménisque au fur et à mesure qu’il baisse. Ajoutez ensuite du milieu frais contre la paroi du puits, au même endroit.

Lors de l'ajout du milieu frais, pensez à enfoncer doucement la pipette et à maintenir la pointe contre la paroi afin d'éviter de perturber les PHE dans les micropuits. Quelques stéroïdes peuvent être perdus. Toutefois, si le milieu est toujours aspiré et remplacé à la même position, ce nombre restera faible.

Par rapport aux grands nombres présents dans le puits, les stéroïdes provenant de plusieurs lignées tumorales d'origines anatomiques différentes peuvent être facilement extraits en suspension. Le contrôle de taille constant réalisable par cette méthode est illustré ici par des populations de stéroïdes hautement uniformes. Chaque condition est formée à partir de 700 ou 1 500 cellules.

Des différences interlignées nettes au niveau du comportement sont également visibles avec les cellules de cancer du côlon HT29 et les cellules de cancer de l’œsophage TE6, qui forment des agrégats densément compacts avec des limites nettement définies. En revanche, les cellules de cancer de la prostate LinCaP donnent naissance à des agrégats moins cohérents aux frontières irrégulières. Les forces internes plus fortes présentes dans les agrégats les plus cohérents ont également entraîné un effondrement vers une forme plus symétrique, même lorsqu’ils se trouvaient encore dans les micropuits où ils avaient été formés.

Cependant, les agrégats de bouchons linéaires conservent visiblement, en particulier pour les tailles plus grandes, la géométrie paramétrique carrée des micropuits. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en environ une heure, plus la période d'incubation nécessaire pour que les cellules adhèrent et forment des fluides. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de veiller à éliminer les bulles d'air qui pourraient circuler dans les micropuits avant l'ajout des cellules.