Criação de um In Vitro Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo in vitro altamente reprodutível de barreira hematoencefálica de rato. Isso é feito removendo os nervos ópticos, o cerebelo e as meninges sob um microscópio estéreo, separando os dois hemisférios cerebrais e dissecando-os para obter um pedaço limpo do córtex. O segundo passo é isolar os microvasos do córtex por tratamento enzimático e centrifugação dependente da densidade.

Em seguida, os microvasos são plaqueados e incubados com pur micina para purificar as células endoteliais de células contaminantes, como parasitas. Culturas puras de células endoteliais cerebrais envolventes proliferam até que as células atinjam 90% de confluência. A etapa final é induzir a diferenciação das células endoteliais do cérebro de rato pelas células na câmara superior dos filtros de inserção e cocultivá-las com astrócitos de rato que foram previamente preparados e plaqueados.

Em última análise, a monocamada diferenciada de células endoteliais cerebrais pode ser caracterizada pela expressão de proteínas específicas de junção apertada e pelo índice de permeabilidade de um composto de referência através da monocamada de células endoteliais a partir do compartimento superior. Os modelos de BBB in vitro, como o apresentado aqui, são úteis para explorar a distribuição celular de moléculas-chave e desvendar os mecanismos celulares e moleculares básicos da função da BBB. Em particular, tais modelos permitem a exploração dos receptores BBB, seu envolvimento no tráfego de endocitose e transcitose em nossas mãos.

Os modelos de BBB in vitro são usados principalmente para investigar o direcionamento de receptores específicos com vetores peptídicos que desenvolvemos Para facilitar a entrega de medicamentos no SNC através do BBB, usamos um processo chamado transcitose mediada por receptor, também conhecida como abordagem do cavalo de Tróia. A descrição visual é crítica como indivíduos. Novo neste método exigirá habilidade de dissecação e há um microscópio para ser rápido e preciso o suficiente para entrar na sobrevivência do tecido durante o processo de produção celular.

Outro ponto crítico é um final precoce da área frágil e tele salmão para evitar a abertura de barreiras durante as experimentações. Por fim, essa ideia mostrará detalhes ao longo do protocolo que farão a diferença entre os protocolos vermelho e visualizado, demonstrando que o procedimento será feito por mim e meu colega. Comece este procedimento revestindo dois frascos T 75 com colágeno tipo quatro e fibronectina a um micrograma por centímetro quadrado em água de cultura estéril e deixe-os aderir na incubadora a 37 graus Celsius até a semeadura dos microvasos.

Dois dias depois, remova o cérebro do crânio de três ratos Vista de cinco semanas de idade e transfira os cérebros para uma placa de Petri cheia de tampão de dissecação a frio mantido no gelo. Disseque os cérebros sem o cerebelo e os nervos ópticos. Em seguida, corte cada cérebro ao meio para separar os dois hemisférios cerebrais sob o microscópio estereoscópico.

Faça outro corte para remover o mesencéfalo e transfira todos os quatro cérebros para uma placa de Petri limpa no gelo com tampão de dissecação. Em seguida, transfira um prosencéfalo para uma nova placa de Petri cheia de tampão de dissecção a frio. Segure-o com uma pinça e retire cuidadosamente as meninges das bordas do prosencéfalo.

Depois, vire o prosencéfalo e retire cuidadosamente as meninges sem rasgá-las. Certifique-se de que o prosencéfalo esteja limpo de meninges e corte a parte restante dos nervos ópticos. O objetivo desta etapa é remover o edredom da substância branca para obter uma concha de córtex.

Comece prendendo o prosencéfalo na borda e, em seguida, arraste cuidadosamente a pinça ao longo da superfície, tomando cuidado para não rasgar a superfície do córtex. Em seguida, certifique-se de que o cérebro esteja livre das meninges, rolando-o para verificar se não há meninges residuais ou grandes vasos superficiais. Em seguida, começando com a extração dos três cérebros de seu crânio, o tempo total para a dissecção não deve levar mais de duas horas para preservação do tecido e sobrevivência celular.

Transfira os córtices de três cérebros para seis mililitros de tampão de dissecção a frio em um homogeneizador de sete mililitros para baixo, dissocie posteriormente os córtices com 10 golpes para cima e para baixo com o primeiro pilão de maior folga seguido por 10 golpes para cima e para baixo com a segunda pele de menor folga. Em seguida, transfira seis mililitros da suspensão para um novo tubo Falcon de 50 mililitros e lave o homogeneizador de penas com 24 mililitros de tampão de dissecação de carvão, divida a suspensão em três tubos de falcão para obter o equivalente a um córtex por tubo. Em seguida, centrifugue a 1000 Gs por cinco minutos em temperatura ambiente.

A observação do pellet mostra um gradiente de cor rosa, que representa a parte dos microvasos dos córtices. Homogenato agora descarte o snat e homogeneize o pellet de um córtex com um mililitro de solução enzimática contendo uma mistura de colagenases dise, DNA tipo um e gentamicina. Coloque os tubos em uma coqueteleira por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, misture um mililitro de digestão com 10 mililitros de 25% B-S-A-H-B-S-S um X e subseqüentemente separe-os por centrifugação dependente da densidade a 3.600 Gs por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação dependente da densidade, o pellet contém os microvasos e o disco superior contém o parênquima cerebral de mielina e microvasos residuais. Transfira cuidadosamente o disco superior e o sobrenadante para tubos de falcão limpos de 50 mililitros.

Tome cuidado para não aspirar o grânulo de microvasos suavemente o vórtice do tubo e repita a centrifugação dependente da densidade durante a segunda centrifugação. Mantenha o pellet resultante contendo os microvasos a quatro graus Celsius. Após a segunda centrifugação dependente da densidade, rejeitar cuidadosamente o disco superior e a mistura de snat e ressuspender os pellets resultantes contendo os microvasos de ambas as centrifugações com um mililitro de HBSS frio um x.

Em seguida, lave os microvasos com 20 mililitros de hbss frio one x e centrifugue a 1000 Gs por cinco minutos. Em seguida, descarte o supranadante, tomando cuidado para não perder os microvasos. Pellet homogeneizar os microvasos pellet de um córtex com um mililitro da mesma solução enzimática seguindo um vórtice suave dos tubos.

Digerir ainda mais os microvasos por uma hora a 37 graus Celsius em um agitador. Depois disso, misture os microvasos digeridos dos três córtices em um tubo. Novamente, separe a mistura em dois tubos de falcão de 50 mililitros para obter os microvasos extraídos do equivalente a um córtice e meio por tubo.

Em seguida, centrifugue a 1000 Gs por cinco minutos. À temperatura ambiente, imediatamente antes de plaquear os microvasos, retirar dois frascos T 75 revestidos da incubadora e aspirar o excesso de revestimento. Descarte o snat e ressuspenda o pellet de microvasos em um mililitro de ECM, leve cada tubo a 10 mililitros com ECM suplementado com quatro microgramas por mililitro.

Pur micina para iniciar o processo de purificação e colocar os microvasos no balão. Em seguida, coloque os frascos na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para permitir a adesão dos microvasos à matriz de fibronectina de colágeno para seguir o processo de purificação. 24 horas após o plaqueamento dos microvasos, lave os restos celulares com ECM fresco e substitua os meios de cultura por ECM suplementados com quatro microgramas por mililitro de pur micina até o quinto dia na incubadora a 37 graus Celsius e 5% CO 2 24 horas após o plaqueamento dos microvasos, as células endoteliais começam a migrar e se espalhar na matriz de fibronectina de colágeno no quinto dia para terminar o processo de purificação, lavar os restos celulares com ECM fresco e substituir os meios de cultura por ECM suplementado com dois microgramas por mililitro.

Puram micina por mais três dias para proliferação. No oitavo dia, lave as células e adicione insulina transferrina e selenito de sódio. Suplementar aos meios de cultura até que as culturas atinjam 90% de confluência no dia 10.

No oitavo dia, prepare os filtros de três placas de 12 poços, revestindo-as com uma mistura de colágeno. Tipo quatro e fibronectina a 0,5 microgramas por centímetro quadrado em água de cultura estéril. Comece adicionando 1,5 mililitros de água de cultura estéril no compartimento inferior.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de mistura no compartimento superior. Deixar a matriz aderir a 37 graus Celsius até à semeadura das células endoteliais no mesmo dia, cinco dias antes do estabelecimento da cocultura. Descongele os astrócitos de frascos criogênicos a 37 graus Celsius e transfira as células para um tubo de falcão de 15 mililitros com 10 mililitros de centrífuga GCM.

A suspensão a 120 Gs durante oito minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet de astrócitos em GCM e placa a uma densidade de 30.000 células por centímetro quadrado. Nas placas de 12 poços, coloque as placas de 12 poços na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de CO2 no dia 10, pouco antes da dissociação do RBEC com a tripsina.

Lave o filtro pré-codificado com DMM F 12 médio, pré-encha as câmaras com ECM e coloque-as de volta na incubadora até a placa RBEC no mesmo dia. Lave o RBEC duas vezes com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicione quatro mililitros de solução quente de tripsina EDTA por frasco T 75 a 37 graus Celsius por exatamente 30 segundos e remova 3,5 mililitros de solução de tripsina EDTA.

Tomando cuidado para ter sempre uma camada de tripsina EDTA cobrindo as células endoteliais. Em seguida, siga o desprendimento das células por observação ao microscópio. Quando a camada celular começar a se desprender da matriz, bata suavemente na borda do frasco T 75 até que todas as células estejam flutuando.

Adicione três mililitros de ECM a cada frasco T 75 e transfira para um tubo de falcão de 50 mililitros. Repita esta etapa duas vezes. Lavando o meio para recuperar todas as células.

Dissocie muito suavemente a suspensão celular pipetando para cima e para baixo quatro vezes com uma pipeta de 10 mililitros equipada com uma ponta amarela. Contar as células da suspensão e colocá-las imediatamente nos filtros pré-codificados e pré-cheios a uma densidade elevada no dia seguinte. Troque o meio do compartimento superior duas vezes para remover os detritos celulares, a fim de evitar a ruptura da monocamada celular durante a substituição do meio.

Incline ligeiramente a placa e não se aproxime da pipeta de aspiração, deixando sempre algum meio acima da monocamada da célula da mesma forma, para evitar o ressecamento da monocamada da célula durante a substituição do meio. Lave apenas seis inserções de cada vez. 24 horas após o revestimento, a monocamada celular deve estar na confluência.

Então, no mesmo dia, um dia antes do estabelecimento da co-cultura, substitua os meios de cultura de astrócitos por 1,5 mililitros de meios de diferenciação suplementados no dia 12, que é definido como o primeiro dia de diferenciação. Substitua os meios de cultura dos filtros que contêm o RBEC por meios de diferenciação. Em seguida, transfira os filtros RBEC para os poços que contêm os astrócitos nessas condições.

Os modelos in vitro diferenciam e expressam proteínas relacionadas à junção em três dias e a diferenciação ideal dura mais três dias. Aqui, a monocamada celular foi imunomarcada com mentonte para revelar uma monocamada de células endoteliais cerebrais confluente com morfologia não sobreposta e as células fusiformes típicas com morfologia endotelial, bem como a expressão de proteínas de junção apertada em cinco ZO um e aperto de monocamada de oclusina no 12. Bem, o modelo BBB foi avaliado medindo o transporte de amarelo de Lúcifer.

Os resultados são expressos em permeabilidade ou PE em 10 a menos três centímetros por minuto, e a barreira é considerada permeável ou aberta quando o PE de LY está acima de 0,6 vezes 10 a menos três centímetros por minuto. Nas últimas décadas, muitas publicações e revisões forneceram informações sobre o modelo estático e dinâmico de BBB in vitro de diferentes espécies. No entanto, esses modelos permanecem difíceis de manusear e a reprodutibilidade da qualidade da barreira continua sendo um objetivo importante atrás.

Depois de assistir a este vídeo, os cientistas devem ter uma boa compreensão de como produzir e caracterizar um modelo in vitro do PBB.