用于研究模式豆科植物Medicago truncatula早期胚胎发育调控的合子胚与体细胞胚获取方案

以下实验方案的总体目标是展示如何获取不同发育阶段的大量玉兰胚，以研究植物胚胎发生的遗传调控机制。该目标可通过将豆荚形态与合子胚的不同发育阶段相对应，以及通过叶外植体培养获得各发育阶段的体细胞胚来实现。最终，可利用定量PCR和β-葡萄糖醛酸酶检测特定发育阶段胚胎发生过程中基因的表达水平。这些技术的优势在于体内实验无需对单个花朵进行标记，且体外实验流程经过优化，可提供互补的实验手段。

对培养过程进行可视化演示非常重要，因为它有助于更准确地观察操作细节。体内实验操作将由 Wang 演示，而体外实验操作将由 Kim Nolan 演示。为了促进合子胚胎的发育，需刺穿来自 Monte cargo 三目植物种子的种皮表面，并将种子完全浸没于水中过夜。

第二天，将三粒种子播种于盛有培养基质的10个直径15厘米的花盆中，每盆三粒，然后将花盆转移至玻璃温室。在14小时光照周期下培养植株，昼夜温度控制在23至19摄氏度之间；种子萌发后保留最健壮的幼苗，使每盆仅保留一株，并在幼苗周围设置支架，以便植株茎蔓在结荚时攀爬。按照表一和图一所述的适当发育阶段进行采样，以获得所需早期胚胎发育阶段的材料。

接下来，使用镊子从豆荚中分离胚体。或者，为了获得更精细的显微观察效果，可将材料完全置于霍耶尔溶液（Hoyer solution）中透明处理，然后在标准复式显微镜下观察胚胎，以确认胚胎发育阶段。随后，从豆荚中部区域收集实验所需的一定数量的体细胞胚（UL），并将其储存在适当的温度条件下，用于后续的体细胞胚胎发育分析。

从易于在培养中形成胚胎的拟南芥（tran atula）品种的伸长茎上，采集最新长出且接近完全展开的叶片。将叶片置于培养皿中湿润的纸巾上，以防止脱水。随后在经紫外灭菌的生物安全柜中操作，将叶片放入已高压灭菌的弹簧茶叶滤球的网状部分内。

将浸入式 infusion 器置于含 70% 乙醇的 250 毫升螺口瓶中，在高压灭菌器中处理。聚碳酸酯培养皿处理 30 秒后，沥干叶片组织，然后将 infusion 器浸入 1:8 稀释的次氯酸钠溶液中 10 分钟。期间偶尔轻轻旋转培养皿，轻柔摇晃，随后倒掉多余的液体。

然后冲洗萃取器，再用新容器中的新鲜去离子水冲洗一次。现在使用无菌镊子将茶叶从茶萃取器中转移至新鲜培养容器中，加入无菌去离子蒸馏水，并拧紧无菌瓶盖。

然后通过倒置并轻轻搅动来冲洗叶片。接着让小叶漂浮在无菌水表面，以便接种植体。使用无菌技术修剪单个已消毒小叶的边缘。

然后将剩余的矩形切成两到三块长8至10毫米、宽3至5毫米的矩形外植体，使每个外植体的中心保留主脉。每9厘米直径的培养皿中放置6块外植体，置于琼脂固化培养基上，外植体的ABA面朝下，以保持叶片的自然朝向。

然后用封口膜密封培养皿，并将平板置于28°C的恒温室内避光培养。三周后，使用无菌不锈钢刮铲和镊子将正在分化的孔状外植体转接到新鲜培养基上。约四周后应可观察到首批胚状体，此时愈伤组织开始形成，且其体积将超过图中所示最大外植体的尺寸。

继代培养至新鲜培养基时，仅转移50%的单个愈伤组织。最后，利用体视显微镜，在4至8周的培养期间内，根据实验目的收集不同胚胎发育阶段的材料，并对所获得的外植体进行相应处理。如上所述收获合子胚后，可在后续实验中采用双杂交或其他适当策略；特别值得关注的是，如图中所示，通过观察接种的X切面，可以清晰分辨SSIS与Spencer之间的差异。

在第四至第八周期间，可以找到处于特定阶段的体细胞胚并立即进行分析。例如，这些数据表明，在早期Olein阶段的胚胎会表达一种类型的medicago Tula eoin基因，但不会表达另一种。体细胞胚系统的一个特殊优势在于，可以在无需再生完整植株的情况下对愈伤组织进行转化。

事实上，正如本视频所示，β-葡萄糖醛酸酶可用于可视化胚胎发育不同阶段的基因表达。观看视频后，您应能充分掌握如何选择并解剖豆荚以获得胚胎。

还应充分掌握体细胞胚胎发生过程中无菌外植体的制备与接种方法，以及胚胎发育后的相关操作。这些技术手段使得研究人员能够深入探究胚胎发生早期阶段的转录调控机制，及其与胚胎生长发育和营养物质储存之间的关系。